基于指紋圖譜和多指標成分含量測定的枳殼與枳實藥材質量差異性研究

童培珍，李國衛(wèi)，何嘉瑩，邱韻靜，王利偉，徐敏，何廣銘（廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實，7月果皮尚綠時采收，具有理氣寬中，行滯消脹之功效，臨床常用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內停、臟器下垂[1]；枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果，5～6月收集自落的果實，具有破氣消積、化痰散痞的作用，臨床常用于積滯內停、痞滿脹痛、瀉痢后重、大便不通、痰滯氣阻、胸痹、結胸、臟器下垂[1]?！侗静菥V目》曰：“枳實、枳殼，氣味功用俱同，上世亦無分別，魏晉以來，始分實、殼之用。潔古張氏，東垣李氏，又分治高治下之說。大抵其功皆能利氣，氣下則痰喘止，氣行則痞脹消，氣通則痛刺止，氣利則后重除。故以枳殼利胸膈，枳實則利腸胃，然張仲景治胸痹痞滿，以枳實為要藥，諸方治下血諸痢，大腸秘塞，里急后重，又以枳殼為通用，則枳實不獨治下，而枳殼不獨治高也[2]?！辫讓嵖嘀匦院朴谄茪庀e，枳殼味苦酸性微寒，善于理氣寬中，兩者性能各有側重，不可代用。研究表明，枳殼與枳實中含量較高的為黃酮類成分和香豆素類成分，具有調節(jié)胃腸道、抗癌等多種生物活性[3-7]。目前已有文獻報道不同物候期枳實、枳殼黃酮類和生物堿類成分變化，或是對枳殼與枳實黃酮類成分進行單一定性定量研究，無法系統(tǒng)地評價枳殼與枳實的差異[8-14]。枳殼和枳實來源幾乎相同，化學成分也相似，通過外觀顏色和果實大小只能進行主觀評價，可能會對其鑒別造成誤差，難以保證臨床藥效。現(xiàn)有文獻報道枳實及枳殼的含量或指紋圖譜多采用高效液相色譜法進行測定，耗時長。本研究采用UPLC法建立枳實與枳殼的指紋圖譜，利用主成分分析及偏最小二乘法-判別分析尋找枳實及枳殼的主要差異成分；對上述差異性成分進行定量分析，大大縮短了檢測時間，為枳殼和枳實的整體質量評價提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC H-Class型超高效液相色譜儀（四元泵，PDA檢測器）；Mettler-Toledo ME204E型萬分之一電子分析天平、Mettler-Toledo XP26型百萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；Milli-Q Direct超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）。

1.2 試藥

柚皮苷（批號：110722-201714，含量：93.4%）、橙皮苷（批號：110721-201818，含量：96.20%）、新橙皮苷（批號：111857-201804，含量：99.4%）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）；蕓香柚皮苷（批號：wkq19041908，含量：98.0%）、水合橙皮內酯（批號：wkq20031904，含量：98.0%）、川陳皮素（批號：wkq20031701，含量：98.0%）、橘紅素（批號：wkq16011401，含量：98.6%）（對照品，四川維克奇生物科技有限公司）；馬爾敏（批號：CFS201901，含量：98.0%，Chem Face生物有限公司）。乙腈（默克股份有限公司），磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司），甲醇（西隴科學股份有限公司），水為自制超純水。

枳殼與枳實經廣東一方制藥有限公司質量中心鑒定：枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實（編號：ZQ1-ZQ18）；枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥幼果（編號：ZS1-ZS10），樣品詳細信息見表1。

表1 樣品信息表 Tab 1 Information source of sample

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以乙腈為流動相A，0.05%磷酸水為流動相B，梯度洗脫（0～7 min，15%→25%A；7～8 min，25%→40%A；8～10 min，40%→45%A；10～13 min，45%→60%A；13～15 min，60%→15%A）；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為30℃；檢測波長為320 nm；進樣量為2 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素對照品適量，加甲醇制成含蕓香柚皮苷336.6 μg·mL-1、柚皮苷257.4 μg·mL-1、橙皮苷221.6 μg·mL-1、新橙皮苷105.7 μg·mL-1、水合橙皮內酯69.1 μg·mL-1、馬 爾 敏225.3 μg·mL-1、川陳皮素219.7 μg·mL-1、橘紅素256.4 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取枳殼和枳實粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流提取1.5 h，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 精密度試驗 取枳殼樣品（ZQ17）粉末約0.2 g，精密稱定，制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，以新橙皮苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果顯示18個共有峰相對保留時間RSD在0.010%～0.040%，相對峰面積RSD在0.040%～0.89%，均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取枳殼樣品（ZQ18）粉末約0.2 g，精密稱定，制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h進樣測定，以新橙皮苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果顯示18個共有峰相對保留時間RSD在0.040%～0.15%，相對峰面積RSD在0.120%～0.63%，均小于2.0%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.4.3 重復性試驗 取枳殼樣品（ZQ17）粉末約0.2 g，平行6份，精密稱定，制備供試品溶液，進樣測定，以新橙皮苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果顯示18個共有峰相對保留時間相對保留時間RSD在0.020%～0.040%，相對峰面積RSD在0.34%～2.2%，均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜測定結果與分析

