• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    三烏膠提取物水凝膠的制備及其對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療作用研究

    2022-07-07 09:22:40肖素蕓羅才琴王承瀟崔秀明
    中草藥 2022年13期
    關(guān)鍵詞:指標(biāo)性批號(hào)經(jīng)皮

    肖素蕓,羅才琴,呂 冬,王承瀟,崔秀明, 3*

    ·藥劑與工藝·

    三烏膠提取物水凝膠的制備及其對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療作用研究

    肖素蕓1, 2,羅才琴1, 2,呂 冬1, 2,王承瀟1, 2,崔秀明1, 2, 3*

    1. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650500 2. 云南省三七資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650500 3. 國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系昆明綜合試驗(yàn)站,云南 昆明 650500

    制備三烏膠提取物水凝膠并進(jìn)行表征及考察其對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用。采用Franz池法考察三烏膠提取物中二苯乙烯苷、苯甲酰新烏頭堿、8-去乙酰滇烏堿、去乙酰粗莖烏頭堿甲、草烏甲素和大黃素的體外滲透效果,制備出三烏膠提取物水凝膠并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行表征;同時(shí),建立膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced rheumatoid arthritis,CIA)大鼠模型,研究經(jīng)皮遞送模式下三烏膠提取物對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用。制備的三烏膠提取物水凝膠在常規(guī)情況下始終保持凝膠狀態(tài);并且其三維交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可使藥物更好的持續(xù)性地釋放,從而達(dá)到緩釋效果。體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)表明,三烏膠提取物水凝膠顯著降低CIA大鼠的足厚度、足體積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)水平和血清中類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)和B細(xì)胞淋巴瘤因子-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的水平及升高Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)水平;與口服相比,水凝膠能降低谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、肌酐和尿素氮水平和臟器病變程度。采用經(jīng)皮遞送的局部給藥模式,三烏膠提取物在保留治療作用的同時(shí)降低了由于口服給藥引起的臟器毒性,為今后三烏膠提取物外用制劑的研究提供了可能性。

    三烏膠提取物;水凝膠;經(jīng)皮藥物遞送;體外滲透;類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;生物毒性;二苯乙烯苷;苯甲酰新烏頭堿;8-去乙酰滇烏堿;去乙酰粗莖烏頭堿甲;草烏甲素;大黃素;類風(fēng)濕因子;C反應(yīng)蛋白;B細(xì)胞淋巴瘤因子-2;Bcl-2相關(guān)X蛋白;谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶;丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶;肌酐;尿素氮

    類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以滑膜增生和慢性炎癥為特征的慢性全身性自身免疫性疾病[1]。RA的主要癥狀是炎癥、關(guān)節(jié)腫脹、伴隨關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性損傷,甚至功能障礙[2-4]。目前臨床上RA的主要治療藥物是疾病修飾抗風(fēng)濕藥物(disease modifying antirheumatic drugs,DMARDs),但是副作用較為明顯,長(zhǎng)期或大劑量服用會(huì)損傷胃腸道和產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng),甚至肝腎功能異常和骨髓抑制[5-6],因此,開(kāi)發(fā)抗RA的天然藥物尤為重要。

    臨床上常用烏頭類中藥及炮制品治療風(fēng)濕類疾病。三烏膠丸是云南黑藥的代表品種之一,由黃草烏Kom、川烏Debx.、何首烏Thunb、附片(黑順片)Debx和白附子Engl組成;其主要用于風(fēng)寒濕邪、風(fēng)痰、瘀血引起的風(fēng)濕麻木、中風(fēng)偏癱、口眼歪斜及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、RA等[7-8]。有關(guān)研究表明,三烏膠丸中烏頭堿類成分能夠影響細(xì)胞的增殖和凋亡,且具有免疫調(diào)節(jié)特性,可能是治療自身免疫性疾病的潛在有效藥物[9-10],但其原料藥對(duì)臟器具有毒性作用[11-13]。因此,為提高三烏膠丸用藥安全性,對(duì)其傳統(tǒng)口服給藥治療方式進(jìn)行改良,針對(duì)其局部病癥的特點(diǎn),尋找一種能維持血藥濃度相對(duì)穩(wěn)定的給藥方式具有重要意義。

    經(jīng)皮給藥系統(tǒng)(transdermal drug delivery,TDDS)具有避免肝腸首過(guò)效應(yīng)、提高用藥安全、提高患者依從性和維持血藥濃度穩(wěn)定性等特點(diǎn),其中新型載體水凝膠不僅能夠滿足三烏膠提取物的給藥需求,而且能增加水難溶性藥物的溶解度,其交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能延長(zhǎng)藥物滯留時(shí)間,從而達(dá)到緩釋作用[14-15]。據(jù)此,本研究首先考察了三烏膠提取物中6種指標(biāo)性成分的體外滲透能力,以皮膚透過(guò)量為指標(biāo),對(duì)三烏膠提取物溶劑種類和促滲劑用量進(jìn)行篩選;基于此,制備三烏膠提取物水凝膠并對(duì)其進(jìn)行表征,同時(shí)采用膠原誘導(dǎo)型RA大鼠為模型,進(jìn)一步評(píng)估三烏膠提取物水凝膠經(jīng)皮遞送對(duì)RA的治療效果和生物毒性,為三烏膠丸后續(xù)深入研究提供新的研究思路和策略。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    LC-2030Plus型高效液相色譜儀,日本島津公司;梅特勒AL-104型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ5200E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;RYJ-12B型Franz擴(kuò)散試驗(yàn)儀,上海黃海藥檢儀器有限公司;UPT-I-20T型優(yōu)普系列超純水器,成都超純科技有限公司;RCT基型磁力攪拌加熱器,德國(guó)艾卡有限公司;SM600型酶標(biāo)儀,上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司;DMO-412型低速離心機(jī),美國(guó)Scilogex公司;SU8100型掃描電子顯微鏡(SEM),日本Hitachi公司。

    1.2 藥品與試劑

    三烏膠提取物是參照云南金烏黑藥制藥有限公司優(yōu)化后的煎煮制備流程,并按照三烏膠丸處方比例,將9 g黃草烏、6 g川烏、1.5 g黑順片、4.5 g何首烏和3 g生白附子提取制備成干浸膏,相當(dāng)于原生藥1.71 g/g;對(duì)照品二苯乙烯苷(2,3,5,4′- tetrahydroxy stilbene 2--β--glucoside,TSG,批號(hào)Yz021521)、苯甲酰新烏頭堿(benzoylmesaconine,BMA,批號(hào)wkq20041701)、8-去乙酰滇烏堿(8- deacetylyunaconitine,8-DCA,批號(hào)Yz0201221)、草烏甲素(crassicauline A,批號(hào)Yz042122)、大黃素(emodin,批號(hào)Yz080920),質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%,購(gòu)自南京源植生物科技有限公司;對(duì)照品去乙酰粗莖烏頭堿甲(sinapic acid crassicauline,SAC,批號(hào)19112201),質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%,購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;二甲基甲酰胺(,- dimethylformamide,DMF,批號(hào)D111999)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,批號(hào)),均購(gòu)自上海百舜生物科技有限公司;聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG),批號(hào)8598479,購(gòu)自武漢卡諾斯科技有限公司;聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP),批號(hào)20190404,購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠;羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na),批號(hào)20180718,購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;甲氨蝶呤(批號(hào)RH221275)、牛II型膠原蛋白(CII,批號(hào)L22S11C125306)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;完全弗氏佐劑(CFA,批號(hào)SLCH4887)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF,批號(hào)202109)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP,批號(hào)202109)、B細(xì)胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2,批號(hào)202109)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax,批號(hào)202109)的試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST,批號(hào)C010-2-1)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT,批號(hào)C009-2-1)、肌酐(批號(hào)C011-2-1)和尿素氮(批號(hào)C013-2-1)的試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;所用的化學(xué)藥品和試劑都是分析純級(jí)別。

