透射電鏡樣品制備及觀察在本科實驗教學中的應用*

張曉麗 王立言 郝 晶 侯桂華 張玉華 張向紅△

（山東大學基礎醫(yī)學院，1 組織學與胚胎學教研室，2 實驗核醫(yī)學與電鏡中心，3 信息化教學研究中心，濟南 250012）

在現(xiàn)代醫(yī)學領域，電鏡技術在臨床診斷、醫(yī)學研究方面的應用越來越廣泛，許多醫(yī)學院校都開設了電鏡課程。如何在有限的時間內使學生有興趣主動學習，并獲得最好的效果，是值得探討的問題[1]。筆者所在電鏡實驗室自20世紀80年代開始面向醫(yī)學相關專業(yè)本科生開設選修課，授課教師在長期的實踐教學工作中積累了豐富的經(jīng)驗，總結如下。

1 明確實驗教學目標

目前，電鏡教學尚無統(tǒng)一的教材和教學大綱，各高校對學生的培養(yǎng)目標也沒有統(tǒng)一標準[2]。根據(jù)多年工作的經(jīng)驗，山東大學基礎醫(yī)學院電鏡實驗室首先確立了本課程的培養(yǎng)目標，具體包括：了解電鏡技術在科研及臨床中的應用；培養(yǎng)學生嚴格、細致的科研作風，提高學生的動手操作能力[3]；教會學生認識常見的正常和病理超微結構?？傊?，通過實驗教學，可以使學生對電鏡技術的發(fā)展現(xiàn)狀、樣品制備原理及方法有一定了解，使其在今后的學習和工作中用到電鏡時，能夠順利閱讀并理解相關文獻，根據(jù)研究目的選擇合適的樣品制備方法，正確分析電鏡相關的實驗結果。

2 加強實驗教學內容建設

電鏡實驗教學內容豐富、專業(yè)性強、操作復雜、技術要求高。以往電鏡樣品制備過程的教學，通常由教師講解和示范，學生缺少動手機會。通過多年的教學實踐，現(xiàn)在本實驗室進行的實驗教學可以滿足學生獨立完成取材至包埋的過程，其他由教師演示，學生參觀、提問和教師答疑來完成。為了提高學生學習電鏡的興趣、增加學生動手操作的機會，對以下教學內容進行了調整。

2.1 優(yōu)化包埋步驟，重點突出樣品取材

取材是樣品制備的第一步，取材失誤將導致后續(xù)工作無法進行。因此要求學生在實驗教學過程中重點掌握動物器官、組織和游離細胞的取材。針對容易出現(xiàn)的問題，和學生一起分析原因，找出解決辦法。如取材組織塊太大，固定液和包埋劑不能滲透到組織內部，導致結構保存不良和切片困難的問題。共同分析可能由于新鮮組織柔軟，難以切割為形態(tài)規(guī)則的小組織塊；解決方法是可以先剪取較大的組織塊，放入固定液內，硬化幾分鐘，此時再將組織塊切成 1 mm3的小塊，注意只切取表面固定好的組織。再比如學生遇到取材部位不準確或切片方向不明確導致看不到想要的結構時，教師可以引導學生對組織或器官進行平面和立體的解析，進一步了解組織或器官各部分的結構，進而根據(jù)研究目的選取適當?shù)奈恢?，像胃腸道、皮膚、角膜、視網(wǎng)膜、耳蝸、肌肉等在取材時要注意方向性，并且在取材時需做出標記，或修整為與切面垂直的長方體形狀。對于培養(yǎng)細胞來說，不同階段的培養(yǎng)細胞結構差異較大，更需掌握適當?shù)娜〔臅r機，同時還要注意選擇合適的離心速度和離心時間，既要避免細胞團塊太松散，又要防止結構遭到破壞。

2.2 對樣品制備環(huán)節(jié)進行有序剪輯及分割

將以往演示甚至省略的樣品制備環(huán)節(jié)進行有序剪輯和分割，例如將整個樣品制備過程分解成載網(wǎng)的選擇與清洗，支持膜的選擇與制備，刀的選擇與玻璃刀的制備，包埋塊修整等幾個實驗項目。不同的樣品要選擇不同的載網(wǎng)和切片刀；利用酸堿法清洗載網(wǎng)；利用漂浮法制備Formvar膜，通過膜的顏色判斷其厚度及一致性；采用平衡斷裂法制備45°的玻璃刀，了解斷裂成刀時越接近“角對角”斷裂，刀刃越鋒利，切片時的擠壓變形越??；斷裂越慢，刀刃的可用區(qū)域越長；在超薄切片機上手工修整包埋塊，暴露出樣品并將頂面修成一定的形狀。這些內容由學生親自動手操作，提高了學生對電鏡實驗教學的興趣，增強了學生的實踐操作能力。

2.3 增加即時可獲得結果的實驗項目

利用超薄切片機制備0.5～2.0 μm厚度的半薄切片，甲苯胺藍染色3～5 min后即可用光鏡觀察。由于結構保存良好，且比石蠟切片薄很多，半薄切片能觀察到更細微結構，不僅可用于定位及對同一部位進行光鏡和電鏡的對比觀察，還能用于肌肉、腎、腫瘤等疾病的診斷。另外負染色樣品制作簡單，在細菌、病毒和寄生蟲的診斷及噬菌體、孢子、核酸、蛋白質晶體等大分子材料的研究分析方面有顯著的成效。指導學生直接對沉降的顆粒懸液樣品進行負染色，干燥后快速進行電鏡觀察。在實驗教學中增加的這些內容可以使學生更充分了解電鏡技術在科研和臨床中的實際應用。

