栝樓的組織培養(yǎng)

熊國宇， 來喜月， 陸海悅， 何克勤

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim)為葫蘆科栝樓屬, 多年生攀緣型草本植物, 別名瓜蔞、吊瓜、藥瓜，主產(chǎn)于安徽、山東、河南、河北、陜西等地，其全身均可藥用或食用[1-2]。其果實(shí)(全瓜蔞)有清熱滌痰的功效；種子(瓜蔞仁)可直接作為休閑食品或藥用；塊根(天花粉)是常用的中藥[3-4]，具有清熱生津、清肺潤燥的功效；皮(瓜蔞皮)可利氣寬胸、清熱化痰的功效[5-6]。

栝樓通常采用種子播種和塊根營養(yǎng)繁殖兩種方式。種子繁殖會(huì)造成雌雄比例嚴(yán)重失調(diào)，幼苗時(shí)期雌雄株沒有明顯的差異，很難區(qū)別，造成大量雄株浪費(fèi)，影響產(chǎn)量[7-8]；同時(shí)種子繁殖易造成種苗不齊、種質(zhì)混雜及品種退化等現(xiàn)象[9-10]。而采用塊根營養(yǎng)繁殖需許多的地下塊莖，由于塊根也是藥材，導(dǎo)致繁殖系數(shù)較低；同時(shí)根塊繁殖易傳播病蟲害及造成病毒的積累，尤其是根結(jié)線蟲病和根腐病，導(dǎo)致果實(shí)產(chǎn)量與品質(zhì)嚴(yán)重退化[11-13]。植物組織培養(yǎng)在保持原有品種的優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上，繁殖周期短、系數(shù)大，還不受外界環(huán)境條件的影響，加速良種的繁殖[14-15]。本試驗(yàn)以“皖蔞9號(hào)”莖尖為外植體，研究不同外源激素種類及濃度對(duì)其組織培養(yǎng)的影響，以期獲得高效離體再生體系，為栝樓的種苗繁殖及工廠化育苗提供技術(shù)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

栝樓品種為‘皖簍9號(hào)’，由安徽蚌埠清菲農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基本培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)條件 本試驗(yàn)采用基本培養(yǎng)基為MS、蔗糖30 g/L、瓊脂5 g/L，pH值調(diào)為6.0左右后分裝在組培瓶中，121 ℃高壓滅菌20 min,冷卻備用。接種后培養(yǎng)溫度為25 ℃左右，光照3 000 lx、12 h/d。

1.2.2 無菌苗的獲取 田間選取生長健壯的栝樓2 cm左右莖尖，先用自來水沖洗表面灰塵，再用洗衣粉溶液清洗，最后放超凈工作中用75%酒精和0.1%升汞消毒，具體處理時(shí)間見表1，用酒精和升汞消毒后分別用無菌水清洗4～5遍。將消毒好的莖尖放在解剖鏡下進(jìn)行生長點(diǎn)剝離，切取1 mm左右生長點(diǎn)接入基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每瓶接種1個(gè)，每處理接種30瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和成苗率。

1.2.3 莖尖再生的正交試驗(yàn) 在不同消毒劑處理試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取莖尖，洗滌，用75%酒精消毒40 s+0.1%升汞消毒6 min。將消毒好的莖尖放在解剖鏡下剝離1 mm左右生長點(diǎn)接入不同激素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，具體激素濃度見表2，每瓶接種生長點(diǎn)2個(gè)，每處理接種15瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)再生芽數(shù)。

1.2.4 莖段增殖 剪取莖尖再生無菌苗1 cm左右莖段接入不同處理的增殖培養(yǎng)基中，具體處理見表3～4，每處理接9瓶，3瓶1個(gè)重復(fù)，3次重復(fù)，每瓶接莖段4個(gè)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)再生芽數(shù)、株高和再生苗生長情況。

1.2.5 莖段生根 剪取莖尖再生無菌苗1 cm左右莖段接入不同處理的生根培養(yǎng)基中，具體處理見表5，每處理接9瓶，3瓶1個(gè)重復(fù)，3次重復(fù)，每瓶接莖段4個(gè)。培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)生根率、根數(shù)、根長和再生苗生長情況。

1.2.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 增殖倍數(shù)=再生苗總數(shù)/接種莖段總數(shù)×100%；生根率=再生苗生根總數(shù)/接種莖段總數(shù)×100%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel、DPS軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑處理對(duì)莖尖再生的影響