    1.3 動(dòng)物

    SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2019- 0004,體質(zhì)量160~200 g。動(dòng)物在恒定的室溫(25 ℃,相對(duì)濕度70%~75%)下飼養(yǎng)。所有動(dòng)物研究經(jīng)昆明理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào)為PZWH(滇)K2021-0004。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 提取物中6種指標(biāo)性成分分析方法的建立

    2.1.1 色譜條件 參考本課題組前期發(fā)表的文獻(xiàn)方法[16]。色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為0.2%二乙胺(磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0)水溶液-乙腈,流動(dòng)相梯度為0~15 min,10%~20%乙腈;15~45 min,20%~40%乙腈;45~55 min,40%~70%乙腈;55~70 min,70%乙腈;體積流量為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為25 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm;柱溫為30 ℃;理論塔板數(shù)按照所有峰計(jì)算均不低于3000。

    2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取TSG、BMA、8- DCA、SAC、草烏甲素、大黃素各適量,用酸性甲醇溶液制成質(zhì)量濃度分別為700、800、700、800、500、200 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液;分別精密移取混合對(duì)照品溶液加酸性甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得系列混合對(duì)照品溶液。照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC檢測(cè),以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(),峰面積值為縱坐標(biāo)(),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸,得回歸方程分別為TSG=11 727 831.648 4-57 860.619 3,=0.999 1,線性范圍0.007~70.000 μg/mL;BMA=9 523 875.004 0-21 540.034 1,=0.999 8,線性范圍0.008~80.000 μg/mL;8-DCA=14 880 359.851 2-24 512.274 0,=0.999 9,線性范圍0.007~70.000 μg/mL;SAC=22 665 612.465 5-42 921.655 5,=0.999 9,線性范圍0.008~80.000 μg/mL;草烏甲素=30 000 947.232 9-42 758.540 0,=0.999 8,線性范圍0.005~50.000 μg/mL;大黃素=41 750 102.139 7-21 304.199 6,=0.999 9,線性范圍0.002~20.000 μg/mL。

    2.1.3 供試品溶液的配制 取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的透皮接收液,吹干,殘?jiān)蛹状级ㄈ葜? mL,0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),即得透皮供試品溶液。

    2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取6種指標(biāo)性成分的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液25 μL,照上述色譜條件測(cè)定,重復(fù)進(jìn)樣6次,進(jìn)行精密度試驗(yàn),結(jié)果TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素、大黃素峰面積的RSD分別為1.08%、1.19%、0.75%、1.06%、0.19%、0.49%,結(jié)果表明儀器系統(tǒng)精密度良好。

    2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取6份同一時(shí)間點(diǎn)的透皮供試品溶液25 μL,照上述色譜條件測(cè)定,進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),結(jié)果TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素、大黃素質(zhì)量濃度的RSD分別為0.80%、0.92%、0.70%、0.94%、1.25%、1.07%,結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

    2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取透皮供試品溶液,分別于制備后0、2、4、6、12、24 h進(jìn)行HPLC測(cè)定,進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn),結(jié)果TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素、大黃素峰面積的RSD分別為0.77%、1.08%、1.66%、0.75%、1.75%、0.80%,結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密取6種指標(biāo)性成分含量已測(cè)定的透皮供試品溶液25 μL,加入適量混合對(duì)照品儲(chǔ)備液,進(jìn)HPLC測(cè)定6種指標(biāo)性成分的總含量,計(jì)算得平均加樣回收率,結(jié)果TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素、大黃素的平均加樣回收率分別為96.96%、97.50%、96.43%、99.57%、96.71%、95.38%,RSD分別為2.44%、1.62%、1.74%、1.86%、1.35%、2.39%,結(jié)果表明該方法的加樣回收率良好。

    2.1.8 樣品測(cè)定 精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液、透皮供試品溶液、空白溶劑各25 μL,按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定,結(jié)果表明該方法專屬性良好,HPLC圖見(jiàn)圖1。

    1-TSG 2-BMA 3-8-DCA 4-SAC 5-草烏甲素 6-大黃素

    2.2 數(shù)據(jù)處理與分析

    2.3 提取物溶解度的測(cè)定

    分別稱取1.2 g提取物加入5種不同的溶劑10 mL,超聲處理(功率300 W、頻率40 kHz、水溫40 ℃以下)2 h,放冷,12 000 r/min離心(離心半徑為6.3 cm)10 min,取上清液,吹干,加入1 mL酸性甲醇,0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定,考察5種不同溶劑對(duì)提取物中6種指標(biāo)性成分溶解度的影響,結(jié)果如表1所示,TSG、8-DCA、SAC、草烏甲素和大黃素在10%乙醇中溶解度最高,BMA在水溶液中溶解度最高。綜合可知,提取物中6種指標(biāo)性成分溶解度總和在10%乙醇中最高,分別為40.41、60.01、25.72、12.62、5.84、1.71 μg/mL。

    2.4 體外透皮試驗(yàn)

    2.4.1 溶劑考察 分別取1.2 g提取物加入10 mL 5種不同的溶劑,超聲處理(功率300 W、頻率40 kHz、水溫40 ℃以下)2 h,放冷,12 000 r/min離心(離心半徑為6.3 cm)10 min,取上清液,即得供給池溶液。參考有關(guān)文獻(xiàn)方法[17]進(jìn)行離體鼠皮的制備和體外透皮實(shí)驗(yàn),以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)為接收液,轉(zhuǎn)速約600 r/min,保持透皮儀內(nèi)溫度恒定為37 ℃,接收池體積為7 mL,透皮擴(kuò)散面積2.8 cm2。在24 h時(shí)取1.0 mL接收液樣品,離心、濾過(guò),取上清液,通過(guò)“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分析,根據(jù)6種指標(biāo)性成分的峰面積,計(jì)算透皮供試品溶液中各成分藥物質(zhì)量濃度,并按公式計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)6種指標(biāo)性成分的皮膚透過(guò)量(Δ)。

    表1 不同溶劑下6種指標(biāo)性成分的溶解度(, n = 3)

    Table 1 Solubility of six index components in different solvents (, n = 3)

