川栝樓瓤中次生代謝物組成及相對含量分析研究△

劉青，李珮，曾其國，馬藝沔，何春年，丁自勉*

1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草藥物質基礎與資源利用重點實驗室，北京 100193；3.成都師范學院，四川 成都 611130

栝樓TrichosantheskirilowiiMaxim是葫蘆科Cucurbitaceae栝樓屬，為多年生藥食兩用、雌雄異株草質藤本植物[1]，而川栝樓(川瓜蔞1號)為栝樓T.kirilowiiMaxim的一個品種，主要種植于四川省[2]。中醫(yī)稱栝樓為瓜蔞，其果實、果皮和種子均被《中華人民共和國藥典》收載，分別以瓜蔞、瓜蔞皮、瓜蔞仁(及炒瓜蔞仁)為藥用，功效各異[3]。綜合歷代本草記載，瓜蔞具有清肺潤燥、滌痰寬胸、利氣開郁、滌痰散結、甘潤解渴、潤燥滑腸、清熱消腫散結等功效(見表1)[4-6]。中醫(yī)用于胸痹證、消渴、腸燥便秘、乳癰等[7-9]?，F(xiàn)代中西醫(yī)結合用于治療冠心病、糖尿病等[10-15]。四川是栝樓的重要產(chǎn)區(qū)[16]，主要種植品種為“川瓜蔞1號”，也稱為“川栝樓”。川栝樓作為農(nóng)民藥用植物脫貧致富的新資源，產(chǎn)量巨大，在生產(chǎn)過程栝樓瓤通常作為廢棄物被拋棄，造成資源浪費和環(huán)境污染。對栝樓瓤的藥理作用及其成分的研究報道尚少，為了綜合利用川栝樓藥用資源，本研究通過對川栝樓不同部位的成分進行檢測，并將栝樓瓤與藥用部位的栝樓皮和栝樓仁進行比較分析，以揭示川栝樓瓤的差異化學成分及相對含量，為栝樓瓤的開發(fā)利用提供科學數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品環(huán)境概況

蒼溪縣地處四川盆地北緣、大巴山南麓之低、中山丘陵地帶，介于東經(jīng)105°43′～106°28′與北緯31°37′～32°10′，幅員2 346.46 km2。受米倉山、大巴山構造控制，地勢由東北向西南傾斜，山脈呈北、北東弧形走向，最高九龍山主峰海拔1 377.5 m，回水、石門、歧坪一線以南為低山深丘區(qū)，山丘多呈桌狀及臺階狀，沿江可見沖積層階地，境內江河縱橫，切割劇烈，地形復雜，嶺陡谷深，平壩、臺地、丘陵、低山、低中山及山塬地貌皆有[17]。低山丘陵最適宜川栝樓的生長，本研究樣品采集為蒼溪縣陵江鎮(zhèn)玉女村川栝樓生產(chǎn)基地的鮮果，儲藏并保鮮送中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所檢測分析。

1.2 樣品處理

將部分栝樓鮮果切開，分成皮、瓤、仁及全果4個部分作為樣品實驗(見圖1)，先將4類樣品用鼓風干燥箱在50 ℃下干燥36 h左右，栝樓仁、栝樓皮基本烘干，從干燥箱中取出，放冷，粉碎；栝樓瓤和全果含水量較多，將其轉移至真空干燥箱，在50 ℃下繼續(xù)干燥50 h，全果樣品取出后粉粹；栝樓瓤干燥后具有一定的黏度，轉移至冰箱中，在-20 ℃條件下放置2 h左右，用研缽將其搗碎，搗碎后的樣品栝樓、栝樓皮、栝樓瓤和栝樓仁分別用F、P、N和S進行分類編號。

1.3 儀器

Dionex UltiMate 3000(Thermo Fisher科技有限公司)；Acquity UPLC SynaptG2 HDMS系統(tǒng)(美國Waters公司)；AL204型梅特勒-托利多萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；超純水儀(Millipore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ5200DE型，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.4 試劑

甲醇、二氯甲烷(分析純，北京化工廠)；超純水(Millipore，法國)；甲醇(色譜純，Honeywell)；3，29-二苯甲?；闃侨嗜紝φ掌?成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度：98%，批號：PRF8112821)。

