姜黃素對斷奶仔豬腸道屏障、抗氧化和線粒體功能的影響

洪奇華，李 鑫，徐求文，金妙仁，胡彩虹*

（1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058；2.杭州百瑞特飼料科技有限公司，浙江杭州 311200）

由于仔豬腸道結(jié)構(gòu)和功能尚未發(fā)育完善，早期斷奶會引起仔豬生理、營養(yǎng)和環(huán)境條件的突然變化，從而導致斷奶綜合征，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。腸上皮是機體抵御有害抗原和病原體的關(guān)鍵屏障，而線粒體呼吸鏈酶復合體參與呼吸鏈的電子傳遞和ATP 生成，對腸上皮細胞更新和正常生理功能具有重要作用。研究表明，斷奶會破壞內(nèi)環(huán)境平衡，導致腸道發(fā)生氧化應激、屏障功能損傷以及線粒體功能紊亂。如何緩解仔豬斷奶氧化應激、促進仔豬健康成長，已成為學術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界共同關(guān)注的焦點。

姜黃素是一種從姜科或天南星科植物根莖中提取的酚類色素，屬于天然抗氧化劑，具有保護腸黏膜、抗氧化、調(diào)節(jié)代謝、抑菌抗炎等功能。袁歡等報道，姜黃素可以提高畜禽生產(chǎn)性能、產(chǎn)品品質(zhì)，并增強機體的免疫力。蘆娜等研究表明，日糧中添加姜黃素可提高斷奶仔豬生產(chǎn)性能和養(yǎng)分表觀消化率。姜黃素因其抗氧化應激功能而受到廣泛關(guān)注，但能否緩解由氧化應激引起的腸道損傷和線粒體損傷尚不清楚。本文旨在研究姜黃素對斷奶仔豬腸道屏障、抗氧化和線粒體功能的影響，為緩解仔豬斷奶應激提供新的營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 選取28 日齡體重約7.5 kg 的斷奶杜大長仔豬60 頭，按胎次、體重相近和公母各半分成2 組，每組3 個重復，每個重復10 頭。對照組飼喂基礎飼糧（表1），基礎日糧參照美國NRC（2012）仔豬營養(yǎng)需要推薦量配制。試驗組飼喂基礎飼糧+200 mg/kg 姜黃素（根據(jù)實驗室前期對斷奶仔豬生長性能影響的研究選取適宜添加量，未發(fā)表）。試驗期14 d，試驗結(jié)束稱重后，從每個重復選取2 頭接近平均體重的仔豬進行屠宰取樣。試驗期間自由采食和飲水，仔豬的免疫按常規(guī)免疫程序進行，飼養(yǎng)管理措施嚴格執(zhí)行衛(wèi)生防疫制度。

表1 試驗基礎日糧組成及營養(yǎng)水平

1.2 生長性能測定 試驗期間，每天觀察并記錄仔豬采食和健康情況。試驗開始和結(jié)束時空腹稱重，以每個重復為單位記錄耗料量，計算平均日增重、日平均采食量和耗料增重比。

1.3 腸道樣品取樣 腸道組織樣品：仔豬屠宰后取十二指腸、空腸和回腸中段各4 cm，用生理鹽水將其輕輕沖洗干凈，浸入10% 福爾馬林溶液中，置于4℃冰箱保存，待做組織切片。仔豬屠宰后取2 段長度為8 cm左右的空腸組織（相鄰于腸道形態(tài)樣品部位），用PBS 漂洗去除腸道內(nèi)容物后立即用于尤斯灌流（Ussing Chamber）實驗。

腸黏膜樣品：仔豬屠宰后取約8 cm 長的近端空腸組織，用生理鹽水漂洗去除腸道內(nèi)容物后，用濾紙吸干水分，再用手術(shù)刀鈍端刮取空腸黏膜，迅速用液氮冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

1.4 小腸黏膜結(jié)構(gòu)測定 十二指腸、空腸和回腸組織固定、脫水、包蠟、切片、HE 染色后，顯微鏡拍照，測量絨毛高度和隱窩深度。絨毛高度為絨毛頂端至隱窩開口處的垂直距離，隱窩深度則為隱窩開口至隱窩基部的垂直距離。

1.5 腸屏障功能 根據(jù)Cao 等和徐露蓉等方法，采用尤斯灌流技術(shù)檢測腸上皮細胞跨膜電阻（Transepit helial Electrical Resistance，TER）和腸上皮對熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖（4 kDa-FITC dextran，F(xiàn)D4）的通透性。