    溶劑溶解度/(μg?mL?1) TSGBMA8-DCASAC草烏甲素大黃素總和 水37.01±0.84b60.77±0.45a24.46±0.18a12.16±0.73a5.69±0.17ab1.68±0.07a141.76±0.61b 10%乙醇40.41±0.64a60.01±0.48a25.72±0.25a12.62±0.81a5.84±0.11a1.71±0.10a146.31±1.81a DMSO40.06±0.34a59.53±0.52a19.32±0.28b11.42±0.58a4.07±0.19d1.54±0.18b135.94±1.40c DMF39.36±0.95b51.43±0.49b17.50±0.22b12.38±0.69a5.11±0.16c1.53±0.12b127.31±1.19d PEG35.16±0.84c27.73±0.33c12.53±0.16c8.78±0.21b5.40±0.15bc1.54±0.12b91.14±1.75e

    不同字母表示相同指標(biāo)不同處理差異顯著(<0.05),下表同

    different letters indicate that the same index is significantly different from different treatments(< 0.05), same as below tables

    Δ=CV/e

    C為某一時(shí)間點(diǎn)透皮接收液中的藥物質(zhì)量濃度,為接收液的體積,e為擴(kuò)散池的有效面積

    由表2可知,提取物中6種指標(biāo)性成分的皮膚滲透作用在不同溶劑中呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律,如TSG、BMA、SAC和大黃素的Δ在10%乙醇中最多,而8-DCA在DMSO中最多;因此本研究以6種指標(biāo)性成分Δ的總和來(lái)確定提取溶劑。結(jié)果表明采用10%乙醇作為溶劑時(shí)Δ最高,因此,選擇10%乙醇作為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)研究。

    2.4.2 促滲劑用量考察 根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,選擇氮酮作為促滲劑。采用“2.4.1”項(xiàng)下方法,對(duì)氮酮用量進(jìn)行考察。結(jié)果如表3所示,在3%氮酮作用下,有效成分的Δ均相對(duì)較高,比10%乙醇提高約2倍。根據(jù)上述研究,在10%乙醇作為溶劑和3%氮酮作為促滲劑的情況下,提取物具有較強(qiáng)的經(jīng)皮滲透能力。

    2.5 提取物水凝膠的制備

    選擇以上條件制備水凝膠。參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[18],取1.2 g提取物,加入10 mL 10%乙醇溶液,超聲離心,得上清液并濃縮為2 g,再加入氮酮0.06 g,即得提取物10%乙醇儲(chǔ)備液。精密稱取0.15 g PVP置于50 mL燒杯中,每份加入0.2 g CMC-Na,混合均勻后,加入0.5 g甘油,加入5 mL去離子水,室溫放置溶脹12 h后,制得空白基質(zhì);隨后取提取物10%醇儲(chǔ)備液,與空白基質(zhì)混合均勻,補(bǔ)足去離子水至凝膠體系為10 g,即得提取物水凝膠,水凝膠制備流程圖見(jiàn)圖2-A,水凝膠示意圖見(jiàn)圖2-B。

    表2 不同溶劑下6種指標(biāo)性成分的ΔM(, n = 3)

    Table 2 ΔM of six index components in different solvents (, n = 3)

    溶劑ΔM/(μg?cm?2) TSGBMA8-DCASAC草烏甲素大黃素總和 水1.23±0.16ab2.15±0.30a0.31±0.10b0.29±0.02b0.16±0.02a0.22±0.03ab4.36±0.63b 10%乙醇1.56±0.32a2.20±0.13a0.38±0.07b0.58±0.03a0.17±0.01a0.27±0.04a5.16±0.56a DMSO0.82±0.22bc1.08±0.26b0.29±0.02a0.11±0.01c0.16±0.01b0.17±0.01ab2.63±0.47c DMF1.05±0.12cd0.89±0.12b0.78±0.04b0.18±0.01c0.13±0.01a0.22±0.01b3.25±0.10c PEG0.63±0.09a0.13±0.03c0.44±0.03b0.02±0.00d0.04±0.00c0.06±0.00c1.32±0.11d

    表3 不同用量的氮酮對(duì)6種指標(biāo)性成分的ΔM(, n = 3)

    Table 3 ΔM of six index components by different concentrations of azone (, n = 3)

    用量/%ΔM/(μg?cm?2) TSGBMA8-DCASAC草烏甲素大黃素總和 11.20±0.07a4.83±0.05c0.46±0.01d0.98±0.07bc0.35±0.06b0.20±0.06b8.02±0.13b 21.31±0.04a5.22±0.07ab0.53±0.04c0.95±0.06c0.43±0.06ab0.25±0.06b8.69±0.16b 31.53±0.08a5.83±0.77a0.68±0.06a1.41±0.11a0.51±0.11a0.32±0.06a10.28±0.90a 41.49±0.09b5.19±0.73b0.61±0.01b1.09±0.04b0.44±0.04ab0.24±0.07b9.06±0.91b 51.43±0.02b5.23±0.66b0.56±0.03bc1.07±0.05bc0.23±0.05c0.25±0.02b8.77±0.65b

    圖2 提取物水凝膠制備流程圖(A) 和示意圖(B)

    2.6 提取物水凝膠中6種指標(biāo)性成分含量的測(cè)定

    按“2.5”項(xiàng)下方法制備3批提取物水凝膠溶解于10 mL超純水中,12 000 r/min離心(離心半徑為6.3 cm)10 min,濾過(guò),吹干,加入1 mL酸性甲醇,0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),進(jìn)行HPLC檢測(cè)。結(jié)果表明,6種指標(biāo)性成分TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素和大黃素的質(zhì)量濃度分別為(25.53±0.52)、(58.01±6.80)、(12.46±0.33)、(11.62±0.81)、(5.26±0.31)、(1.42±0.09)μg/mL。

    2.7 提取物水凝膠的表征

    2.7.1 pH值的測(cè)定 取3批提取物水凝膠,分別稱取1 g置于小燒杯中,并加入25 mL水稀釋,分別測(cè)定其pH值。結(jié)果pH值分別為5.60、5.65、5.55,與皮膚pH值相接近,刺激性較小,符合皮膚局部外用制劑對(duì)pH值的要求。

    2.7.2 流變學(xué)測(cè)試

    (1)振幅掃描:在凝膠線性黏彈區(qū)(linear viscoelastic region of gel,LVER)內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)振蕩試驗(yàn),其測(cè)試結(jié)果可得到凝膠結(jié)構(gòu)被破壞所能承受的最大形變。在剪切應(yīng)變()為0.01%~100%,溫度為25 ℃、角頻率()為1 rad/s的振幅掃描條件下測(cè)定樣品的LVER的結(jié)果。如圖3-A所示,<45%,儲(chǔ)能模量(′)>損耗模量(″),彈性占主體,即樣品表現(xiàn)出凝膠結(jié)構(gòu);當(dāng)′=″時(shí),凝膠結(jié)構(gòu)完全被破壞;當(dāng)>45%,′<″,黏性占主體,表現(xiàn)出流體性質(zhì)。證明控制在45%以內(nèi),提取物水凝膠呈凝膠狀態(tài)。