表1 瓜蔞不同部位的藥理作用

圖1 川栝樓樣品處理

2 方法

2.1 高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)含量測定

按照2015版《中華人民共和國藥典》(一部)栝樓含測項下進行檢測[3]。

2.1.1色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇∶水=93∶7；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；檢測波長：230 nm。

2.1.2對照品溶液配制 取 3，29-二苯甲?；闃侨嗜紝φ掌芳s1 mg，精密稱定，加入二氯甲烷配制對照品溶液，質量濃度為0.13 mg·mL-1。

2.1.3供試品溶液的制備 精密稱取栝樓各部位干燥粉末約1.0 g，置量瓶中，加入二氯甲烷至刻度線下約1 cm處，超聲提取30 min，取出，放冷，二氯甲烷定容至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS代謝物測定

2.2.1色譜條件 Waters HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)。流動相(A)為1%甲酸水，流動相(B)為乙腈，梯度洗脫程序(0～8 min，2%～25%B；8～10 min，25%～30%B；10～14 min，30%～100%B；14～15 min，100%～100%B；15～16 min，100%～2%B；16～19 min，2%～2%B)。柱溫為30 ℃，流速為0.3 mL·min-1。進樣體積2 μL。檢測波長：210～400 nm。

2.2.2質譜條件 采用電噴霧負離子檢測電離模式，霧化氣為高純度N2，碰撞氣為高純度He，質量掃描范圍：m/z100～1200。負離子模式錐孔電壓：40 V，毛細管電壓：2.4 kV，離子源溫度：100 ℃，脫溶劑氣溫度：350 ℃，脫溶劑氣流速：900 L·h-1，錐孔氣體流量：50 L·h-1，碰撞能量(CE)：20～40 V，LockMass：亮氨酸腦啡肽，m/z為554.261 5。

2.2.3提取方法 1)精密稱取栝樓各部位干燥粉末約1.0 g，置量瓶中，加入甲醇25 mL，超聲提取30 min，取出，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，備用；2)取一定量上述提取液混合均勻，得到質控(QC)溶液。

2.2.4數(shù)據(jù)處理 將超高效液相色譜-質譜聯(lián)用(UPLC-Q-TOF-MS)得到的樣品數(shù)據(jù)導入Waters Masslynx 4.1軟件中，在MakerLynx application manager Version 4.1編輯，進行峰識別、峰對齊、基線校正和歸一化等預處理，輸出三維數(shù)據(jù)矩陣(由保留時間、精確分子量和峰面積組成)，最后將得到的矩陣導入Simca-P軟件(13.0版本)進行主成分分析和偏最小二乘法判別分析等，對栝樓植物的不同部位進行模式識別，尋找組間差異較大的植物代謝物。

3 結果

3.1 栝樓果不同部位3，29-二苯甲?；闃侨嗜嫉暮糠治?/h3>

含量測定結果見表2，研究結果表明：栝樓及不同部位(栝樓皮、瓤、仁)中均含有3，29-二苯甲?；闃侨嗜糩18-19]，含量存在一定的差異，其中栝樓全果的平均質量分數(shù)為0.30%，瓤中平均質量分數(shù)最高為0.39%，皮和仁的平均質量分數(shù)為接近為0.29%和0.28%，顯然栝樓瓤的3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇含量最高，即栝樓瓤>栝樓>栝樓皮>栝樓仁。檢測結果顯示不同部位中3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇含量與栝樓成熟度有一定的關系，未完全成熟栝樓瓤中的3，29-二苯甲?；闃侨嗜假|量分數(shù)最高為0.42%，高于全果的含量，栝樓仁中的質量分數(shù)最低為0.25%；栝樓完全成熟時，栝樓仁中的3，29-二苯甲?；闃侨嗜嫉馁|量分數(shù)最高為0.36%，栝樓皮中的3，29-二苯甲?；闃侨嗜嫉馁|量分數(shù)最低為0.26%，即栝樓仁>栝樓瓤>栝樓>栝樓皮。

