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    兒童先天性心臟病TBX20 基因突變及功能探討

    2022-07-03 03:57:52金艷梅劉彩霞秦珍珍文云紅李青
    中國循環(huán)雜志 2022年6期
    關(guān)鍵詞:錯義突變型先心病

    金艷梅,劉彩霞,秦珍珍,文云紅,李青

    先天性心臟?。ㄏ刃牟。┦翘簳r期心臟及大血管發(fā)育異常所導致的心血管畸形,是最常見的人類出生缺陷和兒童非感染性疾病。臨床研究報道先心病的發(fā)生率為1%,而遺傳學研究發(fā)現(xiàn)心臟畸形的發(fā)生率為3%~5%,是造成新生兒及嬰幼兒死亡的主要原因[1-3]。輕微的先心病部分可以自愈,但復雜、重癥先心病經(jīng)常需要在出生后1 年內(nèi)甚至幾個月、幾天內(nèi)盡早干預(yù),否則可能導致各種并發(fā)癥,包括腦發(fā)育遲緩、肺動脈高壓、心律失常、慢性心力衰竭和心原性猝死等[4-6]。雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,先心病的診斷、治療均取得了巨大進步,但病因尚不明確,一些復雜先心病通常需要多次手術(shù)甚至心臟移植,給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔[7-10]。因此,發(fā)現(xiàn)人類先心病可能的易感基因或致病基因,并從分子水平與細胞水平深入研究揭示先心病的發(fā)病機制,對下一代的優(yōu)生優(yōu)育有著重要意義。

    TBX20作為T-box 轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員之一,表達于心肌發(fā)育所需的多種細胞系,包括咽部內(nèi)胚層、心臟祖細胞、心內(nèi)膜和心肌細胞,在心血管發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[8]。本研究通過DNA 測序擬在先心病患兒中尋找、發(fā)現(xiàn)新的突變位點,并通過同源建模、雙熒光素酶報告基因檢測等技術(shù),對新發(fā)現(xiàn)的可能存在致病性的突變進行功能分析,探究中國兒童先心病可能的分子發(fā)病機制。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象

    收集203 例在山西省兒童醫(yī)院心胸外科接受手術(shù)治療的漢族先心病患兒作為病例組,男性126 例,女性77 例,年齡0~12 歲。全部患兒均通過體格檢查、超聲心動圖和心臟直視或介入手術(shù)確診為先心病,并排除心臟血管之外的其他畸形和遺傳代謝性疾病,如馬凡綜合征、手-心綜合征、Noonan 綜合征和DiGeorge 綜合征等。研究對象的疾病種類見表1。同時收集300 例經(jīng)超聲心動圖確認無先心病的健康兒童作為對照組,符合與患兒無血緣關(guān)系、性別匹配、無明顯遺傳和出生缺陷疾病等條件。該研究經(jīng)山西省兒童醫(yī)院倫理委員會批準(批件號IRBKY-2019-001)。

    表1 病例組203 例先天性心臟病患兒的疾病種類分布

    1.2 研究方法

    1.2.1DNA 序列分析

    兩組患兒均采集外周靜脈血,采用磁珠法提取白細胞中的基因組DNA,設(shè)計合成引物,采用PTC-200 型自動擴增儀(Bio-Rad 公司,美國)對病例組與對照組TBX20基因(GenBank 序列號NM_001077653)的外顯子及交界區(qū)內(nèi)含子序列進行PCR 擴增,然后將PCR 擴增產(chǎn)物純化后經(jīng)3700 DNA 測序儀(ABI 公司,美國)進行測序分析,利用美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)BLAST 程序?qū)y序結(jié)果對比分析,檢測TBX20基因突變。對檢測到突變患兒的家庭成員也進行DNA 序列分析。

    1.1.2同源建模

    同源建模,又稱比較建模,是從已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)作為模板預(yù)測目標蛋白結(jié)構(gòu)的方法。本研究從UniProt 蛋白數(shù)據(jù)庫查詢TBX20的氨基酸序列,選取人類TBX3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(PDB 數(shù)據(jù)庫 ID:1H6F)為模板,利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模服務(wù)器I-TASSER 建立TBX20同源模型,對TBX20野生型及突變后的結(jié)構(gòu)模型進行分析比較。

