微生物源脂肽粗提物對克菌丹和代森錳鋅增效活性

余 利, 王錦程, 謝亞杰, 黃偉東, 段海明

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

玉米大斑病是世界玉米種植產(chǎn)區(qū)廣為發(fā)生的重大病害,在我國曾于20世紀70年代、90年代和21世紀初暴發(fā)流行,造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。隨著品種的更新?lián)Q代加速,加之大部分種質(zhì)資源對大斑病表現(xiàn)為感,完全依靠抗病育種尚不能完全奏效,大斑病暴發(fā)流行的風(fēng)險仍然較大[2]。目前,玉米大斑病的防治藥劑包括丙森鋅、代森銨、吡唑醚菌酯、枯草芽孢桿菌等單劑和吡唑醚菌酯與氟唑菌酰胺、戊唑醇、氟環(huán)唑、氯氟醚菌唑、稻瘟靈的復(fù)配劑以及戊唑醇和肟菌酯、丁香菌酯、丙環(huán)唑的復(fù)配劑為主[3]。玉米是我國三大種植作物之一,為確保玉米的高效生產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全,殺菌劑的使用面積較大,但是化學(xué)農(nóng)藥長期應(yīng)用引起的環(huán)境污染、抗性與農(nóng)產(chǎn)品安全等問題日益嚴重,化學(xué)藥劑的減量控害技術(shù)已成為當(dāng)今最為緊迫的研究熱點之一[4-5]。篩選高活性的化合物和其它環(huán)境友好的防治措施替代是實現(xiàn)藥劑減量化的重要手段,但篩選高活性化合物的難度大,生物防治還不能夠適應(yīng)種植環(huán)境的多樣性而不穩(wěn)定,物理防控手段難以在玉米田廣泛使用[6]。本研究在前期篩選到一株對植物病原菌具有強抑制活性的生防菌株SJ06,對其所產(chǎn)脂肽類物質(zhì)的抑制活性和化學(xué)殺菌劑的復(fù)配劑開展了相關(guān)研究,旨在為玉米大斑病的可持續(xù)防控和化學(xué)藥劑的減施提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)SJ06為安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院實驗室保存;供試化學(xué)殺菌劑克菌丹和代森錳鋅分別由安徽錦江農(nóng)化有限公司和山東先達農(nóng)化股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 對峙培養(yǎng)法測定拮抗菌SJ06對玉米大斑病菌的抑制活性 對峙培養(yǎng)抑制活性采用菌餅五點法測定[7]。

1.2.2 不同稀釋倍數(shù)脂肽對玉米大斑病菌的抑制活性測定 參照顧康博等[8]方法制備脂肽粗提物。分別采用濾紙片法和菌絲生長速率法測定脂肽粗提物對玉米大斑病菌的抑制活性[9]。濾紙片法測試濃度分別為脂肽原液和2倍、4倍、8倍和16倍稀釋液,每個濾紙片(直徑5 mm)上藥劑加入量為10 μL。菌絲生長速率法測定脂肽粗提物的毒力,濃度設(shè)置為0.100、0.125、0.167、0.250、0.500 μL/mL;克菌丹濃度分別設(shè)置為1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L;代森錳鋅濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L。接種完畢后轉(zhuǎn)入26 ℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)96 h,采用十字交叉法測量菌落直徑,采用SPSS 22.0軟件求出EC50、毒力回歸方程和R2。

1.2.3 Wadley公式法測定脂肽粗提物和化學(xué)殺菌劑的增效系數(shù) 脂肽粗提物與克菌丹以1∶100(質(zhì)量比)的比例復(fù)配,復(fù)配濃度為1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L;脂肽粗提物與代森錳鋅以1.5∶100的比例復(fù)配,復(fù)配濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L;運用SPSS 22.0軟件求出混劑的毒力回歸方程、EC50,采用Wadley公式法求出增效系數(shù)(SR)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌SJ06對玉米大斑病菌的對峙培養(yǎng)結(jié)果

