GhROP6 通過調(diào)控茉莉酸合成與木質(zhì)素代謝參與棉花抗黃萎病反應(yīng)

周雪慧，高二林，王鈺靜，李焱龍，袁道軍，朱龍付

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)/ 作物遺傳改良國家重點(diǎn)實驗室，武漢 430070）

棉花 （Gossypium） 作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，是紡織品行業(yè)的重要原料來源，在各主產(chǎn)棉國家和地區(qū)的國民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位。 然而，棉花在生長過程中往往受到各種生物脅迫和非生物脅迫，如蟲害、病害、干旱等，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。 黃萎病是影響我國棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一，大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）是我國棉花黃萎病的主要致病菌[1]，也入侵馬鈴薯、辣椒、橄欖等多種糧食和經(jīng)濟(jì)作物[2]。 黃萎病導(dǎo)致植物葉片失綠黃化、維管束褐變，甚至整株壞死[3-4]。 但棉花抗黃萎病的分子機(jī)制仍不清楚。

小G 蛋白是具有鳥苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase,GTPase）活性的GTP 結(jié)合蛋白。根據(jù)功能的差異， 小G 蛋白可以劃分為5 個家族，即Ras、Rho、Rab、Ran 和Arf。 素有植物“分子開關(guān)” 之稱的Rho GTPase （Rho-related guanosine triphosphatase from plants,ROP）， 廣泛參與植物生長發(fā)育及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[5-6]。 高度保守的小G 蛋白有4 個GTP/GDP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和1 個與下游效應(yīng)蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[5,7-8]。 小G 蛋白活性由一些調(diào)控因子控制， 即鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor,GEF）、GTPase激活蛋白（GTPase-activating protein, GAP）以及鳥嘌呤核苷酸解離抑制劑（GDP dissociation inhibitor,GDI）等。GEF 與結(jié)合GDP 的GTPase形成低親和力復(fù)合物，在核苷酸裂解后，轉(zhuǎn)化為高親和力的無核苷酸復(fù)合物。GTP 的結(jié)合使復(fù)合物回到低親和狀態(tài)，GEF 被釋放， 生成激活態(tài)的GTPase。 激活狀態(tài)下的小G 蛋白與GAP 相互作用，促使ROP 失活[9-11]。 GDI 抑制GDP 與GTP 的交換，是ROP 活性的負(fù)調(diào)節(jié)因子[10]。小GTP 結(jié)合蛋白有組成型結(jié)合GDP 的非激活形式（dominant negative,DN） 突變體以及組成型結(jié)合GTP 的激活形式（constitutively active,CA）突變體[9-10]。 研究表明，ROP 的N 端第15 位甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸導(dǎo)致ROP 被鎖定在結(jié)合GTP 的組成型激活形式，即形成CA 突變體，第20 位蘇氨酸突變?yōu)楣劝滨０樊a(chǎn)生抑制GDP 結(jié)合的DN 突變體[10]。

研究證實ROP 參與包括調(diào)控花粉管生長、根毛生長、植物生長發(fā)育、響應(yīng)生物和非生物脅迫在內(nèi)的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[7,12-16]。 激活ROP2 可以促進(jìn)鹽脅迫下擬南芥（Arabidopsis thaliana）微管細(xì)胞的重新聚集及幼苗的存活[17]。 水稻（Oryza sativa） 中超表達(dá)OsRac1能增加粒寬和粒重，推測OsRac1 通過影響細(xì)胞分裂來調(diào)節(jié)水稻的粒寬和產(chǎn)量[18]。 激活OsRac1 還可增強(qiáng)水稻對細(xì)菌疫病和稻瘟病的抗性，影響相關(guān)防御基因的表達(dá)[16]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OsRac1 和轉(zhuǎn)錄激活因子RAI1 共同作用參與水稻對稻瘟病抗性[19]。超表達(dá)組成型StRac1顯著增加馬鈴薯細(xì)胞中過氧化氫含量， 增強(qiáng)馬鈴薯對晚疫病菌的抗性； 抑制StRac1表達(dá)則削弱馬鈴薯對晚疫病菌的抗性[20]。棉花Rac13 能激發(fā)活性氧 （reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，參與棉花次生壁形成過程，影響纖維品質(zhì)[21]。 目前，尚未見關(guān)于ROP 參與棉花抗病的報道。