    1.1.3雙熒光素酶報告基因檢測TBX20基因突變對下游靶基因心鈉素(ANF)啟動子活性的影響

    ANF對房室的形成具有特異性,是心臟發(fā)育的重要標志物之一。在心臟發(fā)育過程中,T-box 轉(zhuǎn)錄因子TBX20需要與同源盒轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5、鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA4協(xié)同激活下游包括ANF在內(nèi)的多個目標基因[11-13]。分別檢測突變型與野生型TBX20協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子GATA4、NKX2.5對調(diào)控ANF啟動子活性的影響,以研究基因突變導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變后對功能的影響。具體方法如下:(1)將人類野生型TBX20、GATA4、NKX2.5基因全長cDNA 序列分別插入到pcDNA3.1 載體上,構(gòu)建重組表達載體pcDNA3.1-TBX20、pcDNA3.1-GATA4、pcDNA3.1-NKX2.5。然后通過帶有突變位點序列的引物擴增出在本病例組中篩查檢測到的突變位點c.187G>A(A63T)的突變型TBX20基因片段,重組到pcDNA3.1 載體上,獲得突變型表達載體pcDNA3.1-TBX20(A63T),對突變體進行轉(zhuǎn)化、鑒定、測序,排除任何其他不必要的序列變異,確保為所需的突變序列。調(diào)取ANF基因啟動子區(qū)域2600 bp 序列構(gòu)建至熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic 上獲得ANF-luc 報告載體。(2)將野生型pcDNA3.1-TBX20、突變型pcDNA3.1-TBX20(A63T)及陰性對照pcDNA3.1 分別轉(zhuǎn)染到3 組COS7 細胞(中國科學院干細胞庫提供)中。同時每組細胞中均轉(zhuǎn)入ANF-luc 報告質(zhì)粒、表達海腎熒光素酶的內(nèi)控報告質(zhì)粒TK-Rluc 及協(xié)同TBX20激活A(yù)NF的NKX2.5表達質(zhì)粒、GATA4表達質(zhì)粒。48 h 后收集細胞,使用Promega 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng),E1910 試劑盒檢測熒光素酶活性。螢火蟲熒光素酶為報告基因,海腎熒光素酶作為內(nèi)參基因減少內(nèi)在變化因素(如培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別,細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等)對實驗準確性的影響,最后結(jié)果以兩者的熒光強度比值相對熒光值表示,以提高實驗的準確性。相對熒光值=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值,每個樣品重復3 次。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    用SPSS 24.0 軟件行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD 檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 發(fā)現(xiàn)1 個新的TBX20 基因錯義突變

    病例組與對照組在年齡、性別上差異無統(tǒng)計學意義,病例組先心病患兒的臨床特征見表1。通過對203 例無親緣關(guān)系的先心病患兒進行TBX20基因序列分析,在1 例房間隔缺損(ASD)患兒中發(fā)現(xiàn)了一個新的錯義突變c.187G>A(A63T),位于TBX20基因第2個外顯子,DNA 序列中第187 位鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰?,導致氨基酸序列中?3 位丙氨酸變?yōu)樘K氨酸,而在對照組中未發(fā)現(xiàn)該變異(圖1A)。在NCBI 數(shù)據(jù)庫對這個突變位點進行查找發(fā)現(xiàn)TBX20的第63 位氨基酸(丙氨酸)在不同物種中高度保守(圖1B)。我們對檢測到錯義突變患兒的父母、同胞妹妹的血樣也予以收集并提取DNA 進行了突變檢測。其母親和同胞妹妹也攜帶同樣的突變。她們主訴沒有明確的先心病病史,但未曾做過超聲心動圖檢查。當追蹤超聲心動圖檢查之后發(fā)現(xiàn),患兒母親有一直徑7.0 mm 的ASD,其同胞妹妹有直徑4.5 mm 的卵圓孔未閉和1.9 mm 的動脈導管未閉。該家庭中檢測到突變A63T 的3 人均患有ASD 或者卵圓孔未閉,提示該新發(fā)現(xiàn)的錯義突變A63T 很可能與先心病相關(guān)。新發(fā)現(xiàn)的TBX20基因突變位點A63T 已提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)并獲得序列號:EU636777。