2.4 強化超薄切片及電子染色內容

超薄切片是樣品制備的關鍵。了解超薄切片機的結構及工作原理，其操作可在對刀之后由學生親自動手，調節(jié)進刀尺度和切片速度，觀察切片過程。了解切片厚度的判斷方法及影響因素，指導學生用3種方式撈取超薄切片，介紹各自優(yōu)缺點。了解電子染色的原理及常用染色劑的特點，指導學生利用手工和自動染色機進行染色。了解切片缺陷及染色污染產生的原因，有些可以憑借操作者的經(jīng)驗予以排除，有些無法彌補導致實驗失敗。樣品制備每一步都必須嚴格、精細，以此培養(yǎng)學生嚴謹、細致的工作作風。

2.5 重視電鏡調整與結構分析

電鏡圖像的質量不僅取決于樣品制備，還與整個儀器的狀態(tài)密切相關。確保足夠的燈絲亮度；選擇合適的加速電壓；調節(jié)聚光鏡光闌、物鏡消像散，對電子束進行校正合軸；學習欠焦、正焦、過焦3種狀態(tài)的調整；正確地進行電鏡操作，才能拍攝出高質量的透射電鏡照片。指導學生在電鏡下進行結構觀察，認識細胞膜、細胞核、線粒體、高爾基體、內質網(wǎng)等正常細胞結構，了解組織和細胞病變時常見的超微結構改變，并與機能和代謝的變化相聯(lián)系，為學生以后閱讀理解相關文獻、正確分析電鏡實驗結果打好基礎。

3 開展綜合創(chuàng)新實驗課程

2017年開始，電鏡實驗室與同位素研究中心及分子生物教學平臺聯(lián)合開展“細胞學縱向綜合創(chuàng)新實驗課程”，全方位覆蓋細胞學研究的常規(guī)技術和方法，包括細胞培養(yǎng)、增殖狀態(tài)觀察、分泌因子測定、移植瘤小鼠模型制備、細胞及腫瘤的石蠟和超薄切片制備、結構觀察等內容。通過近4年的實踐，學生選課積極，課堂氣氛活躍，能主動聯(lián)系所學理論知識，對“細胞-腫瘤”這一主題提出問題并展開討論，使學生了解電鏡技術與其他學科的聯(lián)系及在解決實際問題中的應用，開拓了視野，培養(yǎng)了發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的科研實踐能力。

4 改變實驗教學形式

集中授課時，將學生進行適當分組，進行小班化教學，教師可以更具體地指導每名學生操作；集中授課時間之外，對學生開放實驗室。學生可以自主預約進入實驗室的時間；允許學生自帶實驗材料參與實驗室技術服務工作，同時將服務中經(jīng)常遇到的問題介紹給學生，使學生盡早接觸到科研和臨床實踐；同時將常用的電鏡技術整理匯編成技術手冊，由熟練的技術人員操作，并錄制成實驗教學視頻，且通過網(wǎng)絡實現(xiàn)資源共享，為學生創(chuàng)造自主學習的良好環(huán)境[4]。

5 注重學生反饋

電鏡實驗教學內容繁雜，實驗報告很容易寫成流水賬。目前，鼓勵學生在實驗課后，提出對該課程的意見和建議，學生都會比較積極地參與其中，這些意見和建議對改進實驗教學具有非常重要的意義。指導教師對學生的建議基本能做到件件有回應。例如，有學生建議建立微信群，以便對課程相關問題隨時進行討論。經(jīng)充分討論，指導教師不僅建立了微信群，同時還申請了公共郵箱，更加方便指導教師和學生之間的即時交流。還有學生建議按常規(guī)標準流程制備樣本，并進行結構觀察。指導教師鼓勵這部分學生自主預約時間，參與實驗室的開放教學。這些措施提高了學生的學習興趣，使學生的學習熱情高漲。

綜上所述，大型儀器用于教學，存在著教學內容匱乏的難點。大型儀器應用于教學的目的不應僅局限于學會儀器的開、關及參數(shù)選擇，更應該著重于實際應用和拓展，在儀器原理和操作的學習過程中培養(yǎng)學生的動手能力、思考能力和創(chuàng)新實踐能力[5]。近年來，山東大學基礎醫(yī)學院電鏡室注重加強教學內容建設，將實驗教學與技術服務相結合，著重開發(fā)可用于面向學生開放的教學項目，改進實驗教學形式，提高學生對電鏡技術的興趣和動手操作能力。這些措施既提高了實驗教學的質量，又促進了技術服務的開展。目前，技術服務送樣合格率明顯提高，來咨詢的師生對電鏡技術大多都有了一定的了解。這些改變又進一步激發(fā)了實驗人員的工作熱情。今后，電鏡室將根據(jù)學生自身的學習能力以及對自我要求的不同，開設不同層次的實驗教學課程[6]，充分發(fā)揮電鏡在實驗教學中的作用，保證實驗教學開放的長期性、穩(wěn)定性和持續(xù)性。