    (2)頻率掃描:在非破壞性變形范圍內(nèi),樣品的時(shí)間相關(guān)特性用頻率掃描來(lái)描述。在為1%,溫度為25 ℃,為0.1~100 rad/s條件下對(duì)凝膠進(jìn)行頻率掃描。如圖3-B所示。在整個(gè)頻率掃描中,′曲線始終高于″曲線,明顯表現(xiàn)出以彈性為主的特性,始終呈現(xiàn)凝膠狀態(tài);且′較穩(wěn)定,未出現(xiàn)顯著的頻率依賴性,表明該提取物凝膠具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

    (3)溫度掃描:在動(dòng)態(tài)模式下,固定為1 rad/s,為1%,樣品以2 ℃/min的速率加熱,溫度在20~50 ℃條件下對(duì)凝膠進(jìn)行溫度掃描。如圖3-C所示,在20~50 ℃,隨著溫度升高,′一直大于″,呈凝膠狀態(tài);但′和″呈不斷下降趨勢(shì),這可能是由于溫度升高,分子熱運(yùn)動(dòng)程度加劇,高分子鏈之間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞造成的,表明在常規(guī)溫度下,該凝膠始終保持凝膠狀態(tài)。

    (4)時(shí)間掃描:在動(dòng)態(tài)模式下,固定為1 rad/s,為1%,溫度25 ℃的條件下,在0~30 min內(nèi)對(duì)凝膠進(jìn)行時(shí)間掃描。如圖3-D所示,在0~30 min,隨著時(shí)間增加,′一直大于″,明顯表現(xiàn)出以彈性為主的特性,表明該凝膠始終呈凝膠狀態(tài)。

    2.7.3 SEM測(cè)試 將提取物水凝膠真空冷凍干燥,取適量?jī)龈煞勰瑖娊鹛幚?,利用SEM觀察凝膠微觀形貌。結(jié)果如圖4所示,凝膠內(nèi)部為三維交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),這使其具有較好的延展能力及皮膚滯留特性,也為經(jīng)皮遞送提供了穩(wěn)定的物化環(huán)境,藥物可更好的持續(xù)性地釋放,從而達(dá)到緩釋效果。

    2.7.4 初步穩(wěn)定性考察 將4批提取物水凝膠分別置于不同溫度(4、25、35、45 ℃)下,考察0、5、10 d凝膠中6種指標(biāo)性成分含量總和、pH值的變化情況,以確定提取物水凝膠最佳存放條件。由表4可知,溫度對(duì)提取物水凝膠的穩(wěn)定性影響顯著,隨著時(shí)間的推移,提取物水凝膠中6種指標(biāo)性成分含量不斷減少,且pH值也隨之增加。4 ℃的存放環(huán)境對(duì)提取物水凝膠的穩(wěn)定性影響較小,因此,該凝膠貯藏于4 ℃為宜。

    圖4 不同放大倍數(shù)下提取物水凝膠SEM圖

    表4 提取物水凝膠初步穩(wěn)定性考察

    Table 4 Stability investigation of extract-hydrogel

    t/d6種指標(biāo)性成分含量的總和/%pH值 4 ℃25 ℃35 ℃45 ℃4 ℃25 ℃35 ℃45 ℃ 0101.03±1.0399.90±2.3099.98±2.0699.83±3.885.59±0.025.67±0.015.63±0.025.77±0.02 598.47±3.9499.23±2.7798.89±2.9598.16±5.545.58±0.035.63±0.025.52±0.035.67±0.02 1094.84±11.2993.94±7.2294.35±3.8293.31±6.695.68±0.035.65±0.025.69±0.045.72±0.02

    2.8 提取物水凝膠對(duì)RA治療作用的研究

    2.8.1 RA模型的建立 參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced rheumatoid arthritis,CIA)大鼠模型的建立[19]。將CII凍干粉溶解于0.1 mol/L的醋酸中,制成2 mg/mL的CII醋酸溶液,與等體積CFA置于冰上研磨乳化至滴入水中不散開(kāi)為止,即得1 mg/mL乳劑I;同法與等體積IFA配成乳劑II。開(kāi)始對(duì)每只大鼠進(jìn)行尾根部皮內(nèi)2個(gè)位點(diǎn)共注射配制好的乳劑I 0.1 mL,第21天,每只大鼠相同部位重復(fù)注射相同劑量的乳劑II以加強(qiáng)免疫(二次免疫),空白對(duì)照組大鼠在相同的部位每次注射相同體積的生理鹽水代替膠原蛋白混合物。

    2.8.2 分組及給藥 第21天后,將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組(等劑量生理鹽水,ig),提取物灌胃組(1.05 g/kg,ig,根據(jù)三烏膠丸成人服用劑量換算成大鼠給藥劑量;以下簡(jiǎn)稱口服組)、提取物水凝膠組(1 g/只,關(guān)節(jié)涂抹;以下簡(jiǎn)稱水凝膠組),甲氨蝶呤(1 mg/kg,ig)組,每組6只。甲氨蝶呤組3 d/次,其余各組1次/d。二次免疫當(dāng)天開(kāi)始給藥,直到第48天,結(jié)束給藥。治療結(jié)束時(shí),各組大鼠踝關(guān)節(jié)狀態(tài)見(jiàn)圖5。

    2.8.3 關(guān)節(jié)炎療效的評(píng)估 將造模當(dāng)天定為第0天,每隔4 d稱定大鼠體質(zhì)量,右后肢的足厚度和足體積進(jìn)行測(cè)定;參考有關(guān)文獻(xiàn)方法[19]每隔4 d對(duì)給藥后大鼠的關(guān)節(jié)炎程度進(jìn)行臨床評(píng)分。處死大鼠,收集胸腺和脾進(jìn)行稱定質(zhì)量,計(jì)算各組臟器指數(shù)。并收集血液,取上清液按ELISA試劑盒說(shuō)明書的操作測(cè)定RF、CRP、Bcl-2和Bax的含量。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)表明,各組之間大鼠體質(zhì)量無(wú)顯著性差異;與空白組相比,模型組大鼠足厚度和足體積顯著升高,表明造模成功。持續(xù)給藥一段時(shí)間后,甲氨蝶呤組可顯著降低足厚度、足體積和關(guān)節(jié)炎指數(shù)水平;提取物經(jīng)過(guò)口服和經(jīng)皮給藥均可降低降低足厚度、足體積和關(guān)節(jié)炎指數(shù)水平,且與甲氨蝶呤相比,無(wú)顯著性差異;表明采用局部經(jīng)皮給藥的模式,未降低提取物對(duì)CIA大鼠的治療作用。

    圖5 各組大鼠給藥結(jié)束后踝關(guān)節(jié)情況

    與空白組比較:###<0.001;與模型組比較:*<0.05**<0.01

    ###< 0.001blank group;*< 0.05**< 0.01model group

    Fig. 6 Effects of different treatments on the degree of arthritis in rats (,= 6)