    圖1 TBX20 基因測序結(jié)果及氨基酸序列比對分析

    2.2 同源建模顯示TBX20-A63T 導致TBX20 蛋白構(gòu)象發(fā)生改變

    針對上述家系中發(fā)現(xiàn)的TBX20錯義突變A63T,運用I-TASSER 同源建模服務(wù)器,以TBX3為模板對野生型及突變型TBX20建模,對兩種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析顯示TBX20-A63T 導致TBX20蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。如圖2 所示,野生型TBX20第63位的丙氨酸Ala63 與第65 位的甘氨酸Gly65、第68位的甘氨酸Gly68 相鄰并形成氫鍵,丙氨酸突變成蘇氨酸之后,蘇氨酸Thr63 與周圍殘基之間的關(guān)系發(fā)生改變,第63 位的蘇氨酸Thr63 與第65 位的甘氨酸Gly65、第68 位的甘氨酸Gly68 間的氫鍵斷裂,與第62 位的天冬氨酸Asp62、第64 位的組氨酸His64形成了新的氫鍵,導致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。

    圖2 同源建模顯示的TBX20 蛋白質(zhì)構(gòu)象

    2.3 TBX20-A63T 對下游靶基因ANF 的激活作用增強

    體外細胞實驗雙熒光素酶報告基因活性檢測結(jié)果見表2,陰性對照、野生型、突變型中相對熒光值分別2.00±0.07、5.22±0.35 和6.37±0.50,三者比較差異有統(tǒng)計學意義(F=121.40,P<0.0001)。野生型、突變型的相對熒光值均高于陰性對照,差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.0001)。突變型的相對熒光值高于野生型,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

    表2 雙熒光素酶系統(tǒng)檢測A63T 對ANF 活性的影響

    3 討論

    先心病是最常見的人類出生缺陷和兒童非感染性疾病,是導致1 歲以下嬰兒死亡的主要原因之一[2-3]。先心病的發(fā)生與環(huán)境、遺傳等多因素相關(guān),越來越多的研究認為遺傳因素在先心病的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用,但具體機制尚不明確[14-16]。

    T-box 轉(zhuǎn)錄因子家族成員在胚胎發(fā)育過程中各自發(fā)揮不同的作用,TBX20是T-box 基因家族的重要成員之一,屬于TBX1亞家族,對心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的形成和成熟心功能的維持具有重要作用[17]。TBX20位于第7 號染色體(7p14.2),有8 個外顯子,其289~888 核苷酸及相應(yīng)氨基酸編碼T-box DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域,通過此功能結(jié)構(gòu)域與特異DNA 序列結(jié)合,從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄[17-18]。TBX20作為家族重要成員表達于心肌發(fā)育所需的多種細胞系[8]。斑馬魚TBX20基因突變可引起心臟祖細胞數(shù)量大大減少,形成一個小的、狹長的無功能心臟。而TBX20過表達會導致心臟增大,心肌細胞明顯增多[3]。

    此前有研究發(fā)現(xiàn)人類TBX20基因突變與多種先心病的發(fā)生相關(guān),包括ASD、右心室雙出口、法洛四聯(lián)癥和室間隔缺損等[19-23]。Huang 等[24]在一個有先心病家族史患者的TBX20基因中發(fā)現(xiàn)一個新的突變K274X,它在編碼T-box DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個外顯子中引入了一個終止密碼子,這將產(chǎn)生一種新蛋白,該蛋白在T-box DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域中被截斷,缺乏C 端存在的轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制域。在COS7 細胞中的功能分析研究證明,該突變型TBX20蛋白與野生型蛋白相比對ANF的轉(zhuǎn)錄激活作用顯著下降,甚至無轉(zhuǎn)錄激活活性。Posch 等[19]研究了170 例互不相關(guān)的ASD 患者TBX20的全部編碼序列,在1 例有家族史的患者中發(fā)現(xiàn)了一個新的I121M 突變,在COS7細胞中進行研究顯示,在鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA4和同源盒轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5共存的情況下,該I121M 突變導致TBX20對ANF的轉(zhuǎn)錄激活作用顯著提高。這些發(fā)現(xiàn)提示TBX20基因突變可能是先心病的發(fā)病原因。

