生防菌NCD-2 菌株定量檢測體系的建立及其在棉花根際定植檢測中的應(yīng)用

蘇星，蘇振賀，宣立鋒，李社增，王培培，郭慶港，馬平*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，河北 保定 071000；2.河北省農(nóng)林科學院植物保護研究所/ 河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理中心/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北保定 071000；3.河北省農(nóng)林科學院石家莊果樹研究所，石家莊 050061）

由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、尖孢鐮刀菌萎蔫專化型 （Fusarium oxysporumf. sp.vasinfectum）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的棉花（Gossypium）土傳病害給棉花生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。 近年來，很多研究報道表明，利用微生物殺菌劑是防治作物土傳病害行之有效，且環(huán)境友好的措施之一[1-3]。 以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為代表的生防細菌之所以能夠在作物土傳病害防控中發(fā)揮作用，主要是因為這類生防菌能夠有效定植在寄主的根際土壤中，通過與病原菌進行營養(yǎng)競爭或空間位點競爭而降低病原菌的侵染，同時產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)有效抑制病原菌的生長[4-5]。 監(jiān)測外源生防菌在植物根際的定植情況，對于生防菌的合理、高效利用具有重要的指導(dǎo)價值。

土壤微生物常用的定量檢測方法主要包括菌落計數(shù)法、聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）法、免疫測定法、實時PCR 法等[6-7]。土壤中存在龐大的微生物群體，多種微生物具有相似的培養(yǎng)特性，因此，傳統(tǒng)的菌落計數(shù)法難以準確反映根際土壤中靶標微生物的數(shù)量。 免疫測定法適用于快速鑒定靶標微生物的存在，但無法對菌體數(shù)量進行定量分析[8]。 隨著PCR 技術(shù)的普及，PCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于土壤中微生物的鑒定和檢測[9]。 常規(guī)PCR 為在菌株水平上鑒定微生物提供了1 種準確的方法，但無法準確定量菌體數(shù)量[10-12]。 隨著實時PCR 技術(shù)的快速發(fā)展，該技術(shù)已被廣泛用于土壤微生物的定量檢測，具有省時、 省力、 高通量并能準確定量微生物的優(yōu)點[13-14]。王川等[15]建立了靈敏、高效的實時PCR 快速檢測體系， 在盆栽條件下檢測了馬鈴薯（Solanum tuberosum）黑痣病的生防菌QHZ11 在馬鈴薯根際土壤中的定植情況，結(jié)果表明，在接種后60 d 時QHZ11 菌株在土壤中定植量達到峰值。 Sa 等[16]利用實時PCR 技術(shù)對枯草芽孢桿菌菌株N6-34 進行了定量檢測， 發(fā)現(xiàn)其在楊樹（Populus）植株及根際土壤中的定植量呈先增加后穩(wěn)定再逐漸降低的趨勢。

枯草芽孢桿菌NCD-2 菌株能有效防治棉花黃萎病和棉花立枯病，以該菌株為主要活性成分的微生物殺菌劑“10 億活芽孢/ 克枯草芽孢桿菌可濕性粉劑” 已于2006 年獲得農(nóng)藥注冊登記[17]。前期研究表明， 生防菌NCD-2 菌株對棉花立枯病的防治效果和NCD-2 菌株的生物膜產(chǎn)生能力呈正相關(guān)[18]。目前已獲得NCD-2 菌株全基因組序列（GenBank ID：CP023755.1）。 本研究設(shè)計了NCD-2 菌株的特異性引物， 進一步構(gòu)建了NCD-2 菌株的實時PCR 定量檢測技術(shù)， 并定量檢測了NCD-2 菌株在棉花根際的定植動態(tài)，同時也檢測了NCD-2 菌株在防治棉花立枯病時的根際定植數(shù)量， 以期為NCD-2 菌株在寄主根際的定植情況提供直接證據(jù)， 為高效使用NCD-2菌株提供科學指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基：5 g·L－1酵母提取物、10 g·L－1胰蛋白胨、5 g·L－1NaCl， 調(diào)pH至7.0。

