刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠脂代謝及其誘發(fā)的氧化應(yīng)激的影響

安玉紅，朱德星，胡文森，李世杰

（貴州食品工程職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽 551499）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）是貴州省珍貴的優(yōu)勢特色資源，已在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用開發(fā)，發(fā)展前景可觀。刺梨作為貴州省十二大特色產(chǎn)業(yè)之一，目前全省栽培面積（300萬畝以上）和產(chǎn)量（在1 500萬kg以上）均居世界之首。隨著刺梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，刺梨加工后的剩余殘渣，一直都是困擾生產(chǎn)廠家的一個棘手問題。刺梨果實經(jīng)榨汁后，會殘留近50%的果渣，其直接食用口感較差，作為飼料效果不佳，鮮渣容易發(fā)霉腐爛不宜保存[1]。目前，關(guān)于刺梨果渣開發(fā)的研究較少，僅有關(guān)于刺梨果渣食品[2]、刺梨果渣飼料[3]、刺梨果渣膳食纖維[4-5]、提取多糖[6]等的研究，但其工業(yè)化應(yīng)用基本為零，大部分被丟棄，造成嚴(yán)重的資源浪費和環(huán)境污染。因此，對刺梨果渣的高值化利用技術(shù)進行研究，改善原料加工品質(zhì)，對于充分發(fā)揮刺梨資源的功能優(yōu)勢，實現(xiàn)刺梨副產(chǎn)物的高效利用，生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，減少生產(chǎn)排放及浪費，促進刺梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

植物多酚是果品蔬菜中含量較高的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于果品蔬菜的果、葉、果實中，是由沒食子酸及其聚合物的葡萄糖醇、黃烷醇及其衍生物的聚合物等多羥基類化合物的總稱[7]?，F(xiàn)有研究表明，植物多酚在減肥降脂、抗氧化、預(yù)防糖尿病、消炎、心腦血管疾病[8-10]等方面具有較好的生物活性。目前已開發(fā)的植物多酚種類較多，如蘋果渣多酚、茶葉多酚、柑橘皮渣多酚、葡萄皮渣多酚等。周宏炫等[11]研究表明，刺梨多酚可降低急性酒精中毒大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、甘油三脂、丙二醛的水平，提高抗氧化生理生化指標(biāo)，其作用機制與加速乙醇分解及增加機體抗氧化能力有關(guān)。然而，目前的研究中涉及刺梨渣及其多酚方面的較少。

因此，本文研究刺梨渣多酚（Rosa roxburghii Tratt.polyphenols，RRTP）對營養(yǎng)過剩誘發(fā)的機體肥胖發(fā)生、發(fā)展過程的干預(yù)作用，從生長狀況、生理生化指標(biāo)研究其作用效果，并從mRNA水平探討刺梨渣多酚對長期高脂膳食小鼠脂代謝紊亂及抗氧化應(yīng)激損傷的作用機制。為刺梨渣多酚的開發(fā)與應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨渣（鮮）：貴州奇昂生物科技有限公司；SPF級健康雄性小鼠[50只，體質(zhì)量18 g～20 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2015-0001]：遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司；基礎(chǔ)飼料：重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司；定量引物：深圳華大基因科技服務(wù)有限公司；RNases抑制劑（活性≥40 U/μL）、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（不含 DNA 內(nèi)切酶、外切酶、磷酸酯酶、RNA酶）：美國普洛麥格公司；熒光定量試劑、熒光定量膜、熒光定量板：Bio-Rad公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，過氧化氫酶（catalase，CAT）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；Amberlite XAD-2樹脂：美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；乙醚、甲醇、乙醇（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗儀（SG8200HPT）：上海冠特超聲儀器有限公司；微量紫外分光光度計（Nano Drop 1000）：美國Thermo公司；連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀（Spectra－Max190）：美國Molecular Devices公司；高速冷凍離心機（H1-16KR）：湖南可成儀器設(shè)備有限公司；熒光定量 PCR 儀（Light Cycler Nano）：Hoffmann-La Roche有限責(zé)任公司；紫外-可見光光度計（L5S）：上海儀電分析儀器有限公司；真空冷凍干燥機（CTFD-12S）：青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨渣多酚的制備

