一測多評法測定唐古特大黃中蒽醌類成分的含量

王君梅 郭玫 王志旺 曹強 郭亞菲 寇仁博 甘玉偉

摘要 [目的]建立唐古特大黃中蒽醌類成分的一測多評（QAMS）含量測定方法。[方法]采用HPLC，以大黃素為參照物，建立其與蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的相對校正因子，分別采用一測多評法和外標法測定唐古特大黃中蒽醌類成分的含量，并比較2種方法測定結果的差異。[結果]一測多評法與外標法測定的唐古特大黃中蒽醌類成分含量的RSD均小于3%，且2種方法之間沒有顯著性差異。[結論]一測多評法測定唐古特大黃中蒽醌類成分的含量穩(wěn)定準確，可有效、快速地評價唐古特大黃的質量，以提高唐古特大黃的質量。

關鍵詞 唐古特大黃;一測多評法;蒽醌類成分;含量測定;質量評價

中圖分類號 R284? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）11-0169-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.044

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Determination of Content of Anthraquinones in ?Rheum tanguticum ?by Quantitative Analysis of Multi-components by Single-marker

WANG Jun-mei1， GUO Mei1，2， WANG Zhi-wang1，3 et al

（1. Gansu University of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou，Gansu 730000;2. Provincial Key Laboratory of Chinese （Tibetan） Pharmaceutical Chemistry and Quality Research in Universities of Gansu Province， Lanzhou，Gansu 730000;3. Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine of Gansu Province， Lanzhou，Gansu 730000）

Abstract [Objective]To establish a method for the determination of anthraquinones in ?Rheum tanguticum ?by quantitative analysis of multi-components by single-marker（QAMS）. [Method]Using HPLC， with emodin as reference， the relative correction factor of aloe-emodin， rhein， chrysophanol and physcione was established， the contents of anthraquinones in ?Rheum tanguticum ?were calculated by QAMS and external standard method（ESM）， and compared the differences of results between the two methods. [Result]The RSD values of effective components of ?Rheum tanguticum ?determined by QAMS and ESM were both less than 3%， indicating that there was no significant difference between the two methods. [Conclusion]The content of anthraquinones in ?Rheum tanguticum ?was determined by QAMS， which was stable and accurate， and could be used to evaluate the quality of ?Rheum tanguticum ?effectively and quickly， so as to improve the quality of ?Rheum tanguticum .

Key words ?Rheum tanguticum ;Quantitative analysis of multi-components by single-marker（QAMS）;Anthraquinones;Content determination;Quality evaluation

大黃為蓼科植物掌葉大黃（ Rheum palmatum ?L.）、唐古特大黃（ Rheum tanguticum ?Maxim.ex Balf.）或藥用大黃（ Rheum officinale ?Baill.）的干燥根和根莖[1]，主要含有蒽醌、蒽酮、鞣質等藥效成分[2-3]，具有調節(jié)胃腸道、抗菌、抗炎止血等藥理作用[4-6]，與臨床療效密切相關，是評價大黃質量的指標性成分。在一定程度上，一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）可以減少中藥質量控制的檢測時間和分析成本，具有較高的實用性和可行性，因此被認為是中藥及其制劑質量控制的一個很好的選擇[7-9]。因此，該試驗采用一測多評法測定唐古特大黃中蒽醌類成分的含量，表征唐古特大黃主要藥效成分的內在比例關系[10]，并以化學性質相對穩(wěn)定且廉價易得的大黃素作為內參物計算相對校正因子，通過測定一個成分實現多個成分的同步測定，為唐古特大黃產地加工提供簡單的質量判斷依據和數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器。Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;DFT-200A型手提式高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）;KQ-700DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;ME204E型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.1.2 試劑。蘆薈大黃素（批號531B024）、大黃酸（批號109C021）、大黃素（批號1205A0210）、大黃酚（批號523D025）、大黃素甲醚（批號718C023）均購自中國食品藥品鑒定研究院;甲醇（天津市富宇精細化工有限公司）;磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）;碳酸氫鈉（煙臺市雙雙化工有限公司）;三氯甲烷[利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學有限公司];蒸餾水（實驗室自制）。