LB 固體培養(yǎng)基：5 g·L－1酵母提取物、10 g·L－1胰蛋白胨、5 g·L－1NaCl，15 g·L－1瓊脂，調(diào)pH至7.0。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （potato dextrose agar,PDA）：200 g·L－1馬鈴薯（浸出液）、20 g·L－1葡萄糖、15 g·L－1瓊脂。

立枯絲核菌選擇性培養(yǎng)基：K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 10 mg、NaNO20.2 g、氯霉素0.05 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。 制備完成后于121 ℃滅菌20 min，在培養(yǎng)基冷卻到50～55 ℃時加入0.1 g·L－1鏈霉素、0.035 g·L－1孟加拉紅、0.08 g·L－1甲霜靈和0.007 g·L－1咪鮮胺。

1.2 供試菌株與培養(yǎng)條件

本研究所用細菌菌株見表1 和表2。 細菌菌株于－80 ℃長期保存，使用前在LB 培養(yǎng)基上活化。 立枯絲核菌菌株AG-4 由河北省農(nóng)林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室保存，使用前在PDA 培養(yǎng)基上活化。

1.3 DNA 提取

利用天根生化科技（北京）有限公司細菌DNA 提取試劑盒進行細菌DNA 的提取， 利用FastDNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals,LLC，美國）提取土壤總DNA，具體提取步驟按照說明書操作。 利用NanoDrop 2000（Nano Drop Technologies，美國）測定所提取DNA 的質(zhì)量濃度。

1.4 NCD-2 菌株實時PCR 檢測體系中特異性引物的設(shè)計與驗證

從NCBI（http://ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中下載11 株芽孢桿菌標準菌株B. subtilis168、B. subtilisBSn5、B. subtilisRO-NN-1、B. subtilissubsp.spizizeniiW23、B. subtilissub sp.spizizeniiTU-B-10、B.velezensisFZB42、B.amyloliquefaciensDSM7、B. licheniformisATCC14580、B. pumilusSAFR-032、B. atrophaeus1942 及B. thuringiensisATCC10792 的基因組序列， 利用BLAST+ 軟件將NCD-2 菌株的全基因組序列與標準菌株的全基因組序列進行序列比對， 獲得NCD-2 菌株的特異性基因序列。 根據(jù)特異性基因序列， 利用Primer 5.0 軟件設(shè)計針對NCD-2 菌株的特異性引物。 在NCBI 網(wǎng)站上初步分析該引物的特異性， 然后利用普通PCR 技術(shù)優(yōu)化引物的擴增條件， 并利用22 株芽孢桿菌野生型菌株進行引物特異性檢測。

1.5 NCD-2 菌株實時PCR 體系的特異性檢驗

利用實時PCR 技術(shù)驗證NCD-2 菌株引物的特異性。 以NCD-2 菌株DNA 為陽性對照，以20株芽孢桿菌參考菌株DNA（表1）和22 株芽孢桿菌野生型菌株DNA（表2）為陰性對照，以無菌水為空白對照， 同時檢測土壤總DNA 以及土壤中加入NCD-2 菌株后所提取的DNA 的擴增結(jié)果。實時PCR 所用儀器為ABI Step OneTM（Applied Biosystems Inc，美國），反應(yīng)體系25 μL，其中包含SYBR Green real-time PCR Mix（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）10 μL，上下游引物（10 μmol·L－1）各2 μL，模板DNA 約1 ng，用雙蒸水補足至25 μL。 反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃10 s，62 ℃15 s，72 ℃10 s，40 個循環(huán)； 以0.1 ℃·s－1的速度從65 ℃遞增到95 ℃，在每一循環(huán)的退火階段采集熒光，實時監(jiān)測熒光信號的變化，得出擴增產(chǎn)物的熔解曲線。

表1 本研究所用標準型芽孢桿菌菌株Table 1 Standard Bacillus strains used in this study

表2 野生型芽孢桿菌菌株phoR、gyrB 和16S rDNA 登錄號Table 2 The accession numbers of phoR, gyrB and 16S rDNA of wild type Bacillus strains