準(zhǔn)確稱取20 g刺梨果鮮渣，加入200 mL 60%的乙醇，采用超聲波輔助提?。囟?0℃、350 W、提取時間60 min）后，抽濾，再采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除濾液中的乙醇[11]。參考黃穎等[12]的方法提取純化刺梨渣多酚并凍干，得到凍干的刺梨渣多酚。采用福林酚法[13]測得刺梨渣多酚中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58.81%。

1.3.2 動物分組與處理

SPF級健康雄性小鼠50只，體質(zhì)量為18 g～20 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組（BC）、刺梨渣多酚低劑量組（RRTP-LD）、刺梨渣多酚中劑量組（RRTP-MD）、刺梨渣多酚高劑量組（RRTP-HD），每組 10只，低、中、高劑量分別按 50、100、200 mg/（kg bw）劑量進行灌胃（灌胃劑量參照周宏炫等[11]方法），空白組和模型組灌胃等劑量的生理鹽水。實驗期間，空白組給予基礎(chǔ)飼料，其余各組給予高脂飼料進行飼養(yǎng)，實驗時間60 d。實驗結(jié)束前12 h禁食不禁水，乙醚麻醉后、眼眶取血，收集血液，離分，放入-80℃冰箱保存，用于后續(xù)生理生化指標(biāo)分析。迅速解剖出肝臟、脂肪等，稱重后，分裝于離心管中，放入-80℃冰箱保存，用于后續(xù)生理生化指標(biāo)分析。高脂飼料配方參照美國營養(yǎng)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)《純化型生長繁殖飼料-AIN-93G》[14]配制，配方為基礎(chǔ)飼料78.8%、蛋黃粉10%、豬油10%、膽固醇1%、膽酸鹽0.2%。

1.3.3 體長、腰圍、臟器指數(shù)和Lee's指數(shù)

小鼠的體長（cm）：指從鼻尖到肛門的長度；小鼠的腰圍（cm）：用卷尺測定小鼠腹部經(jīng)過劍突與后肢間垂直距離中點一周的長度。臟器指數(shù)和Lee's指數(shù)計算公式如下。

1.3.4 生理生化指標(biāo)測定

參考試劑盒說明書，分別檢測血清中TC、MDA、HDLC、TG、LDL-C 的含量和 GSH-Px、T-SOD、CAT 的活性。

1.3.5 實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

采用Trizol總RNA提取試劑從肝臟組織樣品中提取總RNA，檢測OD260nm/OD280nm后，參照試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進行擴增。根據(jù)2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量[15]，引物序列如表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計與分析方法

實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0軟件one-wayANOVA進行統(tǒng)計分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果采用Duncan顯著性差異檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠生長狀況

刺梨渣多酚對小鼠生長狀況的影響如表2所示。

表2 刺梨渣多酚對小鼠生長狀況的影響（n=10）Table 2 Effects of polyphenol in Rosa roxburghii residue on the growth condition of mice（n=10）

實驗小鼠生長狀況可直觀反應(yīng)機體健康狀況。而體質(zhì)量、腰圍、Lee's指數(shù)和腹腔脂肪質(zhì)量是評價機體肥胖常用的參數(shù)。動物飼養(yǎng)期間，生長發(fā)育良好，無疾病、無死亡。與空白組相比，模型組小鼠終期體質(zhì)量、腰圍、Lee's指數(shù)和腹腔脂肪質(zhì)量均顯著增加（P＜0.05），分別增加了25.64%、23.48%、27.97%和68.84%，說明構(gòu)建的肥胖模型穩(wěn)定，可以作為對照組進行后續(xù)研究。與模型組比，各劑量組刺梨渣多酚均可降低實驗小鼠終期體質(zhì)量和腰圍；中劑量和高劑量降低Lee's指數(shù)和腹腔脂肪質(zhì)量顯著（P＜0.05），而低劑量可降Lee's指數(shù)和腹腔脂肪質(zhì)量，但不顯著（P≥0.05）。說明，刺梨渣多酚有抑制長期高脂膳食小鼠機體脂肪囤積的作用。

2.2 刺梨渣多酚對小鼠血清脂代謝的影響

刺梨渣多酚對小鼠血清脂質(zhì)水平的影響如表3所示。

表3 刺梨渣多酚對小鼠血清脂質(zhì)水平的影響（n=10）Table 3 Effects of polyphenol in Rosa roxburghii residue on the serum lipid level in mice（n=10）