由圖1可見，拮抗菌株SJ06和玉米大斑病菌在PDA平板上對峙培養(yǎng)96 h，可以發(fā)現(xiàn)對照已長滿整個培養(yǎng)平板，而拮抗處理的玉米大斑病菌生長勢較弱，具有明顯的抑菌帶。拮抗菌SJ06對玉米大斑病菌具有優(yōu)異的抑制效果，抑制率達89.2%±0.46%。說明拮抗菌在PDA培養(yǎng)基生長過程中能夠分泌對病菌抑制效果較強的抗生素或拮抗蛋白等活性代謝物質(zhì)，活性物質(zhì)以拮抗菌培養(yǎng)菌落為中心向周圍擴散，玉米大斑病菌絲的生長受到活性物質(zhì)抑制作用而生長速率減小。脂肽類抗生素是芽孢桿菌代謝物中較為重要的一類，下面以菌株SJ06產(chǎn)生的脂肽類抗生素開展抑菌活性研究。

2.2 不同稀釋倍數(shù)脂肽粗提物對病菌的抑制活性

采用濾紙片法和菌絲生長速率法2種方法,測定不同稀釋倍數(shù)的脂肽粗提液的抑菌活性。由表1可見,濾紙片法測定脂肽粗提物原液對玉米大斑病菌的抑制率達83.73%,稀釋16倍對病菌的抑制率為59.64%,抑制效果優(yōu)異。由表2可見,菌絲生長速率法測定得出,脂肽粗提物濃度從0.100 μL/mL增至0.500 μL/mL對玉米大斑病菌的抑制率分布在27.87%和71.03%之間,通過SPSS 22.0軟件分析得出,脂肽粗提物對玉米大斑病菌的EC50達0.23 μL/mL,毒力回歸方程為y=1.78x+1.15(R2=0.95)。

2.3 低劑量脂肽粗提物對克菌丹和代森錳鋅抑制大斑病菌的促進效果

經(jīng)SPSS 22.0軟件分析得出,克菌丹對玉米大斑病菌的毒力回歸方程為y=1.29x-0.98(R2=0.96),EC50為5.78 μg/mL;代森錳鋅對病菌的毒力回歸方程為y=1.78x-1.61(R2=0.95),EC50為8.04 μg/mL。脂肽粗提物和克菌丹質(zhì)量比為1∶100下的毒力回歸方程為y=1.41x-0.73(R2=0.96),EC50為3.27 μg/mL。經(jīng)Wadley公式法計算得出其增效系數(shù)SR=1.78>1.50,表現(xiàn)為增效作用(表3、圖2)。代森錳鋅和脂肽粗提物質(zhì)量比為100∶1.5時具有較強的增效效果,其毒力回歸方程為y=1.02x-0.69(R2=0.95),EC50為4.68 μg/mL,增效系數(shù)SR為1.74>1.50,表現(xiàn)為增效作用(表4、圖3)。

表3 脂肽粗提物和克菌丹復(fù)配(質(zhì)量比1∶100)對玉米大斑病菌的抑制效果

圖2 脂肽粗提物和克菌丹復(fù)配劑對玉米大斑病菌的抑制效果

表4 脂肽粗提物和代森錳鋅復(fù)配(質(zhì)量比1.5∶100)對玉米大斑病菌的抑制效果

克菌丹和代森錳鋅同屬有機硫類保護性殺菌劑，其中克菌丹對玉米大斑病菌的抑制效果要高于代森錳鋅。研究發(fā)現(xiàn)，在脂肽類粗提物占比較低時，脂肽對上述2種殺菌劑具有協(xié)同增效作用尚不明確。脂肽類粗提物一般由表面活性素(surfaction)、豐原素(fengycin)和伊枯草菌素(iturin)等組成，至于何種脂肽類物質(zhì)(或混合物)在增強克菌丹和代森錳鋅的抑菌活性方面發(fā)揮主導(dǎo)作用，應(yīng)開展脂肽類物質(zhì)的分離純化鑒定，并再次開展分離得到的單一活性脂肽成分和上述2種化學(xué)殺菌劑復(fù)配劑的抑菌效果評價，最終得到發(fā)揮主要協(xié)同抑菌活性作用的脂肽成分。