1.6 NCD-2 菌株實時PCR 檢測體系的靈敏性檢驗

將NCD-2 菌株DNA 以10 倍為梯度稀釋至質(zhì)量濃度為0.8 μg·L－1～8.0 mg·L－1，取2 μL DNA 稀釋液為模板進行實時PCR 擴增。以DNA質(zhì)量濃度（ρDNA）以10 為底的對數(shù)（lgρDNA）為橫坐標，以檢測的循環(huán)閾值（Cycle threshold,Ct）為縱坐標，繪制標準曲線，計算擴增效率（EP＝101/k－1，k為標準曲線斜率）， 檢測實時PCR 體系的靈敏性。 每個質(zhì)量濃度設(shè)3 次重復(fù)。

為了檢測土壤中的抑制因子對實時PCR 檢測的影響， 從出苗2 周的棉苗根部切下200 mg附有根際土壤的根，將其置于裝有10 mL 無菌水的離心管中， 并加入NCD-2 菌株使根中NCD-2菌株的有效活菌數(shù)（以下簡稱為“含量”）分別為5×103、5×104、5×105、5×106和5×107g－1。將離心管置于超聲波 （90 W） 中超聲處理1 min，10 000 r·min－1下離心30 min 收集沉淀物。 利用土壤DNA 提取試劑盒提取沉淀物中總DNA。 取2 μL DNA 為模板進行實時PCR 擴增，對照樣品中不添加NCD-2 菌株。設(shè)3 次重復(fù)。以提取的土壤總DNA 質(zhì)量濃度（ρDNA）以10 為底的對數(shù)（lgρDNA）為橫坐標，以Ct 值為縱坐標，繪制標準曲線，計算擴增效率，檢測土壤中抑制因子對擴增效率的影響。

1.7 NCD-2 菌株在棉花根際土中定植能力的檢測

NCD-2 菌株于200 mL LB 液體培養(yǎng)基中30 ℃、160 r·min－1震蕩培養(yǎng)48 h，12 000 r·min－1下離心30 min 收集菌體，用無菌水調(diào)節(jié)菌液菌體含量至109mL－1。將表面消毒的冀棉11 種子于25 ℃過夜催芽，挑選露白的棉種在100 mL 菌懸液中浸泡30 min，然后播種于滅菌土壤中，置于25～28 ℃溫室中培養(yǎng)，光照為自然光，定期澆水，以無菌水浸泡的棉籽為對照，每個處理48 株，每個處理進行3 次重復(fù)。播種后8 d 和16 d，從不同處理的棉苗中各隨機取9 株并用力抖落附著在棉苗根部的土壤，收集棉苗根際土壤，充分混勻后取250 mg 風干土壤利用土壤DNA 提取試劑盒提取DNA。利用NCD-2 菌株特異性引物，以提取的土壤總DNA 為模板，利用實時PCR 技術(shù)檢測NCD-2 菌株在棉花根際的定植數(shù)量。 同時利用菌落計數(shù)法檢測NCD-2 菌株在棉花根際的定植數(shù)量。 取250 mg 根際土壤懸浮于30 mL 0.9%（質(zhì)量分數(shù)）NaCl 溶液中，充分混勻后進行10 倍系列稀釋，取100 μL 稀釋液涂布在LB 培養(yǎng)基上，51 ℃培養(yǎng)12 h 后， 記錄菌落數(shù)量， 挑取與NCD-2 菌株表型相似的菌落用NCD-2 菌株特異性引物進行PCR 擴增， 根據(jù)陽性菌落數(shù)占總菌落數(shù)的比值計算NCD-2 菌株的數(shù)量。

1.8 NCD-2 菌株對棉花立枯病的防治效果及對根際立枯絲核菌定植數(shù)量的影響

將立枯絲核菌接種于PDA 培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗培養(yǎng)7～10 d， 收集菌絲并將菌絲打碎與自然土按一定比例（土壤、蛭石、菌絲質(zhì)量比為2.0∶1.0∶0.1）充分混勻，制備含有病原菌的土壤。 將露白的鄂荊一號棉籽在NCD-2 菌懸液（109mL－1）中浸泡30 min，播種于含有病原菌的土壤中，以清水處理的棉種為對照。 每個處理48株，3 次重復(fù)。 播種后置于溫室中培養(yǎng)，溫度25～28 ℃，光照為自然光，定期澆水。 播種后16 d 取棉苗根際土壤， 檢測根際立枯絲核菌及NCD-2菌株的數(shù)量。 取200 mg 根際土置于裝有20 mL無菌水的錐形瓶中， 充分混勻后進行系列稀釋，取100 μL 稀釋液涂布在立枯絲核菌選擇性培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h， 根據(jù)立枯絲核菌的菌落形態(tài)統(tǒng)計立枯絲核菌的菌落數(shù)[19]。取根際土250 mg，利用土壤DNA 提取試劑盒提取總DNA， 使用NCD-2 菌株特異性引物通過實時PCR 分析根際NCD-2 菌株的含量。