    同時(shí)進(jìn)一步計(jì)算臟器指數(shù),根據(jù)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)評(píng)價(jià)提取物對(duì)RA的治療作用;結(jié)果(圖7)表明,與空白組相比,模型組胸腺和脾臟器指數(shù)均顯著升高。與模型組相比,各給藥組均能顯著降低胸腺和脾的臟器指數(shù)。隨后測(cè)定血清中炎癥相關(guān)因子RF及蛋白CRP,抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的含量,與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中RF、CRP和Bcl-2的水平顯著升高,Bax的水平顯著降低;與模型組比較,甲氨蝶呤組可顯著降低RF、CRP和Bcl-2水平和升高Bax水平,口服和水凝膠組均可顯著降低RF、CRP和Bcl-2水平和升高Bax水平,且效果與甲氨蝶呤相比無(wú)顯著差異;這表明各給藥組可能通過(guò)降低炎癥,抑制滑膜組織的異常增生和增加凋亡來(lái)起到治療關(guān)節(jié)炎的作用。

    2.8.4 毒性評(píng)估 進(jìn)一步研究各給藥組對(duì)大鼠毒性的影響,按照試劑盒說(shuō)明書中使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定大鼠血清中與肝毒性相關(guān)指標(biāo)AST和ALT及腎毒性相關(guān)指標(biāo)尿素氮和肌酐水平,從而評(píng)價(jià)不同給藥組對(duì)CIA大鼠的肝腎損傷情況。如表5所示,與空白組比較,模型組大鼠肝臟中ALT、AST、肌酐和尿素氮水平顯著升高;與模型組比較,持續(xù)口服甲氨蝶呤和提取物,ALT、AST、肌酐和尿素氮水平均升高;通過(guò)在炎癥部位進(jìn)行提取物水凝膠局部給藥,ALT、AST、肌酐和尿素氮的升高趨勢(shì)均得到了有效抑制。與口服組相比,水凝膠組能顯著降低ALT、AST、肌酐和尿素氮水平,表明提取物水凝膠經(jīng)皮給藥能通過(guò)降低ALT、AST、肌酐和尿素氮水平,減輕對(duì)CIA大鼠毒性作用。

    同時(shí),取各組大鼠心、肝、脾、肺、腎和胸腺組織,于4%多聚甲醛中固定24 h,石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,于顯微鏡下觀察組織病理變化,見(jiàn)圖8??瞻讓?duì)照組大鼠各臟器組織的病理形態(tài)改變無(wú)明顯差異;如圖中圈出部分所示,模型組大鼠心臟組織斷裂、血管擴(kuò)張瘀血;肝小葉中度水腫,脾小結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞增生、髓索增粗纖維化;肺泡間隔增厚,色素沉著,纖維結(jié)締組織增生;腎皮質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)多發(fā)靜脈管腔擴(kuò)張,瘀血,提示瘀血性疾病形成;胸腺相鄰小葉皮質(zhì)之間纖維間隔明顯擴(kuò)張,可見(jiàn)靜脈擴(kuò)張瘀血。與模型組比較,甲氨蝶呤組和口服組對(duì)各臟器病理組織損傷程度有所緩和,而水凝膠組病變損傷程度最輕,表明提取物水凝膠對(duì)CIA大鼠毒性作用最小,經(jīng)皮給藥可降低提取物的毒性。

    與空白組比較:#P<0.05 ##P<0.01 ###P<0.001;與模型組比較:*P<0.05 ***P<0.001 ****P<0.000 1

    表5 不同處理對(duì)CIA大鼠血清中ALT、AST、肌酐和尿素氮水平的影響 (, n = 6)

    Table 5 Effects of different treatments on the levels of ALT, AST, creatinine and blood urea nitrogen in serum of CIA rats (, n = 6)

    組別劑量ALT/(U?L?1)AST/(U?L?1)肌酐/(μmol?L?1)尿素氮/(mmol?L?1) 空白?27.32±2.4918.66±1.8343.88±2.187.72±0.69 模型?30.73±2.08#22.79±2.09#47.89±2.28#8.95±0.59# 甲氨蝶呤1 mg?kg?133.67±2.53*31.41±1.88***55.94±3.41***10.38±1.33* 口服1.05 g?kg?133.18±0.91*28.20±3.67*54.98±2.36***9.71±0.46* 水凝膠1 g?只?128.49±1.42*???20.14±0.70*???44.96±1.88*?8.11±0.53*??

    與空白組比較:#<0.05;與模型組比較:*<0.05***<0.001;與口服組比較:?<0.05??<0.01???<0.001

    #< 0.05blank group;*< 0.05***< 0.001model group;?< 0.05??< 0.01???< 0.001oral group

    3 討論

    三烏膠丸口服給藥方式具有復(fù)雜的體內(nèi)代謝和整體的調(diào)控機(jī)制,這限制了其對(duì)局部關(guān)節(jié)炎的治療效果。而經(jīng)皮給藥是指在皮膚或黏膜表面給藥,使藥物按恒定、接近恒定或需要的速率通過(guò)皮膚各層或黏膜,進(jìn)入體循環(huán),在全身和局部病灶維持有效的藥物濃度而產(chǎn)生治療作用,能夠避免口服給藥等引起的血藥濃度峰谷現(xiàn)象和有效解決生物大分子在體內(nèi)易失活及半衰期短等問(wèn)題的一種給藥方式[20]。因此,本研究改變傳統(tǒng)給藥途徑,通過(guò)局部經(jīng)皮給藥模式,使藥物高效、迅速地在病變部位富集和積累,從而提高三烏膠提取物的用藥安全性,獲得減毒增效的治療效果。

    圖8 不同處理對(duì)大鼠臟器HE病理學(xué)的影響 (×200)

    三烏膠提取物活性成分多且復(fù)雜,因此選擇6種指標(biāo)性成分進(jìn)行系統(tǒng)考察,而不是單一成分。經(jīng)皮給藥制劑關(guān)鍵在于提高藥物的透皮速率,藥物促滲透作用與選擇適宜的溶劑和促滲劑有密不可分的關(guān)系[21],則本實(shí)驗(yàn)以皮膚透過(guò)量為考察指標(biāo)來(lái)篩選溶劑種類和氮酮用量,結(jié)果表明,以10%乙醇作為溶劑和3%氮酮作為促滲劑,6種活性成分的整體經(jīng)皮滲透性最好。

    考慮到無(wú)法采用溶液直接進(jìn)行關(guān)節(jié)炎局部給藥,并且提取物中既有水溶性成分又有脂溶性成分,因此,利用水凝膠是具有三維網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)的高分子體系,具有優(yōu)越的生物相容性等特點(diǎn)[22],選擇水凝膠為劑型載體進(jìn)行經(jīng)皮給藥。

    本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,水凝膠組與甲氨蝶呤陽(yáng)性藥都可顯著降低CIA大鼠血清中RF、CRP和Bcl-2水平及顯著升高Bax水平,表明提取物水凝膠對(duì)RA具有治療作用;與口服組比較,水凝膠組可顯著性降低AST、ALT、肌酐和尿素氮水平并且各臟器病變程度更輕,表明其毒性有所降低。綜上,本實(shí)驗(yàn)制備的提取物水凝膠具有良好滲透性能且在保證活性的同時(shí)能降低毒性,這為今后三烏膠提取物新劑型的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供一定的理論參考。

    利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

    [1] Yuan X S, Tong B, Dou Y N,. Tetrandrine ameliorates collagen-induced arthritis in mice by restoring the balance between Th17 and Treg cells via the aryl hydrocarbon receptor [J]., 2016, 101: 87-99.