1.1.3 試材。18批唐古特大黃樣品，采自甘肅省甘南藏族自治州合作市和青海省，經甘南州科技開發(fā)交流中心甘玉偉農業(yè)技術推廣研究員鑒定為蓼科植物唐古特大黃（ Rheum tanguticum ?Maxim.ex Balf.）的根莖，樣品來源信息見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件。色譜柱為Agilent TC-C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）。0～15 min，85%A;體積流量1 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長254 nm;進樣量10 μL。

1.2.2

對照品的制備。依次精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚適量，配制濃度依次為15.60、15.60、15.60、16.00、8.40 μg/mL的對照品溶液。

1.2.3 供試品的制備。參照《中華人民共和國藥典》2020年版制備方法。

1.2.4 方法學考察。

1.2.4.1

標準曲線的繪制。分別精密吸取混合對照品1、2、3、4、5 mL于5 mL容量瓶中，加溶劑至刻度線，按“1.2.1”色譜條件進行測定，以質量為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4.2

精密度試驗。分別吸取混合對照品溶液10 μL，按“1.2.1”色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，并計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值。

1.2.4.3

穩(wěn)定性試驗。分別取供試品溶液（10號樣），按“1.2.1”色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h測定峰面積，計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD 值。

1.2.4.4

重復性試驗。取10號樣6份，按“1.2.3”方法分別制備成供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件，測定含量，并計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值。

1.2.4.5 加樣回收率試驗。精密稱取10號樣6份，分別精密加入各對照品等量，按“1.2.3”方法分別制備成供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件，測定峰面積，并計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率和RSD 值。

1.2.5 相對校正因子的確定。以化學性質相對穩(wěn)定且廉價易得的大黃素作為內參物計算相對校正因子（ f）。計算公式如下：

f=fkfs=CsAkCkAs

式中，Cs為內參物質量濃度，As為內參物色譜峰面積，Ck為待測成分質量濃度，Ak為待測成分色譜峰面積。

1.2.6

相對校正因子的系統(tǒng)耐用性評價。采用Agilent1260型高效液相色譜儀分別考察不同色譜柱[Agilent TC-C18（2）、Agilent Poroshell 120 EC-C18（2）、Thermo Hypersil-keystone ODS-2]（250 mm×4.6 mm，5 μm）、進樣量（5、10、15、20、25 μL）、流速（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min）、柱溫（25、30、35、40、45 ℃）對蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚相對校正因子（ f ）的影響，并計算RSD值。

1.2.7

樣品的含量測定。取18批不同產地的唐古特大黃，按“1.2.3”方法配制成供試品溶液各3份，按“1.2.1”色譜條件對樣品進行含量測定，通過標準曲線計算不同產地唐古特大黃中蒽醌類成分的含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

按“1.2.4.1”方法操作，結果發(fā)現（表2），蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種成分在相應范圍內均呈良好的線性關系（ R 2≥0.999 8）。

2.2 精密度試驗 按“1.2.4.2”方法操作，計算得到蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為0.93%、0.14%、0.80%、0.13%、0.04%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗

按“1.2.4.3”方法操作，計算得到蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為0.08%、0.09%、0.31%、0.14%、0.40%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.4 重復性試驗

按“1.2.4.4”方法操作，計算得到蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為1.83%、2.15%、2.77%、2.09%、2.66%，表明該方法重復性良好。

2.5 加樣回收率試驗

由表3可知，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為100.18%、100.10%、99.76%、99.93%、99.57%，RSD分別為0.62%、0.77%、1.03%、0.91%、1.14%，表明該方法準確度良好。