前期棉花轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)Gh_A01G1392.1基因的編碼產(chǎn)物與擬南芥ROP6 高度同源， 抑制Gh_A01G1392.1的表達(dá)會削弱棉花對黃萎病的抗性。 本研究擬對棉花ROP家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析， 對Gh_A01G1392.1在棉花抗黃萎病中的功能進(jìn)行初步鑒定，為棉花抗黃萎病的分子育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試植物材料為陸地棉（G.hirsutum） 品系Jin668、擬南芥哥倫比亞生態(tài)型（Columbia-0）、本氏煙（Nicotiana benthamiana）。

1.2 基因克隆和生物信息學(xué)分析

從Cotton FGD（http://cottonfgd.org/）網(wǎng)站下載GhROP6（Gh_A01G1392.1）基因的全長序列，從Jin668 葉片中擴(kuò)增克隆GhROP6基因。

通過blast 獲得棉花基因組中所有ROP基因， 使用DNAMAN 軟件進(jìn)行序列相似性分析。利用MEGA 5 軟件對GhROP基因和AtROP基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，自展值（bootstrap value）設(shè)為1 000，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)值[22]。

根據(jù)陸地棉基因組信息找到每個基因在染色體上的位置， 利用Mapchart 軟件繪制GhROP基因的染色體分布圖。 從Cotton FGD 網(wǎng)站下載棉花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用MEV 軟件繪制熱圖，分析GhROP家族基因組織表達(dá)模式。

1.3 基因表達(dá)分析

取正常生長4 周的棉花幼苗根、莖、葉，開花期的花瓣、花藥、柱頭及開花當(dāng)天、開花后1 d（1 day post anthesis,1 DPA）、5 DPA 和10 DPA 的胚珠和纖維，迅速在液氮中冷凍，－70 ℃保存?zhèn)溆肹23]，用于分析GhROP6在棉花不同組織中表達(dá)水平。

利用Jin668 的4 周齡葉片，研究不同激素處理下GhROP6的表達(dá)變化。 分別用100 mmol·L－1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）和1 mmol·L－1水楊酸（salicylic acid,SA）噴施葉片，以清水作為對照（mock），于處理后0、1、3、6、12 h 取棉花根系并迅速在液氮中冷凍，－70 ℃保存?zhèn)溆肹23]。

采用異硫氰酸胍法[24]從Jin668 組織器官中提取總RNA，通過1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，參考Gao 等[23]方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板， 在ABI 7500 Real-Time PCR 儀（Applied Biosystems，美國）上進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time PCR,qRTPCR）， 程序為95 ℃5 min，95 ℃30 s、55～60 ℃30 s、72 ℃20 s、 擴(kuò) 增28 ～35 個 循 環(huán)， 以GhUBQ7（Gh_A11G0969.1）作為內(nèi)參基因，每個樣本設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。 所用引物及本研究中其他引物信息見附表1。

1.4 載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化

通過病毒介導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS） 試驗研究GhROP6基因功能。 參考Gao 等[23]的方法，利用煙草脆裂病毒（tobaccorattlevirus,TRV）VIGS 載體，擴(kuò)增GhROP6的保守片段，構(gòu)建包含TRV：GhROP6 載體、陰性對照空載體TRV：00、 陽性對照GhCLA1（Cloroplastos alterados 1） 載體TRV：GhCLA1 分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。 將農(nóng)桿菌重懸液分別注射到生長10 d 左右的棉花子葉， 對應(yīng)的植株分別記為TRV：GhROP，TRV：00 及TRV：CLA1，2 周后利用RT-PCR 檢測GhROP6基因的沉默效果。