    [2] Wu P Y, Zhou J Y, Wu Y F,. The emerging role of Interleukin 37 in bone homeostasis and inflammatory bone diseases [J]., 2021, 98: 107803.

    [3] Law Y Y, Lee W F, Hsu C J,. miR-let-7c-5p and miR-149-5p inhibit proinflammatory cytokine production in osteoarthritis and rheumatoid arthritis synovial fibroblasts [J]., 2021, 13(13): 17227-17236.

    [4] Tsutomu T, Hiroto Y, Sakae T. Role of interleukin-6 in bone destruction and bone repair in rheumatoid arthritis [J]., 2021, 20(9): 102884.

    [5] Tuulikki S, Minja E, Theodore P. Treatment of rheumatoid arthritis: A global perspective on the use of antirheumatic drugs [J]., 2008, 18(3): 228-239.

    [6] Shahnaz B, Ahmadzadeh A, Ardekani M R S,. Does regular use of a complementary medicine of Olea Europe andhave adverse effects on lipid profile and fasting blood glucose of rheumatoid arthritis (RA) patients under treatment with DMARD regimens containing methotrexate? [J]., 2016, 15(4): 933-940.

    [7] 曾家順, 武鵬佳, 張愛(ài)飛. 三烏膠丸聯(lián)合甲氨蝶呤、艾拉莫德治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床觀察 [J]. 實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志, 2021, 35(12): 44-46.

    [8] 陶啟, 樂(lè)麗花, 柏克崗, 等. 三烏膠丸聯(lián)合锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床觀察 [J]. 實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床, 2021, 21(8): 18-19.

    [9] 邵鑫, 袁葉雙, 蔣先虹, 等. 烏頭堿對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響 [J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2019, 35(24): 3066-3070.

    [10] Zhou Y R, Zhao Y, Bao B H,. SND-117, a sinomenine bivalent alleviates type II collagen-induced arthritis in mice [J]., 2015, 26(2): 423-431.

    [11] 溫玉瑩, 王麗蘋, 沈志濱, 等. 黃草烏及其炮制品對(duì)心臟毒性的作用和機(jī)制研究 [J]. 中藥材, 2019, 42(6): 1277-1282.

    [12] He Y N, Ou S P, Xiong X,. Stems and leaves ofDebx. as potential herbal resources for treating rheumatoid arthritis: Chemical analysis, toxicity and activity evaluation [J]., 2018, 16(9): 644-652.

    [13] 許曉麗, 任晶, 翟文澤, 等. HPLC指紋圖譜評(píng)價(jià)何首烏和制何首烏不同提取部位肝毒性 [J]. 中成藥, 2020, 42(3): 792-795.

    [14] Bashir S, Hina M, Iqbal J,. Fundamental concepts of hydrogels: Synthesis, properties, and their applications [J]., 2020, 12(11): 1-60.

    [15] Ujith S K M B, Sundararajan V. Synthetic hydrogels: Synthesis, novel trends, and applications [J]., 2021, 138(19): 1-23.

    [16] 羅才琴, 肖素蕓, 呂冬, 等. 三烏膠丸HPLC指紋圖譜及多指標(biāo)成分定量分析研究 [J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào), 2022, 44(1): 150-159.

    [17] 王啟隆, 劉超, 權(quán)鵬, 等. 炮制對(duì)草烏中烏頭類生物堿經(jīng)皮吸收的影響及其貼劑的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià) [J]. 中草藥, 2021, 52(11): 3201-3208.

    [18] 楊春苗. 甲元卿成膜凝膠的制備及其藥效學(xué)研究 [D].長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2020.

    [19] 周小清, 廖理曦, 姜勇, 等. 蘇木酮A對(duì)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用 [J]. 中草藥, 2021, 52(3): 744-748.

    [20] 王曉紅. 微乳的促滲機(jī)制及在局部經(jīng)皮給藥中的應(yīng)用研究 [J]. 中國(guó)藥物與臨床, 2011, 11(4): 435-437.

    [21] 李春雪, 曾銳, 高元平, 等. 粗莖秦艽醇提物體內(nèi)外經(jīng)皮滲透性研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(11): 2914-2921.

    [22] Deng P P, Yao L C, Chen J J,. Chitosan-based hydrogels with injectable, self-healing and antibacterial properties for wound healing [J]., 2022, 276: 118718.

    Preparation of Sanwujiao extract-hydrogel and its therapeutic effect on rheumatoid arthritis

    XIAO Su-yun1, 2, LUO Cai-qin1, 2, LYU Dong1, 2, WANG Cheng-xiao1, 2, CUI Xiu-ming1, 2, 3

    1. School of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China 2. Key Laboratory ofResources Sustainable Development and Utilization, Kunming 650500, China 3. National Chinese Herbal Medicine Industry Technology System Kunming Comprehensive Test Station, Kunming 650500, China

    To prepare and characterize Sanwujiao extract-hydrogel and investigate its therapeutic activity on rheumatoid arthritis.Franz cell method was used to investigate thepermeation effects of 2,3,5,4′-tetrahydroxy stilbene 2--β--glucoside, benzoylmesaconine, 8-deacetylyunaconitine, sinapic acid crassicauline, crassicauline A and emodin in the Sanwujiao extract. The Sanwujiao extract-hydrogel was prepared and its physical and chemical properties were characterized; At the same time, the CIA rat model was established to study the therapeutic activity of Sanwujiao extract on rheumatoid arthritis under percutaneous delivery mode.The Sanwujiao extract-hydrogel was always in the state of gel under normal conditions; And its three-dimensional cross-linked network structure can make the drug release better and continuously, so as to achieve the sustained-release effect. In vivo pharmacological tests showed that the Sanwujiao extract-hydrogel significantly decreased the foot thickness, foot volume, arthritis index level, RF, CRP and Bcl-2 levels in serum and increased Bax levels in CIA rats; It can also reduce the levels of AST, ALT, creatinine and blood urea nitrogen and the degree of organ lesions.Using the local delivery mode of percutaneous delivery, Sanwujiao extract can retain the therapeutic activity and reduce the organ toxicity caused by oral administration, which provides the possibility for the study of external preparations of Sanwujiao extract in the future.