1.6 腸道氧化還原狀態(tài) 空腸黏膜超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）活性，總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量用酶聯(lián)免疫（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）試劑盒檢測。上述指標的測定均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒，具體操作根據(jù)試劑盒說明書進行。

1.7 腸黏膜線粒體的提取與腸黏膜線粒體呼吸鏈復合物I-IV 活性測定 將約0.5 g 空腸黏膜組織置于預冷的MSH 緩沖液中均質(zhì)，勻漿后在4℃下以1 000×g 離心10 min。MSH 緩沖液：10 mmol/L pH 7.5 的HEPES，200 mmol/L 甘露醇，70 mmol/L 蔗糖，1.0 mmol/L EGTA和2.0 mg/mL 血清白蛋白。然后將收集到的上清液在4℃以3 500×g 離心后放置10 min（線粒體膜對溫度高度敏感，所以整個操作必須在冰上進行，用到的溶液和離心管都必須預冷，否則線粒體容易破裂），獲得線粒體沉淀，進一步用BCA 法檢測蛋白濃度。

利用線粒體呼吸鏈復合物活性定量測定試劑盒測定線粒體復合物I（NADHCoQ 還原酶），II（琥珀酸輔酶Q 還原酶），III（CoQ-細胞色素C 還原酶）和IV（細胞色素C 氧化酶）的活性，上述指標的測定均使用上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司的試劑盒，具體操作根據(jù)試劑盒所附說明書進行。

1.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS 10.0 對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。試驗數(shù)據(jù)以平均值± 標準差表示。<0.05 表示差異顯著，>0.05 表示差異不顯著。

2 試驗結(jié)果

2.1 姜黃素對斷奶仔豬生長性能的影響 由表2 可見，與對照組相比，試驗組的平均日增重提高6.10%（<0.05），耗料增重比降低4.35%（>0.05）。

表2 姜黃素對斷奶仔豬生長性能的影響

2.2 姜黃素對斷奶仔豬腸黏膜形態(tài)的影響 由表3 可見，姜黃素能顯著改善斷奶仔豬黏膜形態(tài)。與對照組相比，試驗組十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度分別提高了9.16%、10.70% 和10.94%（<0.05），十二指腸、空腸和回腸隱窩深度分別降低了11.56%（<0.05）、2.84%（>0.05）和6.60%（>0.05），十二指腸、空腸以及回腸的絨毛高度/隱窩深度分別提高了23.03%、13.70%和19.00%（<0.05）。

表3 姜黃素對斷奶仔豬黏膜形態(tài)的影響 μm

2.3 姜黃素對斷奶仔豬空腸TER、FD4 的影響 表4 顯示，相對于對照組，試驗組仔豬空腸中的TER 提高了11.65%（<0.05），而FD4 通透性降低30.24%（<0.05），說明日糧中添加姜黃素能明顯改善斷奶仔豬的腸道屏障功能。

表4 姜黃素對斷奶仔豬空腸TER、FD4 的影響

2.4 姜黃素對斷奶仔豬空腸黏膜中抗氧化酶活性和MDA 含量的影響 與對照組相比，試驗組空腸黏膜中SOD、GSH-Px 和T-AOC 活性分別提高了12.65%、16.31%和18.58%（<0.05），MDA 含量降低了20.00%（<0.05），可見日糧中添加姜黃素可以顯著改善斷奶仔豬的抗氧化功能。

2.5 姜黃素對斷奶仔豬腸空腸黏膜線粒體呼吸鏈復合物I-IV 活性的影響 由表6 可知，與對照組相比，試驗組的空腸黏膜線粒體呼吸鏈復合物I-IV 活性分別提高了40.95%、29.90%、34.38% 和21.28%（<0.05），表明姜黃素能明顯提高斷奶仔豬空腸黏膜的線粒體功能。