由表1可知，不同消毒時(shí)間處理對(duì)莖尖離體再生有極顯著的影響。當(dāng)75%酒精處理時(shí)間一定時(shí)，隨著0.1%升汞處理時(shí)間的延長，莖尖污染率逐漸降低，死亡率逐漸升高；當(dāng)0.1%升汞處理時(shí)間一定時(shí)，隨著75%酒精處理時(shí)間的延長，莖尖污染率、死亡率無規(guī)律性變化。處理T5的成苗率最高，為83.8%，與其他處理均達(dá)到了極顯著差異，其污染率、死亡率相對(duì)較低，分別為11.1%、5.1%。處理T1污染率最高，死亡率最低，分別為36.5%、2.4%；處理T9污染率最低，死亡率最高，分別為3.4%、38.4%；綜合考慮可得，T5(75%酒精40 s+0.1%升汞6 min)為最適莖尖外植體消毒組合。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)莖尖離體培養(yǎng)影響

2.2 正交試驗(yàn)對(duì)莖尖再生芽數(shù)的影響

由表2可知，極差R值最大為28.33，最小為8.67；6-BA濃度的變化對(duì)再生芽數(shù)影響最大，為主要影響因子；KT濃度的變化對(duì)再生芽數(shù)影響最??；4個(gè)影響因素主次順序?yàn)?-BA>IBA>NAA>KT。因素6-BA的3個(gè)水平的k值分別為103、74.67、80.33，即第一水平0.2 mg/L為最好水平；因素IBA的3個(gè)水平的k值分別為79.67、81.33、97.00，即第三水平0.2 mg/L為最好水平；因素NAA的3個(gè)水平的k值分別為77.00、94.00、87.00，即第二水平0.03 mg/L為最好水平；因素KT的3個(gè)水平的k值分別為80.33、88.67、89.00，即第三水平1.5 mg/L為最好水平。

表2 再生芽數(shù)的極差分析

2.3 不同激素組合對(duì)栝樓莖段增殖的影響

2.3.1 不同濃度6-BA和NAA組合對(duì)增殖的影響 由表3和圖1可得，不同濃度6-BA、NAA組合對(duì)再生苗增殖均有影響，增殖倍數(shù)和株高相比對(duì)照均達(dá)到了顯著性差異。當(dāng)6-BA濃度相同時(shí)，隨著NAA濃度的增加增殖倍數(shù)先增大后減小，株高無規(guī)律變化，高濃度的NAA對(duì)增殖有一定抑制作用；當(dāng)NAA濃度相同時(shí)，隨著6-BA濃度的增加增殖倍數(shù)先減小后增加，所試范圍內(nèi)高濃度的6-BA對(duì)增殖有促進(jìn)作用。處理N8再生苗的增殖倍數(shù)、株高分別為5.42、2.12 cm，莖節(jié)正常伸長、葉色淡綠；增殖倍數(shù)與各處理達(dá)到了顯著性差異且最大，株高與處理N1、N2、N3、N4、N6、N9差異不顯著。因此，最適栝樓莖段增殖激素組合為0.4 mg/L 6-BA和0.06 mg/L NAA。

表3 不同濃度6-BA、 NAA組合對(duì)增殖的影響

圖1 栝樓增殖的不同處理

2.3.2 不同濃度6-BA和IBA組合對(duì)增殖的影響 由表4和圖1可知，不同濃度6-BA 、IBA組合對(duì)再生苗增殖均有不同程度的影響，增殖倍數(shù)和株高相比對(duì)照均達(dá)到了顯著性差異，各處理之間增殖倍數(shù)和株高差異比較小。處理I4(6-BA 0.2 mg/L、IBA 0.02 mg/L)的增殖倍數(shù)、株高分別為3.25、2.29 cm，增殖倍數(shù)與處理I1、I2、I3、I6、I7、I9均達(dá)到了顯著差異，株高與各處理間差異不顯著。

相比6-BA 、NAA組合對(duì)增殖的影響，6-BA 、IBA組合的增殖系數(shù)普遍不高，但再生苗生長狀態(tài)普遍茁壯點(diǎn)。因此，篩選出較好促進(jìn)栝樓莖段增殖激素配方為0.4 mg/L 6-BA 和0.06 mg/L NAA組合。

表4 不同濃度6-BA、 IBA組合對(duì)增殖的影響

2.4 不同濃度生長素對(duì)生根的影響

由表5和圖2可知，添加不同濃度的NAA、IBA均能不同程度促進(jìn)栝樓生根，生根率均未達(dá)到100%，濃度過低或過高均抑制再生根的生長。NAA處理的整體生根率要高于IBA，其中A3(NAA為0.15 mg/L)的生根率最高，為95.1%，但再生苗生長質(zhì)量較弱，A2、A3處理根有部分增粗成畸形，不易移栽成活。IBA不同濃度處理的再生根生長較正常，側(cè)根較多，苗較大，其中B4(IBA為1.0 mg/L)處理的生根率相對(duì)較高，為92.2%，根數(shù)為5.3個(gè)，根長為7.6 cm，葉淡綠，苗較壯，為栝樓較適生根濃度。