長期高脂膳食會誘發(fā)機體脂代謝紊亂，而TG、TC、LDL-C及HDL-C水平，是機體脂代謝的關(guān)鍵生化指標(biāo)。由表3可知，與空白組相比，模型組小鼠血清中TG、TC、LDL-C含量顯著升高（P＜0.05），分別升高了53.42%、54.26%和171.23%，顯著降低HDL-C的含量（P＜0.05）。而刺梨渣多酚干預(yù)后，各劑量組均可降低小鼠血清中TG、TC、LDL-C的含量，升高HDL-C的含量。其中高劑量組和中劑量組可顯著降低TG、TC、LDL-C的含量（P＜0.05），顯著升高 HDL-C 含量（P＜0.05）；而低劑量可顯著降低 TC 含量（P＜0.05），顯著升高HDL-C含量（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，刺梨渣多酚可改善長期高脂膳食引起的實驗小鼠血清脂代謝紊亂。

2.3 刺梨渣多酚對小鼠血清氧化應(yīng)激的影響

刺梨渣多酚對小鼠血清氧化應(yīng)激的影響如表4所示。

表4 刺梨渣多酚對小鼠血清氧化應(yīng)激的影響（n=10）Table 4 Effects of polyphenol in Rosa roxburghii residue on the oxidative stress in mice serum（n=10）

現(xiàn)已研究表明，長期高脂膳食會誘發(fā)機體肥胖，而肥胖常伴隨著氧化應(yīng)激作用。由表4可知，與空白組相比，模型組MDA含量顯著升高了50.11%（P＜0.05），CAT活性、T-SOD活性，GSH-Px活性和GSH含量均顯著降低（P＜0.05）。而給予刺梨渣多酚干預(yù)后，低、中、高劑量組均可顯著降低 MDA 含量（P＜0.05），分別降低了6.17%、15.43%和18.32%；與模型組相比，低、中、高劑量組均可顯著升高CAT活性、GSH含量、T-SOD 活性和 GSH-Px活性（P＜0.05），其中 CAT活性分別升了11.08%、26.27%和30.37%，GSH含量分別升了26.77%、42.73%和57.83%，T-SOD活性分別升高了11.22%、27.39%和38.50%，GSH-Px活性分別升高了9.83%、16.84%和23.70%。以上結(jié)果表明，刺梨渣多酚可提高機體抗氧化能力，減少因長期高脂膳食引起的機體肝臟脂肪囤積而引起的氧化應(yīng)激損傷。

2.4 刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠肝臟脂代謝關(guān)鍵基因mRNA表達量的影響

刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠肝臟膽固醇代謝關(guān)鍵基因mRNA表達量的影響如圖1所示。

圖1 刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠肝臟膽固醇代謝關(guān)鍵基因mRNA表達量的影響（n=10）Fig.1 Effects of polyphenol in Rosa roxburghii residue on the mRNA expression of key genes in cholesterol metabolism in highfat diet mice liver（n=10）

肝臟作用脂質(zhì)合成、組配、重塑、分解等重要代謝器官，因此，在肥胖模型的研究中，肝臟是重要的研究部位。由圖1可知，與空白組相比，高脂膳食可顯著上調(diào)小鼠肝臟組織 HMG-CoAr、SREBP-1c、ACC、FASN mRNA表達量（P＜0.05），模型組，分別上調(diào)了34.18%、36.95%、29.02%和39.57%。給予刺梨渣多酚干預(yù)后，低、中、高劑量組均可顯著（P＜0.05）下調(diào) SREBP-1c和FASN mRNA表達量，其中SREBP-1c mRNA表達量分別下調(diào)了12.28%、15.15%和19.69%，F(xiàn)ASN mRNA表達量分別下調(diào)了11.00%、24.01%和29.04%；中、高劑量組HMG-CoAr和ACC mRNA表達量下調(diào)顯著（P＜0.05），而低劑量組有下調(diào)HMG-CoAr和ACC mRNA的趨勢，但不顯著（P≥0.05）。低、中、高劑量組下調(diào)HMG-CoAr mRNA表達量分別為4.86%、17.37%和30.10%，下調(diào)ACC mRNA表達量分別為5.71%、15.15%和19.69%。說明刺梨渣多酚可減少機體因高脂膳食機體肝臟膽固醇的合成，降低脂肪酸從頭合成速率。

