miR-145對血管平滑肌細胞生物活性及SM22α mRNA表達的作用*

曾丁鄰 吳興森 查慶春 李景輝△ 丘智煌

（1 漳州正興醫(yī)院心血管內(nèi)科，漳州 363000；2 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福州 350005）

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）與血管正常功能聯(lián)系密切，具有較強的可塑性、可收縮及分泌功能。VSMC在正常情況下，表現(xiàn)為收縮型，只有在血管受到損傷或受到一些生物刺激時會轉(zhuǎn)化為合成表型，VSMC增殖和遷移[1-4]，并分泌細胞外基質(zhì)，導(dǎo)致血管壁增厚。高血壓等增殖性血管疾病中均存在VSMC的表型轉(zhuǎn)換。miR-145是一種小RNA分子[5]。研究表明miR-145與VSMC表型轉(zhuǎn)換聯(lián)系甚密[6]。VSMC增殖會使細胞外的分泌物增加，肌動蛋白減少[7]。另外，miR-145表達量的增多或減少可使VSMC發(fā)生分化或凋亡[8]。在血管壁，miR-145主要集中于VSMC中，在成纖維細胞中的表達極少[9]。SM22α又稱轉(zhuǎn)凝蛋白，為VSMC的特異性蛋白，是細胞衰老的標(biāo)志物，在VSMC中發(fā)揮重要的作用[10-11]。目前，miR-145對VSMC、SM22α的作用研究較少，因此，本研究探討miR-145對VSMC生物活性的影響以及對SM22α表達的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗分組

VSMC來自湖南豐輝公司，實驗分為3組，增殖VSMC組（增殖組）、增殖VSMC+轉(zhuǎn)染miR-145-NC組（空載體組）和增殖VSMC+轉(zhuǎn)染miR-145模擬物組（增殖轉(zhuǎn)染組）。

1.2 實驗試劑與器材

胎牛血清購自鄭州德寧生物公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購自海門市春博實驗器材公司；MTT溶液購自上海樊克生物公司；流式細胞儀購自上海實維試驗器材公司；酶標(biāo)儀購自南京德鐵實驗器材公司；胰蛋白酶購自濟南允誠生物公司；Primer 5.0 軟件購自廣州伯信生物科技公司。

1.3 細胞的培養(yǎng)及增殖

RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）于37.2℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，常規(guī)傳代，取第3代細胞進行實驗，然后將其調(diào)整為濃度1×108個/L接種于培養(yǎng)瓶（52 mL）中，RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，換含100 μg/L IL-1的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d后傳代，細胞密度為1×105個/mL，重復(fù)培養(yǎng)1 d后，更換無血清培養(yǎng)液后再培養(yǎng)1 d，PBS清洗，進行實驗。

增殖轉(zhuǎn)染組miR-145的轉(zhuǎn)染：將細胞接種于6孔板內(nèi)，至細胞到65%匯合時，用lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染50 nmol/L相應(yīng)的RNA mimics，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后即可進行后續(xù)實驗。 空載體組轉(zhuǎn)染miR-145-NC空載體，增殖組常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR檢測各組VSMC中SM22αmRNA、miR-145的表達

TRIzol法提取各組VSMC細胞總RNA，Primer 5.0 軟件設(shè)計合成引物。 將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA進行熒光反應(yīng)實驗。所有反應(yīng)嚴(yán)格按照反應(yīng)的條件進行擴增，PCR 反應(yīng)條件： 94℃ 5 min； 94℃3 min 、56℃ 1 min、72℃ 1 min，72℃ 5 min，終止反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物（5 μL）進行電泳分析（瓊脂糖凝膠1.5%）。以GAPDH為內(nèi)參，共40個循環(huán)，計算方法用2-△△Ct法進行分析，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 免疫印跡檢測細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白cyclin E、細胞周期依賴性抑制蛋白p27蛋白水平

將各組VSMC進行裂解，提取核蛋白，并對核蛋白的濃度進行測量，分裝后，-20℃保存。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進行混均，按照4：1的比例進行，將蛋白溶液煮沸變性，電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉60 min。一抗按1：150稀釋后孵育過夜，后TTBS漂洗，10 min/次，共3次；二抗稀釋，封閉60 min，將PVDF膜取出后重復(fù)上述漂洗，DAB顯色后照相，計算其蛋白表達含量。