在GhROP6突變位點(diǎn)設(shè)計2 對引物，進(jìn)行重疊PCR 分別獲得組成型激活的CA-GhROP6突變體序列和組成型非激活的DN-GhROP6突變體序列，將GhROP6及其2 個突變體序列分別構(gòu)建到超表達(dá)載體pMDC83， 并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。 通過葉片注射法[25]轉(zhuǎn)化煙草葉片，以注射含綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因的空載體作為對照。 侵染后48 h，取轉(zhuǎn)化煙草葉片在激光共聚焦顯微鏡（徠卡，德國）下觀察綠色熒光蛋白的分布情況，研究GhROP6 蛋白及其突變體的亞細(xì)胞定位。

利用蘸花法[27]將CA-GhROP6 和DN-GhROP6超表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥材料， 經(jīng)陽性篩選和表達(dá)量檢測選取T2植株進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.5 黃萎病抗性鑒定

棉花接種。VIGS 處理后15 d，選取長勢一致的棉花幼苗接種強(qiáng)致病力落葉型黃萎病菌V991，接種后7～10 d 觀察植株發(fā)病情況。 按植株黃萎病發(fā)生程度分為5 個病級[28]，根據(jù)Xu 等[29]方法統(tǒng)計接種后15 d 的病情指數(shù)并進(jìn)行真菌恢復(fù)培養(yǎng)試驗[28]。真菌恢復(fù)培養(yǎng)：將棉株莖段置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d 左右，觀察表型并拍照。 在接種V991 后24 h 取棉花葉片和根系、接種后16 d 取棉花根系迅速在液氮中冷凍，－70 ℃保存用于后續(xù)研究。

擬南芥接種實驗：擬南芥生長4 周左右開始接種黃萎病菌V991， 取接種后24 h 擬南芥葉片和根系、接種后18 d 的擬南芥根系迅速在液氮中冷凍，－70 ℃保存用于后續(xù)研究。

1.6 JA 含量測定及相關(guān)基因的表達(dá)

利用1.5 中接種V991 后24 h 的棉花和擬南芥葉片，參考Liu 等[30]方法提取和檢測茉莉酸-異亮氨酸（jasmonic acid-isoleucine,JA-Ile）含量。以1.5 中接種V991 后24 h 的棉花和擬南芥根系為材料，通過qRT-PCR 進(jìn)行JA 合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因的表達(dá)分析。

1.7 木質(zhì)素含量測定及相關(guān)基因的表達(dá)

取1.5 中接種后16 d 的棉花根系和接種后18 d 的擬南芥根系，參照Bubna 等[31]的巰基乙酸法測定木質(zhì)素含量（以鮮物質(zhì)質(zhì)量計）。 以1.5 中接種后24 h 的棉花和擬南芥根系為材料， 利用qRT-PCR 檢測木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖， 采用t檢驗分析處理與對照間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉ROP 基因家族成員鑒定及表達(dá)分析

根據(jù)擬南芥11 個AtROP 序列，通過序列比對和結(jié)構(gòu)分析， 在陸地棉中鑒定出28 個同源基因（附表2）。對擬南芥和陸地棉ROP 的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，Gh_A01G1392.1 與AtROP6 同源性最高（圖1A），相似性達(dá)到93.4%（附 圖1）， 將 其 編 碼 基 因 命 名 為GhROP6。GhROP6編碼區(qū)共597 bp，編碼198 個氨基酸殘基， 氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)GhROP 蛋白都含有ROP 結(jié)構(gòu)，包括4 個GTP/GDP 結(jié)合域、與下游靶蛋白結(jié)合的效應(yīng)域和碳末端的可變區(qū)域 （附圖2）。 染色體分布研究發(fā)現(xiàn)，24 個基因?qū)ΨQ分布在A 亞基因組和D 亞基因組，3 個基因特異性地分布在D 亞基因組，另外1 個基因分布在未分配染色體的scaffold 上（附圖3）。