播種后16 d，調(diào)查NCD-2 菌液處理和清水對照的棉花死苗數(shù)，計算防治效果（E）。公式：E（%）＝（N0－N1）/N0×100%。 式中，N0為清水對照處理的死苗數(shù)，N1為NCD-2 菌株處理的死苗數(shù)。

1.9 統(tǒng)計分析

菌落數(shù)以實際計數(shù)以10 為底的對數(shù)來表示。 利用SAS for Windows Ver 9.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析（P≤0.05），利用Origin 7.0 對試驗數(shù)據(jù)進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCD-2 菌株實時PCR 檢測體系特異性引物設(shè)計

將NCD-2 菌株全基因組序列與其他11 株芽孢桿菌標準菌株的全基因組序列進行序列比對，發(fā)現(xiàn)NCD-2 菌株中存在1 個特異性基因簇，該基因簇位于gabp和yeaB基因之間（圖1），全長8 883 bp，含有8 個開放閱讀框（open reading frame,ORF）。其中ORF7 的序列與枯草芽孢桿菌UD1022 菌株（美國，CP011534.1）基因組序列同源性為99%， 與貝萊斯芽孢桿菌 （B.velezensisRD7-7）菌株（韓國，CP016913.1）基因組序列同源性為93%， 與芽孢桿菌SDLI1 菌株 （美國，CP013950.1）序列同源性為91%。 根據(jù)ORF7 的序列，設(shè)計針對NCD-2 菌株的特異性引物qNCDORF7-F：5'-AGGCAGCATTCAAGCACCAG-3'，qNCD-ORF7-R：5'-AGCCAGCGATCATTCCCATC-3'。 引物特異性檢測發(fā)現(xiàn)，該引物與UD1022菌株序列一致，但該特異性引物仍可在一定區(qū)域內(nèi)開展NCD-2 菌株的定量檢測。

圖1 NCD-2 菌株特異性基因簇示意圖Fig. 1 Schematic diagram of strain NCD-2 specific gene cluster

2.2 NCD-2 菌株實時PCR 檢測體系特異性檢測

通過常規(guī)PCR 技術(shù)檢測引物對NCD-2 菌株的特異性，結(jié)果（圖2）表明，以qNCD-ORF7-F/qNCD-ORF7-R 為引物， 以NCD-2 菌株DNA以及加入NCD-2 菌株的土壤總DNA 為模板，能特異性地擴增出目的片段， 而以其他22 株野生型芽孢桿菌菌株DNA 以及土壤總DNA 為模板，不能擴增出目的片段。 進一步通過實時PCR 技術(shù)檢測引物qNCD-ORF7-F/qNCD-ORF7-R 對NCD-2 菌株的特異性， 熔解曲線結(jié)果 （圖3）表明， 以NCD-2 菌株DNA 以及加入NCD-2 菌株的土壤總DNA 為模板，在81.4 ℃出現(xiàn)特異性的熔解曲線峰， 而以其他22 株野生型芽孢桿菌菌株DNA、20 株芽孢桿菌參考菌株DNA 以及土壤總DNA 為模板，未出現(xiàn)熔解曲線峰。以上結(jié)果表明，引物qNCD-ORF7-F/qNCD-ORF7-R 對NCD-2菌株具有較高的特異性， 以該引物構(gòu)建的實時PCR 體系可用于定量檢測NCD-2 菌株。