    Sanwujiao extract; hydrogel; transdermal drug delivery; topical application; rheumatoid arthritis; biological toxicity; 2,3, 5,4′-tetrahydroxy stilbene 2--β--glucoside; benzoylmesaconine; 8-deacetylyunaconitine; sinapic acid crassicauline; crassicauline A; emodin; rheumatoid factor; C-reactive protein; B-cell lymphoma-2; Bcl-2-associated X protein; aspartate aminotransferase; alanine aminotransferase; creatinine; blood urea nitrogen

    R283.6

    A

    0253 - 2670(2022)13 - 3929 - 11

    10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.006

    2022-01-13

    國(guó)家重大科技專項(xiàng)(202002AA100004-2);國(guó)家重大科技專項(xiàng)(202102AA310045);國(guó)家重大科技專項(xiàng)(202002AA1000056)

    肖素蕓(1997—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)樾滦椭兴幹苿el: 13766227297 E-mail: xsy13766227297@163.com

    崔秀明(1963—),男,研究員,主要從事中藥資源研究。Tel: 18387186037 E-mail: sanqi37@vip.sina.com

    [責(zé)任編輯 鄭禮勝]

    猜你喜歡
    指標(biāo)性批號(hào)經(jīng)皮
    小柴胡顆粒中5種指標(biāo)性成分的同時(shí)測(cè)定
    云南化工(2022年10期)2022-12-14 01:23:35
    一種JTIDS 信號(hào)批號(hào)的離線合批方法
    經(jīng)皮椎體成形術(shù)中快速取出殘留骨水泥柱2例報(bào)道
    中流砥柱
    廈門航空(2021年7期)2021-07-19 00:33:16
    不同移栽期丹參適宜采收期初探
    醫(yī)學(xué)科技期刊中藥品生產(chǎn)批號(hào)標(biāo)注探析
    中藥材批號(hào)劃分與質(zhì)量管理
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:26
    超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺置管引流術(shù)在膽汁瘤治療中的應(yīng)用
    球囊擴(kuò)張法建立經(jīng)皮腎通道的臨床觀察
    “醫(yī)用材料批號(hào)監(jiān)控追蹤”質(zhì)量改進(jìn)及實(shí)施評(píng)估
    亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 欧美变态另类bdsm刘玥| 大陆偷拍与自拍| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品一二三| 一区福利在线观看| av欧美777| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲精品国产区一区二| 黄色 视频免费看| 秋霞在线观看毛片| 悠悠久久av| 97人妻天天添夜夜摸| 不卡av一区二区三区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 黄片播放在线免费| 色视频在线一区二区三区| av一本久久久久| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美大码av| 高清在线国产一区| 亚洲精品av麻豆狂野| 淫妇啪啪啪对白视频 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产黄频视频在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日韩欧美国产一区二区入口| www.999成人在线观看| 一级片免费观看大全| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 极品人妻少妇av视频| 国产一区二区 视频在线| 美女国产高潮福利片在线看| 啦啦啦免费观看视频1| 老司机影院毛片| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产成人av教育| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 咕卡用的链子| 午夜91福利影院| 午夜91福利影院| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美性长视频在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美在线黄色| 欧美黄色片欧美黄色片| av有码第一页| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产色视频综合| 成年女人毛片免费观看观看9 | 99精品久久久久人妻精品| 亚洲国产精品一区三区| 国产一级毛片在线| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲精品国产av蜜桃| 精品视频人人做人人爽| 国产免费av片在线观看野外av| 国产伦理片在线播放av一区| 国产在线视频一区二区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产免费现黄频在线看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲人成电影免费在线| 免费不卡黄色视频| 亚洲avbb在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲欧美清纯卡通| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产成人a∨麻豆精品| 老司机靠b影院| 91成人精品电影| 一区福利在线观看| 美女大奶头黄色视频| 日韩大码丰满熟妇| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产精品久久久久久精品电影小说| 午夜福利视频在线观看免费| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 午夜激情久久久久久久| 一级黄色大片毛片| 国产精品久久久人人做人人爽| 一级片免费观看大全| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 色老头精品视频在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 久久中文字幕一级| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品久久久精品久久久| 美女中出高潮动态图| 在线看a的网站| 老司机午夜福利在线观看视频 | 国产精品1区2区在线观看. | 亚洲五月色婷婷综合| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 少妇粗大呻吟视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久中文字幕一级| 午夜激情久久久久久久| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 欧美变态另类bdsm刘玥| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲 欧美一区二区三区| 丝袜在线中文字幕| 国产有黄有色有爽视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产高清视频在线播放一区 | 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美97在线视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久精品区二区三区| 丝瓜视频免费看黄片| 国产av一区二区精品久久| 他把我摸到了高潮在线观看 | 亚洲免费av在线视频| 丰满少妇做爰视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 成人手机av| cao死你这个sao货| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产日韩欧美在线精品| 国产成人影院久久av| 国产精品一区二区在线不卡| 嫩草影视91久久| 视频区欧美日本亚洲| 性少妇av在线| a级毛片黄视频| 久久久精品免费免费高清| 国产福利在线免费观看视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 婷婷成人精品国产| 99精国产麻豆久久婷婷| 男女国产视频网站| 国产深夜福利视频在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产人伦9x9x在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲avbb在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产亚洲精品第一综合不卡| 超色免费av| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美+亚洲+日韩+国产| 99国产综合亚洲精品| 精品欧美一区二区三区在线| 不卡一级毛片| 精品国产乱码久久久久久男人| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久天堂一区二区三区四区| 一区二区av电影网| 亚洲五月色婷婷综合| 十八禁网站免费在线| 热99re8久久精品国产| 搡老熟女国产l中国老女人| 日本欧美视频一区| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 两人在一起打扑克的视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 啦啦啦免费观看视频1| 麻豆av在线久日| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品影院久久| 久久精品成人免费网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品视频人人做人人爽| 日本一区二区免费在线视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲av美国av| 中文字幕色久视频| 国产一级毛片在线| 人成视频在线观看免费观看| 丁香六月欧美| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲天堂av无毛| 99久久99久久久精品蜜桃| 男人添女人高潮全过程视频| 免费在线观看黄色视频的| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲色图综合在线观看| 国产又爽黄色视频| 99热国产这里只有精品6| 亚洲欧美清纯卡通| 国产在线视频一区二区| www.精华液| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲黑人精品在线| 99国产精品99久久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 老司机影院成人| 悠悠久久av| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久影院123| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲国产日韩一区二区| 免费高清在线观看视频在线观看| 午夜激情久久久久久久| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久九九热精品免费| 久久久国产一区二区| 又黄又粗又硬又大视频| 乱人伦中国视频| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品国产av在线观看| 午夜福利,免费看| 日韩三级视频一区二区三区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | tube8黄色片| 亚洲中文av在线| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产成人av教育| 色视频在线一区二区三区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 啦啦啦免费观看视频1| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 婷婷丁香在线五月| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 日本av手机在线免费观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美另类一区| 久久久国产欧美日韩av| 人人妻人人澡人人看| 黄色视频在线播放观看不卡| 日韩欧美免费精品| 国产成人免费无遮挡视频| avwww免费| 日本wwww免费看| 日韩一区二区三区影片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 中文字幕最新亚洲高清| av欧美777| 久久这里只有精品19| 亚洲中文字幕日韩| 