2.5 刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠肝臟Nrf2/HO-1信號通路的影響

刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠肝臟Nrf2/HO-1信號通路的影響如圖2。

圖2 刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠肝臟Nrf2/HO-1信號通路的影響Fig.2 Effects of polyphenol in Rosa roxburghii residue on the Nrf2/HO-1 signaling pathway in high-fat diet mice liver

Nrf2是體內(nèi)調(diào)控氧化還原平衡的重要轉(zhuǎn)錄因子，可通過Nrf2/HO1通路發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激的作用。由圖2可知，高脂膳食可降低小鼠肝臟Nrf2、HO-1 mRNA表達量。與空白組相比，模型組Nrf2和HO-1 mRNA表達量分別下降了57.13%和70.39%。而給予刺梨渣多酚干預(yù)后，均可顯著上調(diào)Nrf2和HO-1 mRNA表達量（P＜0.05），低、中、高劑分別上調(diào) Nrf2 mRNA 表達量為40.71%、69.91%和87.85%，上調(diào)HO-1 mRNA表達量為39.34%、61.25%和77.39%。以上結(jié)果表明，刺梨渣多酚可通過激活Nrf2/HO-1信號通路，降低高脂膳食誘發(fā)的機體氧化應(yīng)激損傷。

3 討論

健康與養(yǎng)身，飲食是關(guān)鍵，不但要營養(yǎng)均衡，更要注重膳食平衡。隨著人們生活方式和生活習(xí)慣的改變，肥胖及其伴隨的慢性病，如糖尿病、心腦血管疾病、高血壓等嚴(yán)重影響著人們的健康生活。2016年，中國肥胖人數(shù)多達9 000萬，而且年輕化趨勢增加明顯[16-19]。肥胖是指體內(nèi)脂肪細胞數(shù)和脂肪組織增加及體脂率異常的現(xiàn)象，是由于大量脂肪在腹腔大網(wǎng)膜、皮下等組織囤積導(dǎo)致的，與遺傳、生理及生活方式有關(guān)，而高脂膳食、運動量少更容易導(dǎo)致機體肥胖[20]。機體的健康是各種關(guān)系的綜合，是相對平衡的動態(tài)過程，當(dāng)能量長期攝入大于消耗，過剩的能量就會以脂肪囤積。因此，采用長期高脂膳食小鼠或大鼠構(gòu)建肥胖模型是世界公認的方式[21-22]。本實驗結(jié)果表明，模型組小鼠體質(zhì)量、腰圍、Lee's指數(shù)和腹腔脂肪質(zhì)量均顯著（P＜0.05）高于正常飼料飼喂的空白組，說明模型構(gòu)建穩(wěn)定，這與以往的研究結(jié)果相一致[23-24]。