    本研究通過對203 例先心病患兒進行TBX20基因序列研究,在1 例ASD 患兒中發(fā)現(xiàn)了一個新的錯義突變c.187G>A(A63T),該突變導致TBX20上第63 位的非極性、疏水性丙氨酸變?yōu)闃O性、親水性的蘇氨酸。在NCBI 數(shù)據(jù)庫對這個突變位點進行查找顯示TBX20的第63 位氨基酸(丙氨酸)在不同物種中高度保守。保守性是指某一序列在進化演變過程中在不同的物種中一直保留,這種序列一般都發(fā)揮著很重要的功能,往往有其不可代替性。我們對該患兒的父母、同胞妹妹進行檢測發(fā)現(xiàn)其母親和同胞妹妹也攜帶同樣的突變,而且其母親患有ASD,其同胞妹妹患有卵圓孔未閉和動脈導管未閉。這一家系中3 位成員攜帶同樣突變A63T 又同時有ASD 或卵圓孔未閉的臨床表型特征,提示該錯義突變A63T很可能與ASD 的發(fā)生相關(guān)。

    基因錯義突變會導致氨基酸和蛋白質(zhì)發(fā)生變化,我們進而通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模對突變A63T進一步行空間結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析研究。以TBX3為模板對TBX20野生型及TBX20-A63T突變體進行建模,發(fā)現(xiàn)野生型TBX20第63 位的丙氨酸Ala63 與第65位的甘氨酸Gly65、第68 位的甘氨酸Gly68 相鄰并形成氫鍵,丙氨酸突變成蘇氨酸之后,導致蘇氨酸與周圍殘基之間的關(guān)系發(fā)生變化,第63 位蘇氨酸Thr63 與第65 位的甘氨酸Gly65、第68 位的甘氨酸Gly68 間的氫鍵斷裂,與第62 位的天冬氨酸Asp62、第64 位的組氨酸His64 形成了新的氫鍵,導致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。各種蛋白質(zhì)都有特定的空間構(gòu)象,而特定的空間構(gòu)象與特定的生物學功能相對應(yīng),結(jié)構(gòu)與功能是高度統(tǒng)一的。該突變影響了TBX20蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象,很可能會影響其生物學功能,導致先心病的發(fā)生。

    在此基礎(chǔ)上,我們通過體外細胞實驗進一步對突變A63T 進行功能研究。在心臟發(fā)育過程中,TBX20與NKX2.5、GATA4等轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同激活下游的多個目標基因,包括CX40、CX45、ANF[11-13]。ANF是心臟發(fā)育過程中一種極其敏感的重要標志物,對房室的形成具有特異性[13]。TBX20識別并結(jié)合ANF啟動子中的T-half 位點(與5-AGGTGTGA-3一致的DNA 序列),TBX20基因突變可能通過改變下游靶基因ANF啟動子活性參與先心病的發(fā)病機制[13,25-27]。我們在COS7 細胞中分別轉(zhuǎn)染等量的突變型TBX20-A63T 表達質(zhì)粒、野生型TBX20表達質(zhì)粒以及協(xié)同作用基因GATA4、NKX2.5,然后用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測ANF啟動子的活性。通過檢測TBX20、GATA4、NKX2.5協(xié)同調(diào)控過程中TBX20野生型與突變型對ANF啟動子活性的影響來研究TBX20-A63T 的功能。研究發(fā)現(xiàn)突變型對ANF啟動子的激活作用較野生型更強,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。因此認為突變A63T 有可能通過上調(diào)ANF的活性而參與先心病的發(fā)生。

    綜上所述,本研究在1 例漢族先心病患兒中發(fā)現(xiàn)了一個新的TBX20基因錯義突變A63T,并在兩位同樣患有先心病的家庭成員中得到驗證,進而對該突變進行了蛋白結(jié)構(gòu)同源建模分析及體外細胞功能研究。研究結(jié)果表明該突變導致蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生改變,可能通過上調(diào)下游靶基因ANF啟動子的活性而參與先心病的發(fā)病機制,拓寬了ASD 的基因突變譜,為先心病的發(fā)生機制提供了一點新思路,本課題組也將會在下一步的動物模型中對其功能進一步深入驗證和探討。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突

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