2.6 相對校正因子的確定

以大黃素為內參物，計算得出蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的相對校正因子分別為2.01、1.91、2.33、2.16。

2.7 相對校正因子的系統(tǒng)耐用性評價

采用Agilent1260型高效液相色譜儀分別考察不同色譜柱、進樣量、流速、柱溫對蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚相對校正因子的影響，計算得出RSD均小于3%（表4），表明相對校正因子的系統(tǒng)耐用性良好。

2.8 一測多評法與外標法測定樣品中蒽醌類成分含量

按照“1.2.7”方法操作，采用外標法（ESM）和一測多評法（QAMS）測定18批不同產地的唐古特大黃中蒽醌類成分的含量，并比較2種方法測定結果的差異，結果見表5。從表5可以看出，2種方法測定的唐古特大黃中蒽醌類成分含量的RSD均小于3%，且2種方法之間沒有顯著性差異，表明QAMS法在多成分質量評價應用中是可行的。

3 結論與討論

大黃是我國的大宗藥材，年需求量較大，目前野生大黃資源瀕危，栽培技術以及產地加工過程的不規(guī)范限制了大黃的產量和質量，因此，建立一種可以在產地對大黃進行快速的質量評價方法尤為重要。

該試驗通過一測多評法（QAMS）建立各待測物的相對校正因子，考察了進樣量、流速、柱溫、色譜柱對相對校正因子的影響，同時采用一測多評法和外標法測定唐古特大黃中蒽醌類成分的含量，并比較了2種方法測定結果的差異，結果顯示，2種方法測定的唐古特大黃中蒽醌類成分含量的RSD均小于3%，且2種方法之間沒有顯著性差異，表明QAMS法在多成分質量評價應用中是可行的，對唐古特大黃質量控制提供了試驗數據支撐，也為產地加工過程中唐古特大黃質量快速的綜合評價提供了新方法。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2020年版一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：24.

[2] 金麗霞，金麗軍，欒仲秋，等.大黃的化學成分和藥理研究進展[J].中醫(yī)藥信息，2020，37（1）：121-126.

[3] 王玉，楊雪，夏鵬飛，等.大黃化學成分、藥理作用研究進展及質量標志物的預測分析[J].中草藥，2019，50（19）：4821-4837.

[4] 苗培福.大黃的藥理作用及臨床應用分析[J].中國中醫(yī)藥現代遠程教育，2019，17（20）：61-62.

[5] 杜怡雯，馮江毅，胡黎文，等.大黃的藥理活性研究及臨床應用[J].中醫(yī)臨床研究，2018，10（25）：24-27.

[6] 田新瑋，鄭琦麗，王靜，等.大黃素對類風濕關節(jié)炎模型大鼠的治療作用及抗炎機制研究[J].江蘇中醫(yī)藥，2020，52（10）：84-87.

[7] GAO D，LI Y M，WANG N，et al.Establishment and validation of quantitative analysis of multi-components by a single marker for quality control of polygoni multiflori radix[J].Anal Methods，2016，8：7170-7176.

[8] LI F，WU H，SUN L L，et al.Quantitative analysis of multi-components by single marker and fingerprint analysis of ?Achyranthes bidentata ?Blume[J].J Chromatogr Sci，2018，56（7）：595-603.

[9] LI Y H，ZHANG Y M，ZHANG Z J，et al.Quality evaluation of ?Gastrodia elata ?tubers based on HPLC fingerprint analyses and quantitative analysis of multi-components by single marker[J].Molecules，2019，24（8）：1-16.

[10] FENG Y M，LI Q，YANG L，et al.Simultaneous determination of osthol，columbianadin，and isoimperatorin in ?Angelicae pubescentis ?Radix by high-performance liquid chromatography（HPLC）using a quantitative analysis of multi-components by single marker（QAMS）calibration method[J].Instrum Sci Techno，2020，48（5）：550-560.