圖3 脂肽粗提物和代森錳鋅復(fù)配劑對玉米大斑病菌的抑制效果

3 結(jié)論與討論

玉米大斑病主要為害葉片,造成光合效率下降,嚴重影響玉米產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量[11]。芽孢桿菌是一類防治植物病害的重要生防資源[12],其中枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌等生防菌報道較多,主要以產(chǎn)生抗菌素、抗菌蛋白與脂肽類抗生素等方式發(fā)揮拮抗效應(yīng),產(chǎn)生的代謝物在病害生物防控中發(fā)揮了重要作用。脂肽粗提物可作為多種植物病菌的抑制劑,而且其對pH、溫度和有機溶劑等外界條件表現(xiàn)較高的穩(wěn)定性[13-14],但由于其固有屬性,如產(chǎn)率低、分離純化步驟繁瑣等限制因素導(dǎo)致其開發(fā)應(yīng)用成本較高,阻礙了脂肽粗提物作為農(nóng)藥登記而大規(guī)模使用的進度[15]。因此,研究脂肽低劑量下的使用技術(shù)對于降低藥劑的使用成本,推動現(xiàn)有常見農(nóng)藥減施增效具有重要作用。王文橋等[16]報道枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BAB-1與不同農(nóng)藥進行交替噴施對番茄灰霉病的防效達86.90%,其防治效果明顯高于單劑;劉曉妹等[17]研究表明,絕大多數(shù)的生防菌與化學(xué)藥劑在防治芒果炭疽病方面具有協(xié)同作用。生防活體和化學(xué)藥劑相互增效的決定因素其本質(zhì)大多為菌株所產(chǎn)代謝物和化學(xué)殺菌劑由于作用靶標(biāo)以及抑菌生理生化機制存在較大差異性,相互配合而起到增效作用[18]。本研究得出的脂肽粗提物和克菌丹、代森錳鋅2種藥劑的協(xié)同作用具有較大的利用價值。然而,考慮到田間防治效果與室內(nèi)試驗的環(huán)境條件存大較大差異性,其防效還有待田間試驗進一步驗證。

KIM等[19]研究表明,解淀粉芽孢桿菌JCK-12所產(chǎn)脂肽粗提物能夠顯著增強異菌脲、咯菌腈、苯菌靈、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇等對禾谷鐮孢的抑菌效果,抑菌效果提升的原因是脂肽可致使細胞壁受到損害、細胞膜透性增大,最終導(dǎo)致病菌對藥劑的吸收增強(或外排減少)。本研究通過藥劑復(fù)配試驗得出脂肽粗提物在占比較低的情況下對克菌丹、代森錳鋅起到一定的殺菌提升效果,可以推測低劑量脂肽就能夠增加玉米大斑病菌的細胞膜的透性,使更大量的克菌丹、代森錳鋅藥劑透過細胞膜而起到抑菌作用,從而在同等施藥濃度下對玉米大斑病菌的抑制活性增強,達到化學(xué)藥劑減施增效的目的。本研究的結(jié)果對于解淀粉芽孢桿菌SJ06產(chǎn)脂肽的下一步開發(fā)利用和上述2種化學(xué)藥劑的減量使用均具有潛在利用價值。同時考慮到脂肽作為農(nóng)藥開發(fā)存在的難度和滯后性,可以嘗試利用該菌株開發(fā)成為抗病功能肥料和化學(xué)藥劑復(fù)配使用或間隔使用。