1.6 Transwell小室檢測VSMC侵襲能力

將增殖組、空載體組組、增殖轉(zhuǎn)染組細胞（1×105個/mL）接種于6孔板中，將50 mg/L的基質(zhì)膠稀釋后加入小室上層，37℃呈凝膠狀態(tài)，上室中加入細胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基，37.5℃，培養(yǎng)2 d，取出培養(yǎng)基，拭去殘留細胞，現(xiàn)配結(jié)晶紫，每孔500 μL，將小室放入，25℃染色30 min，PBS清洗1次，稍晾干。顯微鏡觀察，每個樣本連續(xù)選5個清晰視野進行數(shù)量統(tǒng)計，然后計算平均數(shù)。

1.7 MTT檢測VSMC活力

將各組VSMC細胞密度調(diào)整為6×103個/mL接種到96孔板中，37.2℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細胞的密度培養(yǎng)到50%時，更換培養(yǎng)基，24 h后加人MTT培養(yǎng)4 h，使用酶聯(lián)免疫檢測儀測每孔在12、24、48、72 h 4個時間點的吸光度 （A） 值。

1.8 流式細胞儀檢測VSMC凋亡率

胰酶消化各組VSMC，完全培養(yǎng)基終止；PBS清洗，310 g離心5 min后棄上清，Binding Buffer（結(jié)合緩沖液） 500 μL重 懸，Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL混勻，常規(guī)孵育10 min，流式細胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，增殖組、空載體組、增殖轉(zhuǎn)染組3組的SM22α mRNA 的表達、VSMC活力、增殖等結(jié)果采用±s表示，行方差分析檢驗（單因素分析采用單因素方差分析，不同時間點比較采用重復(fù)測量方差分析），組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組VSMC SM22αmRNA、miR-145的表達

增殖組VSMC細胞中SM22α mRNA、miR-145水平與空載體組數(shù)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與增殖組及空載體組相比，增殖轉(zhuǎn)染組miR-145、SM22α mRNA表達顯著升高（P＜0.05），說明miR-145轉(zhuǎn)染成功，還可上調(diào)SM22α mRNA表達（圖1）。

圖1 各組SM22α mRNA、miR-145水平對比

2.2 Cyclin E、p27蛋白水平

增殖組VSMC中cyclin E、p27蛋白水平與空載體組cyclin E、p27蛋白水平相比無差異（P＞0.05）；增殖轉(zhuǎn)染組cyclin E蛋白水平低于其他2組（P＜0.05），p27蛋白水平高于其他2組（P＜0.05），組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染miR-145模擬物可降低cyclin E蛋白表達，促進p27蛋白表達（圖2）。

圖2 各組cyclin E、p27水平的比較

2.3 VSMC遷移能力

增殖組VSMC遷移數(shù)量（92.34±8.71）個與空載體組細胞遷移數(shù)量（89.75±8.82）個相比無差異（P＞0.05）；增殖轉(zhuǎn)染組細胞遷移數(shù)量（49.83±4.56）個明顯低于其他2組，組間比較差距有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染miR-145模擬物可抑制VSMC侵襲（圖3）。

圖3 各組VSMC遷移數(shù)量對比

2.4 VSMC活力

增殖組與空載體組VSMC在不同時間點的OD值均較為接近（P＞0.05）；增殖轉(zhuǎn)染組OD值在不同時間點均低于其他2組（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染miR-145模擬物可抑制VSMC增殖（表2）。

表2 各組VSMC在不同時間點的OD值比較（±s）

表2 各組VSMC在不同時間點的OD值比較（±s）

*P＜0.05 vs增殖組； #P＜0.05 vs空載體組

組別 12 h 24 h 48 h 72 h增殖組 0.87±0.07 0.95±0.11 1.23±0.14 1.45±0.31空載體組 0.86±0.06 0.93±0.10 1.21±0.12 1.42±0.29增殖轉(zhuǎn)染組 0.54±0.04*# 0.59±0.07*# 0.63±0.06*# 0.68±0.09*#F 62.79 27.29 55.60 18.18 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 VSMC凋亡率

增殖組VSMC凋亡率（2.43±0.33）%與 空載體組VSMC凋亡率（2.54±0.24）%數(shù)值接近，組間比較無差異（P＞0.05）；增殖轉(zhuǎn)染組VSMC凋亡率（9.47±0.96）%較其他2組升高（P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組VSMC凋亡情況