根據(jù)棉花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對GhROP進(jìn)行組織表達(dá)模式分析，結(jié)果（圖1B）顯示，GhROP在胚珠、柱頭、開花后10 d 和20 d 的種子中表達(dá)量較高，在根、莖、花瓣、花藥和開花后20 d 的纖維中表達(dá)量較低；qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)GhROP6在花瓣、柱頭和開花后10 d 的纖維中高水平表達(dá)（圖2A），表明GhROP可能存在功能分化。 與清水對照相比，GhROP6的表達(dá)量在SA 處理1 h 后顯著下調(diào)，在MeJA 處理6 h、12 h 后顯著上調(diào)（圖2B），推測其可能參與JA 抗病信號通路的調(diào)控。

圖1 棉花ROP 基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析及轉(zhuǎn)錄水平分析Fig. 1Phylogenetic analysis and transcript level profiles of ROP genes in upland cotton

圖2 GhROP6 在不同器官和不同激素處理下的表達(dá)模式分析Fig. 2 Expression profile analysis of GhROP6 in cotton organs and different phytohormone treatments

2.2 GhROP6 的亞細(xì)胞定位分析

激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，GhROP6-GFP、CA-GhROP6-GFP 和DN-GhROP6-GFP 3 個 融 合蛋白的熒光均分布在煙草葉表皮細(xì)胞質(zhì)膜，單獨(dú)表達(dá)GFP 的對照處理熒光則分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中（圖3），這表明GhROP6 及其2 個突變蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)膜且其亞細(xì)胞定位不依賴于其活性。

圖3 GhROP6 及其突變型的亞細(xì)胞定位Fig. 3 Subcellular localization of GhROP6 and its mutants

2.3 抑制GhROP6 表達(dá)降低棉花對黃萎病抗性

注射后14 d，陽性對照TRV:CLA1 植株出現(xiàn)葉片白化表型， 表明VIGS 體系正常 （圖4A），RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)， 沉默棉花植株根中GhROP6的表達(dá)水平降低（圖4B）。 水處理后，GhROP6沉默植株植株與對照植株無明顯差異 （圖4C）；接種V991 后，GhROP6沉默植株萎蔫、黃化、發(fā)病、壞死的葉片比對照植株更多（圖4C），GhROP6沉默植株的病情指數(shù)極顯著高于對照植株 （圖4D）。 棉花剖稈試驗與真菌恢復(fù)培養(yǎng)可以看出，GhROP6沉默植株體內(nèi)病菌數(shù)量更多 （圖4E～F）。 上述結(jié)果表明，抑制GhROP6表達(dá)會削弱棉花對黃萎病的抗性。

圖4 抑制GhROP6 表達(dá)削弱棉花對黃萎病菌的抗性Fig. 4 Silencing of GhROP6 impairs cotton resistance to V. dahliae

圖5 JA 信號通路相關(guān)基因的表達(dá)量和JA-Ile 含量Fig. 5 The expression level of JA-related genes and JA-Ile content

對JA 信號通路相關(guān)基因的表達(dá)分析結(jié)果（圖5A～B）顯示：在接種V991 后24 h，對照植株根中參與JA 生物合成的GhLOX1、GhAOS1、GhAOS2、GhAOC1、GhOPR3-1、GhOPR3-3基 因以及參與JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的GhMYC2基因表達(dá)量均增加； 同樣，GhROP6沉默植株的GhLOX1、GhAOS1、GhAOS2、GhOPR3-1、GhOPR3-3以 及GhMYC2在接菌后的表達(dá)量均高于水處理植株，說明GhLOX1、GhAOS1、GhAOS2、GhOPR3-1、GhOPR3-3以及GhMYC2基因受黃萎病菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。 未接種黃萎病菌時，GhROP6沉默植株中參與JA 生物合成的基因GhLOX1、GhAOS1、GhAOS2、GhAOC1、GhOPR3-1、GhOPR3-3和參與JA 信號通路的基因GhMYC2的表達(dá)水平低于對照植株； 接種V991 后，GhROP6沉默植株中這些基因的表達(dá)水平均極顯著低于其在對照植株中的表達(dá)水平。 這些結(jié)果表明， 接種大麗輪枝菌會誘導(dǎo)棉花JA 信號通路相關(guān)基因的表達(dá)， 抑制GhROP6的表達(dá)會降低JA 信號通路相關(guān)基因表達(dá)量。 檢測結(jié)果（圖5C）表明，抑制GhROP6表達(dá)后植株中JA-Ile 含量極顯著降低。 這暗示GhROP6 可能參與棉花JA 合成及信號通路的調(diào)控，沉默GhROP6基因會抑制黃萎病菌誘導(dǎo)的JA 的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.4 抑制GhROP6 基因表達(dá)會減少木質(zhì)素的合成