圖2 NCD-2 菌株引物特異性檢測Fig. 2 Detection of strain NCD-2 by strain specific primers

圖3 實時熒光PCR 熔解曲線圖Fig. 3 Dissolution curve of real-time PCR

2.3 NCD-2 菌株實時PCR 檢測體系標準曲線的建立

以NCD-2 菌株DNA 作為模板， 利用實時PCR 體系構(gòu)建標準曲線，結(jié)果（圖4）顯示，模板質(zhì)量濃度在0.8 μg·L－1～8.0 mg·L－1范圍內(nèi)與Ct值呈線性關(guān)系（r＝0.995）。 土壤中定量加入不同含量的NCD-2 菌株后，以提取的土壤總DNA 為模板，構(gòu)建標準曲線，結(jié)果（圖4）顯示，土壤中NCD-2 菌體含量在5×103～5×107g－1范圍內(nèi)，菌體含量與Ct 值呈良好的線性關(guān)系（r＝0.995），表明土壤DNA 對NCD-2 菌株的定量檢測結(jié)果沒有顯著影響。 因此，該方法可用于定量檢測土壤樣品中NCD-2 菌株的數(shù)量。

圖4 實時PCR 標準曲線Fig. 4 Standard curve of real-time PCR

2.4 NCD-2 菌株實時PCR 檢測體系對其在棉花根際土壤中定植能力的檢測結(jié)果

實時PCR 檢測結(jié)果（圖5）表明，播種后8 d和16 d 時，NCD-2 菌株在棉花根際土壤中的菌體含量分別為1.14×105和9.5×104g－1。 菌落計數(shù)法檢測結(jié)果（圖5）顯示，播種后8 d 和16 d 時，NCD-2 菌株在棉花根際土壤的菌體含量分別為2.15×105g－1和2.45×105g－1。 通過2 種方法檢測NCD-2 菌株在棉花根際的定植數(shù)量具有較高的相關(guān)性， 在8 d 時2 種方法檢測的相關(guān)系數(shù)為0.99，在16 d 時兩者相關(guān)系數(shù)為0.95。

圖5 實時PCR 和菌落計數(shù)法對棉花根際土壤中NCD-2 菌株的定量檢測Fig.5 The population of Bacillus subtilis strain NCD-2 in cotton rhizosphere soil detected by real-time PCR and colony counting method

棉花立枯病調(diào)查結(jié)果（表3）表明，109mL－1的NCD-2 菌液浸種處理在播種后16 d 時對棉花立枯病的防治效果達到67.9%；此時NCD-2 菌株在棉花根際土壤的菌體含量為7.6×105g－1，棉花立枯絲核菌在根際土壤中含量為416 g－1，而對照中立枯絲核菌在棉花根際土壤中的含量為3 011 g－1。

表3 NCD-2 菌株對棉花立枯病的防治效果及其與棉花立枯絲核菌在棉花根際土壤中的含量Table 3 Control effect of NCD-2 strain on cotton damping-off and contents of NCD-2 strain and Rhizoctonia solani in cotton rhizosphere soil

3 討論

定量檢測生防微生物在田間的消長動態(tài)不僅有助于研究生防菌的防病效果，同時也是評價生防菌環(huán)境安全性的重要指標[19]。 以往常利用抗生素馴化技術(shù)獲得抗生素抗性菌株，然后根據(jù)抗生素篩選以定量檢測特定微生物在環(huán)境中的數(shù)量[20]?？剐跃暝诃h(huán)境中容易喪失抗性，加上其他抗性微生物的干擾， 往往造成檢測結(jié)果不準確[20-21]。 近年來，實時PCR 已被廣泛應(yīng)用于土壤中真菌[22]、細菌[23]、病毒[24]的定量檢測。 獲得針對靶標微生物的特異性引物或探針是建立基于實時PCR 技術(shù)定量檢測的關(guān)鍵， 目前針對病原菌建立的定量檢測體系較多，但針對特定生防菌株建立的實時PCR 定量檢測體系較少， 主要原因是缺乏針對單個菌株的特異性引物[25]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，獲得了越來越多的微生物全基因組序列。 通過全基因組序列比對，獲得某個菌株特異性基因序列，據(jù)此設(shè)計針對特定菌株的特異性引物已成為可能。 Zhang等[26]通過對木霉菌（Trichoderma guizhouense）NJAU4742 設(shè)計特異性引物，建立實時PCR 檢測體系監(jiān)測菌株在土壤中的定植動態(tài)。 枯草芽孢桿菌是一類重要的生防細菌，目前超過350 株芽孢桿菌獲得全基因組序列。 本研究通過將生防枯草芽孢桿菌NCD-2 菌株全基因組序列與已知枯草芽孢桿菌類細菌全基因組序列進行比對， 發(fā)現(xiàn)NCD-2 菌株中有1 個功能未知且特異性較強的基因簇， 根據(jù)該基因簇序列設(shè)計了針對NCD-2菌株的特異性引物， 建立了定量檢測NCD-2 菌株的檢測體系， 并開展了NCD-2 菌株在棉花根際的定植動態(tài)檢測。 然而，隨著數(shù)據(jù)庫中提交的微生物全基因組序列越來越多，可能會發(fā)現(xiàn)不同地理起源的菌株具有相似或一致的基因序列。 通過GenBank 數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，本研究中獲得的特異性基因簇， 與美國起源的枯草芽孢桿菌UD1022 菌株同源性非常高（99%），可能會影響NCD-2 菌株的定量檢測。 但是，如果類似菌株相隔很遠，或者在不同地域范圍進行檢測，這種相對特異的基因序列仍然可用于菌株特異性引物的開發(fā)，實現(xiàn)對一定區(qū)域內(nèi)靶標微生物的檢測。