表5 不同濃度的NAA、IBA組合對(duì)生根的影響

圖2 栝樓生根的不同處理

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究得出：75%酒精和0.1%升汞不同時(shí)間組合消毒處理對(duì)再生苗成苗率、污染率和死亡率均有明顯的影響，其中最適莖尖外植體消毒組合為75%酒精40 s+0.1%升汞6 min；不同植物生長素對(duì)莖段增殖、生根均有不同影響，6-BA、NAA組合整體優(yōu)于6-BA、IBA組合，且最適增殖濃度為(0.4 mg/L 6-BA)+(0.06 mg/L NAA)，增殖倍數(shù)較高，為5.42，莖節(jié)正常伸長、葉色淡綠；最適生根激素濃度為1.0 mg/L IBA，生根率較高，為92.2%，根數(shù)較多，為5.3個(gè)，葉淡綠，苗較壯。

組織培養(yǎng)中，外植體的初代培養(yǎng)消毒是一個(gè)難題，常用的消毒劑有次氯酸、酒精和升汞。黃崇成等[16]研究石豆蘭無菌材料的建立及離體培養(yǎng)初探得出升汞消毒外植體最適時(shí)間為10 min，這與本試驗(yàn)外植體消毒時(shí)間不同，可能是不同材料、不同部位的耐受能力不同。本試驗(yàn)材料是春天時(shí)選取生長在田間的健壯栝樓植株的莖尖，通過優(yōu)化適宜消毒時(shí)間和剝?nèi)∩L點(diǎn)的大小從而提高外植體培養(yǎng)效率。

植物生長調(diào)節(jié)劑有生長素和分裂素兩種，是組織培養(yǎng)中不可或缺的組成成分, 添加不同類型的生長調(diào)節(jié)劑能促進(jìn)植株不同類型的生長、分化，植物離體培養(yǎng)過程中，激素種類和濃度的確定因植物和培養(yǎng)部位而異。因此，每個(gè)植物的組培繁殖體系建立均需要進(jìn)行激素種類和濃度的試驗(yàn)篩選。蔡宣梅等[17]研究福建省道地瓜蔞組織培養(yǎng)體系的建立得出：最適頂芽誘導(dǎo)激素組合為(0.4 mg/L 6-BA)+(0.04 mg/L NAA)；最適宜的增殖激素組合為(0.6 mg/L 6-BA)+(0.05 mg/L NAA)；最適宜的生根激素組合(0.2 mg/L 6-BA)+(0.05 mg/L NAA)+(0.05 mg/L IBA)+(0.5 g/L活性炭)；鄭向麗等[18]研究激素水平對(duì)福建道地瓜蔞組培快繁的影響得出：最適宜的增殖激素為1.0 mg/L 6-BA，最適宜的生根激素為0.4 mg/L NAA。周玉麗等[19]研究根用芥菜子葉和下胚軸離體再生體系的建立得出：適宜不定芽增殖激素組合為(1.0 mg/L 6-BA)+(0.2 mg/L IAA)，最適生根激素為0.2 mg/L IBA。崔廣榮等[20]以莖段為外植體研究甜葉菊的組織培養(yǎng)得出最適增殖激素組合為(1.0 mg/L 6-BA)+(0.1～0.2 mg/L NAA)，最適生根激素為0.0～0.5 mg/L NAA或IBA。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究所用激素名稱一致，具體濃度不一致，可能是因?yàn)椴煌参锛巴恢参锏牟煌贩N對(duì)激素的耐受能力及敏感性不同造成的。

植物局部受到創(chuàng)傷刺激后，在適宜的條件下傷口處易形成愈傷組織。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)莖段增殖中莖基部形成較大的愈傷組織，對(duì)再生芽的生長和增殖產(chǎn)生一定抑制作用，愈傷在莖段基部切口形成并逐漸增大可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中添加的細(xì)胞分裂素濃度偏高或分裂素、生長素比例失衡。本試驗(yàn)下一步將開展向培養(yǎng)基中添加相關(guān)物質(zhì)抑制愈傷生長試驗(yàn)和分裂素、生長素濃度進(jìn)一步篩選試驗(yàn)，篩選出抑制愈傷形成、生長配方，為種苗的繁殖及工廠化育苗提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。