血液中的膽固醇主要以LDL-C和HDL-C的形式存在，HDL-C可以將血液中膽固醇運送到肝臟，并分解為膽酸后排泄，而LDL-C將血液中的膽固醇運送到周圍組織加以利用。而長期高脂膳食，會增加血清中游離脂肪酸、膽固醇及甘油三脂的含量[25-26]。因此，血清中的TC、TG、LDL-C和HDL-C水平反應(yīng)機體脂代謝情況，也是臨床上肥胖診斷的關(guān)鍵指標(biāo)[21]，長期高脂膳食會引起機體脂肪沉積，進而引起脂質(zhì)代謝異常[27-29]。目前，果品、蔬菜、茶及加工生產(chǎn)過程產(chǎn)生的果渣、邊角料、廢棄物等多酚類物質(zhì)的研究表明，天然植物多酚類物質(zhì)在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮著積極作用，但其作用機制復(fù)雜，靶點多，還需深入研究[30]。如蘋果多酚能改善高脂膳食大鼠脂代謝紊亂的作用，并對因高脂膳食誘發(fā)的動脈粥樣硬化具有很好的預(yù)防作用[31]；葡萄籽多酚能降低高脂膳食大鼠血漿載脂蛋白B100、TG和LDL-C的作用，改善高脂膳食機體脂代謝[32]；綠茶多酚對機體脂代謝紊亂的研究及應(yīng)用相對較成熟[33-35]。本實驗結(jié)果表明，模型組TC、TG及LDL-C的含量增加，而HDL-C的含量降低，刺梨渣多酚干預(yù)后可改善長期高脂膳食引起的血清脂代謝紊亂，其具體作用機制還有待進一步研究。肝臟作為機體脂代謝的重要場所，負責(zé)機體脂質(zhì)的合成、分解、排泄等。HMG-CoAr和SREBP-1c是膽固醇穩(wěn)態(tài)的最重要調(diào)節(jié)劑之一，也是膽固醇生物合成的限速酶[36-37]。高脂膳食可以增加HMG-CoAr和SREBP-1c的活性，使膽固醇在肝臟的合成增加，而刺梨渣多酚干預(yù)后，可下調(diào)HMG-CoAr和SREBP-1c的活性，抑制肝臟膽固醇的合成。這與文獻報道的石榴皮多酚[38]、山楂多酚[39]、綠茶多酚[40]等在脂代謝方面的研究結(jié)果相一致。而ACC和FASN是脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[41]，其活性的增加，可以提高脂肪酸的從頭合成速率。刺梨渣多酚可下調(diào)ACC和FASN的活性，降低脂肪酸的從頭合成速率，進而減緩食物中脂質(zhì)在機體內(nèi)的蓄積。

長期高脂膳食會造成機體營養(yǎng)過剩，引起細胞內(nèi)能量物質(zhì)（如游離脂肪酸、葡萄糖等）增加，促使線粒體代謝加快，氧自由基生成增多，破壞機體氧化-抗氧化平衡，進而誘發(fā)機體氧化應(yīng)激；而過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）又反作用于線粒體，損害其功能，進一步加劇機體的氧化應(yīng)激[42]。氧自由基和脂質(zhì)氧化的最終產(chǎn)物MDA，可直觀地反映機體氧化應(yīng)激損傷的強弱[43-44]；SOD、GSH-Px、GSH 和 CAT 在維持機體氧化-抗氧化平衡上起著關(guān)鍵作用，其中GSH可以清除機體氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量自由基[45]，GSH-Px可降低機體氧化應(yīng)激過程產(chǎn)生的過氧化物的量[46]，而CAT可將過氧化氫分解為水和氧[47]，減少其對機體的氧化應(yīng)激損傷。本實驗結(jié)果表明，刺梨渣多酚可降低高脂膳食小鼠血清中MDA的含量，升高CAT、T-SOD、GSHPx、GSH活性及含量，刺梨渣多酚可以提高機體抗氧化能力，減少因長期高脂膳食引起的機體肝臟脂肪囤積引起的氧化應(yīng)激損傷。Nrf2是體內(nèi)調(diào)控氧化還原平衡的重要轉(zhuǎn)錄因子，激活后的Nrf2可誘導(dǎo)HO-1降低細胞及線粒體內(nèi)自由基，減少氧化應(yīng)激損傷[48-50]。因此，Nrf2/HO-1信號通路成為抗氧化及治療各種疾病的新的靶點[51-52]。本實驗結(jié)果表明，刺梨渣多酚具有降低因高脂膳食誘發(fā)的機體氧化應(yīng)激的作用，其作用機制可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。

4 結(jié)論

本文研究刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠機體脂代謝的干預(yù)效果發(fā)現(xiàn)，長期高脂膳食會誘發(fā)機體脂代謝紊亂，而刺梨渣多酚可減緩因高脂膳食引起的小鼠體質(zhì)量增加、降低Lee's指數(shù)和腹腔脂肪質(zhì)量，可減少因長期高脂膳食引起的機體肝臟脂肪囤積引起的氧化應(yīng)激損傷。其作用機制與刺梨渣多酚下調(diào)SREBP-1c、FASN、HMG-CoAr、ACC mRNA 表達量，減少機體因高脂膳食引起機體肝臟膽固醇的合成，降低脂肪酸從頭合成速率有關(guān)。另外，刺梨渣多酚可通過激活Nrf2/HO-1信號通路，降低高脂膳食誘發(fā)的機體氧化應(yīng)激損傷。