對接種V991 后16 d 的棉花根中的木質(zhì)素含量測定結(jié)果（圖6A）表明，未接種V991 時，對照植株（TRV：00）和GhROP6沉默棉株（TRV：GhROP6） 木質(zhì)素含量無顯著差異； 接種V991后，對照植株和GhROP6沉默植株的木質(zhì)素含量均增加；但GhROP6沉默植株木質(zhì)素含量顯著低于對照植株。 棉花莖稈切片的組織化學(xué)染色結(jié)果（圖6B）顯示，GhROP6沉默植株染色較對照植株更淺。 基因表達(dá)量分析結(jié)果（圖6C）顯示：接種V991 后， 對照植株中參與木質(zhì)素合成的基 因GhCCR-1、GhF5H-1、GhCCoAOMT-2和GhCCoAOMT-3的表達(dá)量均增加，GhROP6沉默植株的GhCCR-1和GhF5H-1表達(dá)水平上調(diào)。未接種V991 時，GhROP6沉默植株植株中GhCCR-1、GhF5H-1、GhCCoAOMT-2和GhCCoAOMT-3等基因的表達(dá)水平低于對照植株，其中僅GhF5H-1的表達(dá)量與對照差異極顯著；接種V991 后，這4個基因在TRV：GhROP6 植株中的表達(dá)水平均極顯著低于對照植株。 這些結(jié)果表明，接種大麗輪枝菌會誘導(dǎo)棉花木質(zhì)素合成，沉默GhROP6的表達(dá)會抑制V991 誘導(dǎo)的木質(zhì)素合成和積累。

太原市君怡小區(qū)B座位于太原市平陽路與晉陽街交叉路口，地上32層，地下1層，采用剪力墻結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)的剪力墻結(jié)構(gòu)由于剛度大，地震作用下吸收能量多，且變形性能較差，結(jié)構(gòu)的耗能高，破壞嚴(yán)重。由于建筑功能的需要，常在剪力墻上開設(shè)門、窗以及結(jié)構(gòu)洞，形成了連肢剪力墻。連肢剪力墻又有兩種，一種為等肢，另一種為不等肢。在該工程中，不等肢剪力墻發(fā)揮著重要的作用，而連梁的強(qiáng)度、剛度以及變形性能對連肢剪力墻的抗震性能有很大的影響。本文運(yùn)用MIDAS/GEN研究該工程中連梁剛度對不等肢連肢梁抗震性能的影響。

圖6 木質(zhì)素含量及木質(zhì)素合成相關(guān)基因表達(dá)量Fig. 6 Lignin content and the expression level of genes-involved in lignin biosynthesis

2.5 GhROP6 在擬南芥中超表達(dá)增強(qiáng)其抗病性

在擬南芥中超表達(dá)CA-GhROP6和DNGhROP6（附圖4），經(jīng)轉(zhuǎn)基因陽性檢測和GhROP6表達(dá)量測定（附圖5），選取超表達(dá)CA-GhROP6的CA2、CA3 和 超 表 達(dá)DN-GhROP6的DN18、DN19 株系用于后續(xù)研究。接種黃萎病菌后，與野生型（wild type,WT）擬南芥相比，CA2、CA3 發(fā)病較輕、萎蔫葉片數(shù)量較少，病情指數(shù)低于野生型；而DN18 和DN19 的發(fā)病情況稍重，葉片萎蔫嚴(yán)重，病情指數(shù)更高（圖7A～B）。