表2 栝樓果不同部位3，29-二苯甲?；闃侨嗜嫉暮?/p>

注：F為栝樓全果；P為栝樓皮；N為栝樓瓤；S為栝樓仁；1～4分別為代表4個不同栝樓果；其中：1～3號未完全成熟；4號完全成熟。*括號內值表示1～3號統(tǒng)計平均值。

3.2 栝樓果不同部位的差異代謝產(chǎn)物分析

3.2.1實驗的質控評估 首先使用無監(jiān)督的主成分分析(PCA)對QC樣本及其他實驗樣本進行分析。QC樣本成分相同，在PCA得分圖中應當聚集在一起。圖2的PCA得分圖顯示，QC樣本緊密聚集，表明實驗方法穩(wěn)定，系統(tǒng)重復性較好，因此對本實驗所采集的數(shù)據(jù)進行了下一步分析。

注：1.QC樣本；2.其他樣本。圖2 QC樣本與其他樣本PCA得分圖

3.2.2栝樓樣品不同部位代謝組學分析 不同部位的栝樓樣品通過UPLC-Q-TOF-MS分析所得基峰強度(BPI)色譜圖見圖3，圖中顯示栝樓的不同部位樣品的色譜圖有較明顯差異，但仔細對比發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)色譜峰相同，只是相對含量有差異；栝樓瓤中的次生代謝產(chǎn)物含量豐富，與栝樓皮和栝樓仁的次生代謝物相比而言，栝樓瓤中大多數(shù)均含有次生代謝物，只是相對含量高低不同，特別是在高極性部分(保留時間4.5 min以前)，色譜峰較多(但色譜峰形不好，可能為多種成分疊加造成)。

為了研究栝樓不同部位之間主成分的差異，本實驗利用統(tǒng)計學軟件Simca-P(13.0版本)對數(shù)據(jù)做進一步處理。將干燥處理的栝樓樣品按照不同部位分為3組，分別為栝樓瓤、栝樓皮和栝樓仁(n=3)，繼續(xù)分析栝樓瓤中的次生代謝產(chǎn)物，并分別進行兩兩比較，以尋找不同部位間的差異性次生代謝產(chǎn)物。

統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)栝樓瓤含有鳥嘌呤(C5H5N5O)和鳥苷(C10H13N5O5)，而栝樓皮中則未檢出；anillic acid/ isovanillic acid/4-hydroxy-2-methoxy-benzoic acid(C8H8O4)在栝樓瓤的含量小于栝樓皮；三萜皂苷(C38H56O13)的含量栝樓瓤大于栝樓皮(見表3)。

統(tǒng)計分析(見表4)發(fā)現(xiàn)在栝樓瓤含有三萜皂苷(C38H56O13)，而栝樓仁中則未檢出；在栝樓仁含有1，4-O-diferuloylsecoisolariciresinol(C40H42O12)，而栝樓瓤中則未檢出；鳥苷(C10H13N5O5)栝樓瓤的含量大于栝樓仁。

統(tǒng)計分析(見表5)發(fā)現(xiàn)在栝樓仁中含有1，4-O-diferuloylsecoisolariciresinol(C40H42O12) hanultarin(C30H34O9)和anillic acid/ isovanillic acid/4-hydroxy-2-methoxy-benzoic acid(C8H8O4)，而栝樓皮中則未檢出；在栝樓皮中含有vanillic acid、isovanillic acid、4-hydroxy-3-methoxy-benzoic acid(C8H8O5)，而栝樓仁中則未檢出。