表5 姜黃素對斷奶仔豬空腸黏膜中抗氧化酶活性和MDA 含量的影響

表6 姜黃素對斷奶仔豬腸空腸黏膜線粒體呼吸鏈復合物I-IV 活性的影響 μmol/（min·mg）

3 討論

3.1 姜黃素對仔豬生長性能的影響 仔豬早期斷奶會出現(xiàn)生長滯緩現(xiàn)象，原因之一是斷奶造成的氧化應激。尋找有效的抗應激劑，讓仔豬平穩(wěn)度過此重要生理階段，已成為動物營養(yǎng)學家的一個重要課題。姜黃素具有抗氧化能力，可用作抗應激劑來提高畜禽生產(chǎn)性能。有研究顯示，姜黃素能提高畜禽的生長性能、產(chǎn)品品質(zhì)、養(yǎng)分表觀消化率、機體免疫力。本研究結(jié)果表明，姜黃素能緩解仔豬斷奶應激引起的生長性能下降，顯著提高斷奶仔豬日增重，同時降低耗料增重比，可以作為緩解仔豬斷奶應激的營養(yǎng)調(diào)控劑。

3.2 姜黃素對仔豬小腸黏膜形態(tài)的影響 腸黏膜結(jié)構(gòu)和形態(tài)完整是保證機體營養(yǎng)物質(zhì)正常消化吸收、仔豬健康成長的基礎。體內(nèi)外應激會使腸黏膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，小腸絨毛萎縮和隱窩加深，造成仔豬生長阻礙。本研究結(jié)果顯示，日糧添加姜黃素能顯著提高斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸絨毛高度，降低十二指腸、空腸和回腸隱窩深度，說明姜黃素能明顯改善腸形態(tài)指標，保障機體營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，從而提高仔豬生產(chǎn)性能。

3.3 姜黃素對斷奶仔豬空腸TER、FD4 的影響 在正常情況下，機體自由基維持在相對穩(wěn)定的動態(tài)平衡中。在應激狀態(tài)下，機體抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)生紊亂，導致自由基累積，造成腸屏障功能損傷并降低動物的生產(chǎn)性能。體內(nèi)外研究表明，應激可引起腸上皮屏障完整性受損，導致營養(yǎng)物質(zhì)代謝功能障礙。TER 的降低和FD4通透性的升高常用來表征腸屏障受損。本研究結(jié)果顯示，斷奶仔豬飼料中添加姜黃素，能增加腸上皮細胞跨膜電阻，同時降低了物質(zhì)通透性，表明其對保護腸道屏障功能、保持腸黏膜結(jié)構(gòu)完整具有積極作用。

3.4 姜黃素對斷奶仔豬空腸粘膜中抗氧化酶活性和MDA含量的影響 小腸是對氧化應激最敏感的器官之一。研究發(fā)現(xiàn)，斷奶應激導致仔豬血清中活性氧和MDA 含量增加，而SOD 和GSH-Px 等抗氧化酶活性顯著降低。然而飼喂姜黃素能顯著提高蛋雞血清和組織樣品的CAT、SOD、T-AOC 和GSH-Px 活性，并降低MDA 含量。本研究中，斷奶仔豬日糧中添加姜黃素后，空腸黏膜中SOD、T-AOC 和GSH-Px 活性顯著提高，而MDA 含量則顯著降低，進一步表明姜黃素能拮抗氧化應激，維持腸道正常生理功能，提高生長性能。

3.5 姜黃素對斷奶仔豬腸道線粒體功能的影響 線粒體功能損傷可能是仔豬腸道功能紊亂的重要原因。線粒體的電子呼吸鏈由I、II、III、IV 4 個膜蛋白復合物組成，其活性下降可使呼吸鏈的電子傳遞受阻，影響ATP 生成，同時還可使電子從呼吸鏈中泄露后直接與氧分子作用，產(chǎn)生大量氧自由基，進一步引起線粒體和組織細胞功能障礙，因此線粒體呼吸鏈復合物的活性可作為衡量線粒體功能的指標。研究表明，腸炎患者或細胞氧化應激可降低胞內(nèi)線粒體復合物活性下降，導致線粒體能量代謝障礙。本研究結(jié)果顯示，日糧中添加姜黃素能明顯提高斷奶仔豬腸內(nèi)線粒體呼吸鏈復合物I、II、III、IV 的活性，從而緩解氧化應激引起的能量生成紊亂和腸屏障完整性受損，提高生長性能，說明維持線粒體的正常功能也是姜黃素抗氧化應激的一個重要途徑。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，日糧中添加200 mg/kg 姜黃素能顯著增強斷奶仔豬的腸道屏障功能、抗氧化能力和線粒體功能，緩解斷奶應激并提高生產(chǎn)性能。