永久免费av网站大全| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲综合色网址| 久久久久久人人人人人| 久久九九热精品免费| www日本在线高清视频| 18禁国产床啪视频网站| 久9热在线精品视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲精品乱久久久久久| a级毛片黄视频| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲av国产av综合av卡| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 丁香六月天网| 亚洲国产日韩一区二区| 桃红色精品国产亚洲av| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲精品在线美女| 深夜精品福利| 一进一出抽搐动态| 99九九在线精品视频| 丝瓜视频免费看黄片| 免费观看人在逋| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 97精品久久久久久久久久精品| a级片在线免费高清观看视频| 久久精品亚洲av国产电影网| av在线播放精品| av线在线观看网站| 成年美女黄网站色视频大全免费| 美女扒开内裤让男人捅视频| 午夜影院在线不卡| 大香蕉久久成人网| 亚洲成人手机| 一区二区日韩欧美中文字幕| 制服诱惑二区| 一区二区三区乱码不卡18| 午夜影院在线不卡| 久久九九热精品免费| 丁香六月欧美| 国产淫语在线视频| 波多野结衣一区麻豆| 国产成人a∨麻豆精品| 国产日韩欧美亚洲二区| 一级片免费观看大全| 久久热在线av| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 伦理电影免费视频| 好男人电影高清在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 中国国产av一级| 999精品在线视频| 美女高潮到喷水免费观看| 99久久国产精品久久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 日韩大码丰满熟妇| 国产成人a∨麻豆精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 满18在线观看网站| 久久久久久久精品精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲情色 制服丝袜| 国产在线观看jvid| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲美女黄色视频免费看| 少妇 在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久精品人人爽人人爽视色| 美女福利国产在线| 捣出白浆h1v1| 一级毛片女人18水好多| 他把我摸到了高潮在线观看 | 老司机影院成人| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 一级毛片精品| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲色图综合在线观看| 大香蕉久久网| 国产1区2区3区精品| 亚洲国产精品999| svipshipincom国产片| 国产一区有黄有色的免费视频| 少妇人妻久久综合中文| 国产日韩欧美亚洲二区| 首页视频小说图片口味搜索| 国产日韩欧美亚洲二区| 日韩大片免费观看网站| 欧美精品高潮呻吟av久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 成人国产一区最新在线观看| 99久久国产精品久久久| 韩国精品一区二区三区| 极品人妻少妇av视频| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 中文字幕制服av| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 久久精品成人免费网站| 亚洲中文字幕日韩| 欧美成狂野欧美在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产视频一区二区在线看| 麻豆av在线久日| 丝袜脚勾引网站| 大陆偷拍与自拍| 9191精品国产免费久久| 欧美激情高清一区二区三区| 不卡av一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 五月天丁香电影| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国精品久久久久久国模美| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 黄色a级毛片大全视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 精品第一国产精品| 久久久久精品人妻al黑| 美女福利国产在线| 叶爱在线成人免费视频播放| av不卡在线播放| 久久精品国产亚洲av高清一级| av不卡在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 色老头精品视频在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 在线看a的网站| a级毛片黄视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 水蜜桃什么品种好| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产黄频视频在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 91国产中文字幕| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产黄色免费在线视频| 国产精品久久久久久精品古装| 免费观看a级毛片全部| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美日韩一级在线毛片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 一级片免费观看大全| 亚洲国产精品成人久久小说| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久国产精品影院| 国产黄频视频在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 99久久人妻综合| 免费不卡黄色视频| 少妇精品久久久久久久| 夫妻午夜视频| 亚洲久久久国产精品| 黄色怎么调成土黄色| 国产欧美日韩精品亚洲av| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| av电影中文网址| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 999久久久国产精品视频| 午夜福利一区二区在线看| 久久精品成人免费网站| 日日夜夜操网爽| 国产日韩欧美亚洲二区| 伊人亚洲综合成人网| 国产成人av激情在线播放| 久久人人97超碰香蕉20202| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产人伦9x9x在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 国产精品av久久久久免费| 成人三级做爰电影| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 大陆偷拍与自拍| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 高清欧美精品videossex| 亚洲精品粉嫩美女一区| 我的亚洲天堂| 考比视频在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 悠悠久久av| 亚洲人成电影观看| 美女国产高潮福利片在线看| 国产成人精品在线电影| 午夜免费鲁丝| av视频免费观看在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频 | 在线 av 中文字幕| 最近中文字幕2019免费版| 国产免费视频播放在线视频| 在线精品无人区一区二区三| 男女高潮啪啪啪动态图| 天天影视国产精品| 亚洲av男天堂| 91字幕亚洲| tocl精华| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 老鸭窝网址在线观看| 一本综合久久免费| 久久久国产精品麻豆| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产伦理片在线播放av一区| 在线观看免费高清a一片| 免费观看人在逋| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲美女黄色视频免费看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 91麻豆av在线| 99精品欧美一区二区三区四区| 大片免费播放器 马上看| 精品免费久久久久久久清纯 | 午夜91福利影院| 精品福利永久在线观看| 丝袜在线中文字幕| 爱豆传媒免费全集在线观看| kizo精华| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美精品一区二区大全| 12—13女人毛片做爰片一| 国产区一区二久久| kizo精华| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美精品一区二区大全| 免费在线观看影片大全网站| 最新在线观看一区二区三区| 午夜福利一区二区在线看| 一区二区三区四区激情视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲天堂av无毛| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 精品一区在线观看国产| 国产精品.久久久| 亚洲一区中文字幕在线| 日本av免费视频播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产在线视频一区二区| 国产精品久久久久成人av| 久久精品成人免费网站| 乱人伦中国视频| 欧美国产精品一级二级三级| 在线天堂中文资源库| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 美女国产高潮福利片在线看| 久9热在线精品视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 人人澡人人妻人| 国产精品av久久久久免费| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久久久精品精品| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 老汉色∧v一级毛片| 中文字幕色久视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | av电影中文网址| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产在线一区二区三区精| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美黄色片欧美黄色片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 青草久久国产| 国产野战对白在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产伦人伦偷精品视频| 婷婷色av中文字幕| 老司机福利观看| 啦啦啦 在线观看视频| 成年人午夜在线观看视频| 99香蕉大伊视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲精品久久午夜乱码| 永久免费av网站大全| 成人av一区二区三区在线看 | 99re6热这里在线精品视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 中国美女看黄片| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美大码av| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 另类精品久久| 精品久久蜜臀av无| 黄色视频不卡| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美黑人精品巨大| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲五月婷婷丁香| 无遮挡黄片免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| av在线app专区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 蜜桃国产av成人99| 欧美另类亚洲清纯唯美| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产亚洲av高清不卡| 成人国语在线视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 黑人操中国人逼视频| 国产色视频综合| 欧美97在线视频| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产一区有黄有色的免费视频| 国精品久久久久久国模美| 男女边摸边吃奶| av在线老鸭窝| 亚洲色图综合在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 深夜精品福利| 久久久久网色| 三级毛片av免费| 免费在线观看完整版高清| 在线 av 中文字幕| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久久欧美国产精品| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久久国产成人免费| 在线永久观看黄色视频| 精品久久久精品久久久|