2.5.1 枳殼與枳實共有峰的確定 取18批枳殼樣品和10批枳實樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結果得到18個共有峰，通過對照品指認了8個峰，分別為蕓香柚皮苷（峰1）、柚皮苷（峰2）、橙皮苷（峰4）、新橙皮苷（峰5）、水合橙皮內酯（峰7）、馬爾敏（峰13）、川陳皮素（峰15）、橘紅素（峰18）。其中新橙皮苷分離度好，保留時間適中，峰形穩(wěn)定，設為參照峰（S）。見圖1～3。

圖1 18批枳殼指紋圖譜疊加圖Fig 1 Fingerprint and chromatogram of 18 batches of Aurantii Fructus

圖2 10批枳實指紋圖譜疊加圖Fig 2 Fingerprint and chromatogram of 10 batches of Aurantii Fructus Immatutus

2.5.2 相似度評價 分別將18批枳殼和10批枳實指紋圖譜導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.0版本）”，生成枳殼和枳實對照指紋圖譜。結果顯示，18批枳殼與枳殼對照指紋圖譜的相似度在0.943～0.998；10批枳實與枳實對照指紋圖譜相似度在0.965～0.998。相似度均大于0.940，說明不同批次同種藥材質量大體一致。18批枳殼與枳實對照指紋圖譜的相似度在0.843～0.989；10批枳實與枳殼對照指紋圖譜相似度在0.845～0.996，相似度均大于0.84，說明同一基原不同采收期的兩種藥材相似度較高，僅通過相似度評價難以區(qū)分（見表2）。

表2 相似度評價結果 Tab 2 Similarity evaluation

圖3 對照品、供試品UPLC色譜圖Fig 3 UPLC of reference substance and sample

2.5.3 聚類分析 將枳殼與枳實色譜峰峰面積導入SPSS 20.0軟件進行聚類分析，采用組間聯(lián)接法，選用歐氏距離進行聚類分析，結果見圖4。由聚類分析結果可知，枳殼與枳實明顯地分成兩大類，一類為枳殼樣品（Ⅰ），另一類為枳實樣品（Ⅱ），說明枳殼和枳實樣品間存在一定的差異。

圖4 枳殼與枳實樣品聚類分析結果Fig 4 Clusster analysis of Aurantii Fructus and Aurantii Fructus Immatutus

2.5.4 主成分分析 將枳殼與枳實的共有峰峰面積導入SIMCA 14.1軟件進行主成分分析。結果前三個主成分的累積貢獻率為73.1%，說明前三個主成分基本能反映枳殼與枳實樣品的主要特征（見圖5）。以前三個主成分建立坐標系，構建枳殼與枳實的主成分分析得分圖（見圖6）。由得分圖可知，枳殼與枳實聚為兩類。結合聚類分析和主成分分析結果，表明枳殼與枳實的化學成分含量存在明顯差異。

圖5 主成分方差貢獻率Fig 5 Variance contribution rate of principal components

圖6 主成分分析得分圖Fig 6 Principal components scores

2.5.5 偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA） 為了進一步比較枳殼與枳實化學成分的差異和尋找兩者之間的差異性化合物，筆者進行了PLS-DA建模分析。PLS-DA模型中，R2Y為0.923，Q2Y為0.871，均大于0.5，說明建立的模型穩(wěn)定可靠。由PLS-DA得分圖可知（見圖7），枳殼與枳實明顯分為兩類，與聚類分析和主成分分析結果一致。通過變量重要性投影值（VIP）篩選出兩者間化學成分差異的主要標志性成分（見圖8）。以VIP值大于1作為標準篩選，貢獻由大到小的7個變量依次為：峰5、峰6、峰2、峰9、峰10、峰4、峰12。通過對照品指認出3個成分，分別為峰5新橙皮苷、峰2柚皮苷，峰4橙皮苷，其中峰5新橙皮苷的VIP值最大，是枳殼與枳實差異最大的峰。