基因表達(dá)分析表明，CA2 和CA3 中JA 信號通 路 相 關(guān) 基 因AtAOS1、AtAOC1、AtOPR3和AtMYC2表達(dá)水平均顯著高于WT、DN18 和DN19， 且CA2 和CA3 中JA-Ile 含量顯著高于WT、DN18 和DN19 （圖7C～D）。 與WT 相比，CA2 和CA3 中木質(zhì)素含量增加，且CA2 中木質(zhì)素含量顯著高于WT， 而DN18、DN19 中木質(zhì)素含量降低。 與WT 相比，CA2 和CA3 中木質(zhì)素合成相關(guān)基因AtPAL1、AtPAL2、AtC4H、AtF5H的表 達(dá) 水 平 升 高， 且CA2 中AtPAL1、AtPAL2、AtF5H表達(dá)水平顯著高于WT 中的表達(dá)水平，（圖7E ～F）。 這 些 結(jié) 果 說 明 組 成 型 激 活 的GhROP6 可以促進(jìn)擬南芥JA 合成與木質(zhì)素合成，提高JA-Ile 和木質(zhì)素含量，提升植株對黃萎病抗性。

圖7 超表達(dá)GhROP6 提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病性Fig. 7 Overexpression of GhROP6 enhances A. thaliana resistance to V. dahliae

3 討論

黃萎病是棉花生產(chǎn)中的主要病害，研究棉花與大麗輪枝菌互作的分子機(jī)理具有重要意義。 越來越多的研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素合成、SA 和JA 介導(dǎo)的抗病信號通路的相關(guān)基因在棉花抗黃萎病過程中發(fā)揮重要作用[22,32-34]。 在黃萎病菌侵染的棉花RNA 測序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)編碼小G 蛋白的ROP基因的表達(dá)水平有明顯變化[32]。 序列分析顯示該基因編碼產(chǎn)物在氨基酸水平與AtROP6 相似度高，因此，將其命名為GhROP6。 ROP 蛋白包含一個N 端催化G 結(jié)構(gòu)域用于核苷酸和效應(yīng)子結(jié)合，一個C 端的HVR 結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)亞細(xì)胞定位[9]。 研究報道CA-AtROP6 N 端融合GFP 的蛋白定位于質(zhì)膜，而DN-AtROP6 C端融合GFP的蛋白主要定位于核周區(qū)域[35]。 本研究發(fā)現(xiàn)GhROP6、CAGhROP6 和DN-GhROP6 與GFP 的融合蛋白均定位于煙葉表皮細(xì)胞的質(zhì)膜， 與OsRac1 在水稻原生質(zhì)體中的定位相似[16]。

通過VIGS 初步證實GhROP6在植物免疫中發(fā)揮重要作用。抑制GhROP6表達(dá)降低了植株抗性，暗示GhROP6 可能參與了棉花抗病性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 此外，獲得了超表達(dá)GhROP6的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，CA-GhROP6株系相比于WT 和DN株系更抗黃萎病，DN-GhROP6則在一定程度上抑制擬南芥黃萎病抗性。 這進(jìn)一步證明GhROP6參與了棉花抗黃萎病的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