注：從上至下依次為仁、皮、瓤。圖3 栝樓不同部位樣品UPLC-QTOF-MS分析BPI色譜圖

表3 栝樓瓤和栝樓皮的差異代謝物含量

序號tR[M-H]-VIP值化合物鑒定化學式皮/瓤12.210 2130.086 75.40??22.477 4150.043 11.75Guanine鳥嘌呤C5H5N5O+33.150 2164.071 04.31??43.720 2167.034 52.46vanillic acid/isovanillic acid/4-hydroxy-2-methoxy-benzoic acidC8H8O4?52.028 2180.066 02.18??66.467 6241.118 31.73+72.477 4282.083 92.80Guanosine鳥苷C10H13N5O5+82.205 0292.139 72.48+912.213 2329.232 72.27??107.712 3365.159 82.37?117.292 8381.190 92.36?1214.065 9452.277 34.37-134.788 6467.130 22.55??1413.762 9476.276 21.56-1514.154 8480.308 33.92-1613.804 1504.308 31.56-177.677 4529.229 12.86??1814.154 3540.329 03.68-1913.803 8564.330 11.77-2013.819 4614.330 22.49-2111.533 7719.363 81.82arvenin I/opercurins A三萜皂苷C38H56O13??2211.995 4761.374 18.99?2312.035 1763.389 33.65?2411.993 6807.379 41.55?

注：+表示瓤含有而皮中未檢出；-表示瓤中未檢出而皮含有；**表示瓤/皮>1，*表示瓤/皮<1，下同。

表4 栝樓瓤和栝樓仁的差異代謝物含量

續(xù)表4

表5 栝樓仁和栝樓皮的差異代謝物含量

3.2.3PCA分析及載荷矩陣 用Masslynx 4.1分析處理后。將其質荷比、保留時間和峰面積組成的三維矩陣導入Simca-P軟件(13.0版本)進行下一步分析，結果見圖4。

通過對栝樓3個不同部位(皮、瓤和仁)的代謝組學分析，可知栝樓不同部位的次生代謝產(chǎn)物有明顯差別(見圖4)，栝樓(N：瓤，P：皮)樣品PCA分析圖 PC1：74.6%，PC2：12.9%；栝樓(S：仁，N：瓤)樣品PCA分析圖 PC1：72.2%，PC2：16.8%；栝樓(S：仁，P：皮)樣品PCA分析圖PC1：68.9%，PC2：18.9%。這些差別在PCA分析載荷矩陣投影圖也得以體現(xiàn)，主要是化學成分的相對含量存在差異。

4 討論

本研究基于栝樓化學成分含量測定和代謝組學進行分析，研究結果表明：栝樓瓤中含有較高的3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇成分；其次，發(fā)現(xiàn)栝樓瓤中成分雖然與皮和仁差異較大，但也含有豐富的與皮、籽相同的成分；再則，系統(tǒng)地揭示出栝樓不同部位(皮、瓤和仁)化學成分的差異性，進一步為栝樓藥理活性的研究奠定了理論基礎，同時也對栝樓瓤的開發(fā)利用具有科學的指導意義。

本研究結果能夠對栝樓中藥資源利用予以啟示，栝樓皮和栝樓仁作為2味藥材在方劑中分開使用，其傳統(tǒng)應用的功效不同，本實驗結果也表明它們的化學成分和含量有所不同，功效不同可能與之有關。另外，栝樓瓤除作為全果一起藥用外，生產(chǎn)基地把栝樓瓤作為廢棄物棄之， 既浪費藥用植物資源，又污染當?shù)丨h(huán)境，栝樓瓤次生代謝產(chǎn)物與皮及仁中差異明顯。栝樓果不同部位間的藥理藥效是否存在差異，栝樓瓤能否作為栝樓皮或栝樓仁藥用的替代品，有待更多的學者深入研究?；诒狙芯康慕Y果和相關文獻記載，針對栝樓瓤的開發(fā)利用，建議重點考慮食品和化妝品[20-21]方向，特別是化妝品可能是優(yōu)先考慮的，一方面栝樓(瓜蔞)在歷史上有用于美白保膚的記載，另一方面主要是化妝品是外用產(chǎn)品，其安全性要求低于內服要求。

注：A.栝樓(N：瓤、P：皮)樣品PCA分析圖；B.栝樓(瓤、皮)PCA分析載荷矩陣投影圖；C.栝樓(S：仁、N：瓤)樣品PCA分析圖；D.栝樓(仁、瓤)PCA分析載荷矩陣投影圖；E.栝樓(S：仁、P：皮)樣品PCA分析圖；F.栝樓(仁、皮)PCA分析載荷矩陣投影圖。圖4 栝樓瓤、皮和仁不同部位間PCA分析圖與其載荷矩陣投影圖