圖7 PLS-DA得分圖Fig 7 PLS-DA scores

圖8 枳殼與枳實差異標志物的VIP圖Fig 8 VIP value of Aurantii Fructus and Aurantii Fructus Immatutus

2.6 含量測定

由指紋圖譜測定結果可知，枳殼與枳實化學成分類似，但存在含量間的差異。故采用UPLC法對枳殼和枳實的4個黃酮類成分（蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）和4個香豆素類成分（水合橙皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素）進行含量測定。

2.6.1 精密度考察 取“2.2”項下混合對照品，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，結果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素8個成分峰面積RSD分別為0.52%、0.83%、1.0%、1.3%、1.1%、1.2%、1.6%、1.0%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性考察 取枳殼樣品（ZQ17）粉末約0.2 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h進樣測定，計算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素8個成分峰面積RSD分別為1.6%、1.6%、1.4%、1.3%、1.6%、1.6%、1.1%、1.7%，表 明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.6.3 線性關系考察 精密移取“2.2”項下對照品溶液，加甲醇稀釋成6個不同質量濃度的對照品溶液，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表3。

表3 回歸方程及線性范圍 Tab 3 Regression equation and linearity

2.6.4 重復性試驗 取枳殼樣品（ZQ17）粉末約0.2 g，平行6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素8個成分含量RSD分別為1.6%、0.82%、0.66%、1.1%、1.3%、1.6%、1.1%、1.7%，表明該方法重復性良好。

2.6.5 加樣回收試驗 取已知含量的枳殼樣品（ZQ17）粉末約0.1 g，精密稱定，平行6份，1∶1加入對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算各成分的加樣回收率。結果8種成分的平均回收率在96.14%～104.88%，RSD在0.91%～4.2%。

2.6.6 樣品測定結果 精密吸取18批枳殼和10批枳實供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果見表4。除川陳皮素外，枳實整體含量高于枳殼，尤其是柚皮苷和新橙皮苷含量遠高于枳殼含量，說明柚皮苷和新橙皮苷為枳殼與枳實的差異性化合物，與PLS-DA分析結果一致。

表4 含量測定結果(mg·g-1) Tab 4 Content determination (mg·g-1)

2.6.7 結果分析 以上述8個含量測定指標為檢驗變量，枳殼與枳實作為分組變量，采用SPSS 20.0軟件進行獨立樣本檢驗分析，由表5可知，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、馬爾敏、川陳皮素含量在枳殼與枳實中差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；橘紅素含量無顯著性差異（P＜0.05）。綜上，說明除橘紅素外，枳殼與枳實其余7個指標成分含量變化明顯。

表5 獨立樣本檢驗分析表 Tab 5 Independent sample analysis

3 討論

本試驗在流動相、檢測波長、柱溫、流速等色譜條件優(yōu)化基礎上，采用UPLC法對18批枳殼藥材和10批枳實藥材進行研究，建立了指紋圖譜，標定了18個共有峰，通過對照品指認出8個色譜峰。相似度分析結果表明，枳殼藥材與枳實藥材樣品相似度均大于0.90，枳殼藥材與枳實藥材指紋圖譜共有峰一致，表明兩者所含化學成分基本一致，但兩者共有峰峰面積相差較大，表明枳殼藥材與枳實藥材某些化學成分含量差異較大。為尋找枳殼藥材與枳實藥材差異性化合物，采用了聚類分析、主成分分析及PLS-DA分析等方法進行分析，均能對枳殼與枳實進行識別與聚類，并確認了新橙皮苷、柚皮苷和橙皮苷等7個成分是枳殼與枳實質量差異的主要物質。

本研究在指紋圖譜基礎上，對枳殼藥材和枳實藥材中8個指標性成分進行含量測定，除川陳皮素外，枳實整體含量高于枳殼，尤其是柚皮苷和新橙皮苷含量遠高于枳殼藥材，與文獻[8，14-15]報道一致。黃酮類成分隨著果實成熟而呈下降趨勢，這與其在植物體內的代謝轉化過程相關，多種因素對不同生長發(fā)育階段物質成分的積累具有一定影響?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃酮類化合物如橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷可促進胃腸動力，有明顯的促進胃排空、胃腸蠕動作用，這與枳實行氣力量較大，多用于破積導滯，通利大便，而枳殼作用較緩，長于理氣寬胸，消脹除痞的作用相一致，兩者功效性能不一，臨床應用也有所側重。本試驗通過建立指紋圖譜和多指標成分含量測定的方法，可較好地反映枳殼與枳實指紋圖譜的差異，也可為枳殼與枳實藥材的鑒別和質量評價提供依據(jù)。