JA 在植物對病原菌的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，利用MeJA 處理可提高擬南芥對多種病原菌的抗性[36]。 前人研究發(fā)現(xiàn)，沉默JA 信號通路中的負(fù)調(diào)控因子GhHDTF1 能激活JA 抗病信號通路，進(jìn)而增強(qiáng)棉花對黃萎病抗性[37]。 GhCPK33 是棉花黃萎病抗性的負(fù)調(diào)控因子，磷酸化GhOPR3導(dǎo)致其穩(wěn)定性降低，從而抑制JA 的合成[38]。ROP也與植物激素介導(dǎo)的免疫反應(yīng)密切相關(guān)。 超表達(dá)大麥ROP基因的CA-HvRAC1 植株對大麥白粉病的抗性增強(qiáng)[39]。AtROP6突變體內(nèi)SA 含量增加， 推測ROP6可能調(diào)控SA 信號通路影響擬南芥對白粉病的響應(yīng)過程[40]。也有研究報道ROP 為植物免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子。 在馬鈴薯中超表達(dá)擬南芥DN-ROP1會增強(qiáng)馬鈴薯對晚疫病的抗性。 在DN-AtROP1轉(zhuǎn)基因植株中，LOX的表達(dá)被顯著誘導(dǎo)， 說明AtROP1主要通過影響JA 信號通路負(fù)調(diào)控馬鈴薯對晚疫病抗性[41]。 在本研究中， 經(jīng)MeJA 處理后，GhROP6的表達(dá)量明顯上調(diào)， 經(jīng)SA 處理后，GhROP6的表達(dá)量略有降低，說明GhROP6主要響應(yīng)激素JA 的誘導(dǎo)。同時，接種V991 后，GhROP6沉 默 植 株JA-Ile 含 量、JA信號通路中相關(guān)基因的表達(dá)量均顯著低于對照植株， 表明抑制GhROP6的表達(dá)會削弱JA 合成及信號通路。 對接種V991 的轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行JA 含量和相關(guān)基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，CA 株系相比于WT 和DN 株系，JA-Ile 含量更高。綜合前人研究， 推測ROP作用于不同的病原菌可能會有不同的功能。

除植物激素外，木質(zhì)素作為機(jī)械屏障在植物抗性建立過程中是非常重要的[42-43]。 木質(zhì)素合成酶OsCCR1 是OsRac1 的 靶 標(biāo) 蛋 白，OsCCR1 與激活態(tài)的OsRac1 結(jié)合可控制木質(zhì)素的合成，進(jìn)而調(diào)節(jié)水稻防御反應(yīng)[44]。 在煙草中超表達(dá)小麥TaRac1能提高木質(zhì)素含量， 增強(qiáng)煙草對黑脛病和青枯病的抗性[45]。 本研究中， 接種V991 后，GhROP6沉默植株中木質(zhì)素含量低于對照，與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的GhCCR、GhCCoAOMT、GhF5H等基因的表達(dá)水平也有所下降。對接種后的擬南芥進(jìn)行木質(zhì)素含量以及木質(zhì)素信號通路相關(guān)基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)， 超表達(dá)CA-GhROP6擬南芥中木質(zhì)素含量高于野生型擬南芥和超表達(dá)DN-GhROP6的擬南芥的木質(zhì)素含量， 表明GhROP6參與木質(zhì)素生物合成調(diào)控， 但GhROP6調(diào)控JA 合成與木質(zhì)素代謝的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究鑒定了陸地棉中28 個ROP基因家族成員并克隆了GhROP6。 激素處理表明GhROP6基因可能響應(yīng)JA 抗病信號通路。 抑制GhROP6表達(dá)導(dǎo)致參與茉莉酸合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、木質(zhì)素抗病信號通路的相關(guān)基因表達(dá)水平顯著下降，降低棉花對黃萎病抗性、降低JA-Ile 和木質(zhì)素含量。 此外，在擬南芥中，超表達(dá)組成型激活的GhROP6 能增強(qiáng)擬南芥抗病性，提高JA-Ile 和木質(zhì)素含量，說明GhROP6 能通過調(diào)控JA 合成、JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和木質(zhì)素代謝參與棉花抗黃萎病反應(yīng)。

附件：

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附表1 本研究所用的引物序列

Table S1 List of primers used in this study

附表2 陸地棉中ROP基因基本信息

Table S2 The information ofROPgenes in upland cotton(Gossypium hirsutum)

附圖1 AtROP6 和GhROP6 氨基酸序列比對

Fig.S1 Sequence alignment analysis between AtROP6 and GhROP6

附圖2 陸地棉ROP 蛋白序列比對

Fig. S2 Sequences alignment of ROP proteins in upland cotton

附圖3GhROP基因的染色體分布

Fig.S3 ThechromosomedistributionofGhROPgenes

附圖4 GhROP6 與CA、DN 突變體氨基酸序列比對分析

Fig.S4 SequencealignmentanalysisbetweenGhROP6、CA and DN mutant

附圖5 不同轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中GhROP6基因表達(dá)分析

Fig.S5 Expression ofGhROP6in different transgenicArabidopsislines