土壤中含有豐富的有機酸和腐殖酸， 盡管目前土壤總DNA 提取試劑盒可最大限度地排除土壤中的有機物， 但殘存的腐殖酸仍然會抑制PCR 的擴增效率[27-28]。 本研究建立了2 條標準曲線， 一條是以純化的NCD-2 菌株DNA 為模板，另外一條是將系列稀釋的NCD-2 菌液添加到土壤中，然后提取土壤總DNA，系列稀釋后作為模板建立的標準曲線。 通過比較這2 條標準曲線， 發(fā)現(xiàn)土壤中的抑制因子的確降低了PCR 的擴增效率。 本研究通過菌落計數(shù)法和實時PCR 技術(shù)分析了棉花根際NCD-2 的數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實時PCR 法檢測的菌群數(shù)量低于菌落計數(shù)法得到的結(jié)果， 推測是由于土壤中的有機物抑制PCR 擴增效率造成的[29]，這與任海英等[30]的研究結(jié)果一致。 但由于實時PCR 技術(shù)和菌落計數(shù)法檢測結(jié)果具有較高的相關(guān)性， 而且實時PCR 技術(shù)具有準確且檢測迅速等優(yōu)勢，因此， 實時PCR 技術(shù)可用于NCD-2 菌株的定量檢測及實際應(yīng)用。

生防菌防治作物土傳病害的機理包括抑菌作用、競爭作用和誘導(dǎo)抗性，其中通過競爭作用有效定植在寄主根際并抑制根際病原菌的生長是生防菌防治土傳病害的重要作用機理。 Samaras等[31]通過共聚焦激光掃描顯微鏡發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌MBI600 能夠定植在黃瓜（Cucumis sativus）的根際，定性分析認為該菌株的根際定植能有效防治由尖孢鐮刀菌和腐霉菌（Pythium aphanidermatum）引起的枯萎病和根腐病。本研究前期工作發(fā)現(xiàn)， 喪失生物膜形成能力的NCD-2 菌株突變體在棉花根際的定植能力下降，同時對棉花立枯病的防治效果也顯著下降， 間接證明NCD-2 菌株的根際定植能力與其對棉花立枯病的防效呈正相關(guān)。 本研究通過實時PCR 技術(shù)可準確檢測NCD-2 菌株在棉花根際的實際定植情況，不但可以評估NCD-2 菌株在寄主根際的有效定植數(shù)量， 而且可用于棉花病害防治中NCD-2 菌株和病原菌相互關(guān)系的研究。

4 結(jié)論

通過獲得枯草芽孢桿菌NCD-2 菌株的特異性引物， 建立了基于實時PCR 技術(shù)的NCD-2 菌株檢測體系， 利用該技術(shù)能夠快速準確檢測NCD-2 菌株在棉花根際的數(shù)量，明確其在棉花根際土壤中的實際定植能力，為檢測該菌株防治作物土傳病害的效果提供科學依據(jù)。