3 討論

VSMC的增殖會導(dǎo)致高血壓等疾病發(fā)生[12]。血管內(nèi)皮功能受到損傷會使生長因子等的表達發(fā)生異常，激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使VSMC增殖，產(chǎn)生血管疾病[13]。miR-145在VSMC表型調(diào)節(jié)過程中具有重要作用，且VSMC在多種血管病疾病中均有參與[14]。有關(guān)研究表明，狼瘡性腎炎腎內(nèi)血管中膜增厚時，顯示VSMC發(fā)生增殖，檢測miR-145后發(fā)現(xiàn)其表達異常[15]。miR-145在正常VSMC中含量較為豐富，可調(diào)控VSMC的表型擴張或收縮[16]。本研究主要對miR-145在血管平滑肌中的作用以及對SM22α的影響進行分析。SM22α mRNA、miR-145在增殖組與空載體組中水平較低，通過轉(zhuǎn)染miR-145的模擬物后，SM22α mRNA、miR-145的水平有所升高。miR-145定位在5號染色體上，早期研究主要集中在miR-145與癌癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，而近年有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miR-145是VSMC表達最豐富的miRNA，而且大部分聚集在VSMC[17]。在血管受到損傷時，VSMC表型由收縮型轉(zhuǎn)為合成型，血管重構(gòu)，血管管腔變窄。VSMC的表型轉(zhuǎn)化過程涉及多個基因和蛋白質(zhì)因子的調(diào)控。多項研究提示miR-145表達水平在VSMC表型轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵性作用，在原代VSMC中miR-145水平較高，隨著VSMC表型轉(zhuǎn)化miR-145表達下降。金成吉等[18]研究提示通過提升miR-145的水平可抑制VSMC增殖及侵襲，其作用機制與細胞增殖相關(guān)的基因有關(guān)。另外，miR-145還可能通過調(diào)節(jié)SM22α的水平促使合成型的VSMC向收縮型轉(zhuǎn)化。SM22α是VSMC表型標(biāo)志基因，啟動子序列短，由多肽鏈和201個氨基酸殘基組成，在VSMC中SM22α異常表達會使炎癥增加，收縮功能產(chǎn)生障礙。SM22α在收縮型VSMC大量表達，在合成型中幾乎無表達。沈鳳等[19]提示促進SM22α的表達可抑制VSMC的增殖與遷移，對VSMC收縮型向合成型轉(zhuǎn)化具有一定的抑制作用。陳衛(wèi)國[20]等在對肺動脈高壓形成的研究中提出，提高miR-145水平可促進SM22α的表達，從而抑制血管平滑肌細胞的增殖，改善病情嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，因此推測經(jīng)過轉(zhuǎn)染miR-145后，可能是通過促進VSMC表型標(biāo)志基因SM22α水平的增加，從而抑制VSMC的活力，促使合成型VSMC向收縮型轉(zhuǎn)化。

本研究結(jié)果顯示，增殖組與空載體組中cyclin E水平較高、p27水平較低，經(jīng)過轉(zhuǎn)染miR-145的模擬物后cyclin E水平降低、p27水平升高。cyclin E是細胞周期的正調(diào)控因子，激活相應(yīng)的細胞周期素依賴激酶（CDK），并加強其對底物的作用，驅(qū)動細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換；cyclin E高表達可致細胞周期調(diào)節(jié)失控，細胞過度增殖；p27是細胞周期素依賴激酶抑制蛋白，G1后期所形成的cyclin E/CDK2復(fù)合物與p27結(jié)合，p27通過其C-末端抑制CDK2磷酸化，使其滅活，從而致細胞停滯在G1期，停止生長。p27幾乎抑制所有的cyclin/CDK復(fù)合物活性，在細胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用。miRNA通過調(diào)控體內(nèi)蛋白編碼序列表達，參與生物體的生長、發(fā)育、衰老及凋亡的調(diào)控過程。近年來，miRNA對細胞以及干細胞分化的影響受到極大的關(guān)注。有關(guān)研究提示[21]，在胚胎干細胞和成體干細胞中超過100種miRNA差異性表達，miR-145可以抑制人胚胎干細胞的多能性因子，通過降低cyclin E和間接激活分化期間的p27水平，有助于調(diào)節(jié)胚胎干細胞的細胞周期。王建新[22]等提示通過抑制cyclin E的水平，促進p27的水平可抑制VSMC細胞周期及增殖。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，因此推測miR-145可能是通過促進SM22α水平增加影響cyclin E、p27的水平，抑制血管平滑肌細胞的周期發(fā)展。

本研究結(jié)果提示，經(jīng)過轉(zhuǎn)染miR-145的模擬物后，VSMC遷移數(shù)量及增殖均有所下降。當(dāng)血管受到損傷后，VSMC由分化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為未分化狀態(tài)，這一過程使VSMC獲得增殖與遷移能力，是各種增殖性心血管疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[23]。本研究與沈鳳等[24]研究結(jié)果相似，miR-145水平升高后通過促進SM22α水平可抑制VSMC的增殖、遷移。

綜上所述，過表達miR-145通過促進SM22α水平增加，抑制血管平滑肌細胞的增殖，并促進其凋亡。