狹鱈魚片鹽漬過程中品質(zhì)及風味物質(zhì)的變化

井月欣，張 晴 ，馬長偉，張 健, ，李振鐸，劉 昕，劉慧慧，趙云蘋，王共明，劉 芳，曲 敏

（1.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東煙臺 264006；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100000；3.煙臺三江水產(chǎn)有限公司，山東煙臺 264006）

黃線狹鱈（Theragra chalcogramma）又稱阿拉斯加狹鱈，是全球捕撈產(chǎn)量最高的鱈魚品種，廣泛分布于太平洋北部，包括美國阿拉斯加州、俄羅斯等。在我國，黃線狹鱈主要產(chǎn)于黃海東部。狹鱈具有很高的經(jīng)濟價值，它的蛋白質(zhì)含量高，而脂肪含量低[1]，適合大規(guī)模工廠化加工生產(chǎn)。近年來，鹽漬鱈魚成為我國出口的鱈魚加工新品，由于其風味獨特、易保存，在歐美國家具有廣泛的市場需求[2]。全球鹽漬鱈魚的消費總量每年約為24萬噸，主要包括真鱈、狹鱈等種類。水產(chǎn)品腌制加工是一種常見的保藏方法，此法歷史悠久、產(chǎn)品味道獨特，深受廣大消費者的喜愛。鹽漬可以增加水產(chǎn)品的滲透壓，降低水分活度，達到抑制腐敗變質(zhì)的作用。由于微生物和一些酶的作用，在鹽漬過程中，水產(chǎn)品的品質(zhì)和風味逐漸改變，產(chǎn)生了獨特的風味[3]。

近年來，國內(nèi)外研究者對腌制工藝的優(yōu)化以及腌制對魚肉品質(zhì)和風味的影響進行了大量研究和探索。張建梅[4]發(fā)現(xiàn)腌制類食物容易產(chǎn)生亞硝酸鹽自熱污染的問題，污染水平一般低于20 mg/kg。陳嬌嬌等[5]研究了不同腌制條件對羅非魚品質(zhì)的影響，并優(yōu)化了干腌工藝條件，發(fā)現(xiàn)腌制時間對魚肉的氯化鈉含量和氨基肽氮含量有顯著影響，魚肉的氯化鈉含量與腌制鹽度呈正相關。楊華等[6]研究了腌制對紅魚品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)腌制方法和工藝條件均對腌制紅魚品質(zhì)有顯著影響。王騰等[7]研究了超聲波輔助鹽漬對鯇魚理化性質(zhì)和品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波可以縮短鹽漬時間，抑制微生物的生長。Nguyen等[8]研究了不同鹽水濃度對大西洋真鱈肌肉蛋白質(zhì)構象的影響，發(fā)現(xiàn)鹽濃度的增加促進了蛋白質(zhì)的變性。曾令彬等[9]研究發(fā)現(xiàn)腌制和干燥使臘魚中部分游離氨基酸含量增加，形成臘魚特有風味。Esaiassen等[10]研究了腌制對鱈魚感官品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)腌制鱈魚片的氣味和口感比未腌制的鱈魚更好。Rosa等[11]利用GC-MS測定了鹽漬大西洋真鱈的揮發(fā)性成分變化，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化有助于形成鹽漬鱈魚的特有風味。Barat等[12]分別用不同的鹽水濃度腌制大西洋真鱈，發(fā)現(xiàn)在鹽水濃度較高時，由于蛋白質(zhì)鹽析，魚肉的蛋白質(zhì)結(jié)構發(fā)生較大變化，產(chǎn)品含鹽量較高且得率較低。Cui等[13]采用頂空-氣相色譜-離子遷移技術（HSGC-IMS）對不同烹飪方法的魷魚樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進行了測定，發(fā)現(xiàn)腌制魷魚具有獨特的特殊風味化合物，不同的烹飪方法可以影響魷魚的香氣。龐一揚等[14]發(fā)現(xiàn)魚肉腌制前后的揮發(fā)性成分發(fā)生了明顯變化，腌制過程中魚肉的腥味成分減少，醛酮類、酯類物質(zhì)增加。

目前，國內(nèi)外學者對鹽漬鱈魚的研究以大西洋真鱈（Gadus morhua）為主，鹽漬狹鱈的企業(yè)標準化加工以及品控缺少基礎研究，對狹鱈在鹽漬過程中發(fā)生的品質(zhì)和風味變化研究甚少。因此，本文以狹鱈魚片為原料，采用前期優(yōu)化的鹽漬工藝鹽漬狹鱈魚片，研究鹽漬過程中狹鱈魚片的品質(zhì)變化，以期為加工出口型鹽漬狹鱈產(chǎn)品提供理論支撐，并為鱈魚深加工及其他魚類加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

去骨去刺去皮狹鱈魚片（重量為4～6盎司） 煙臺嘉鴻食品有限公司；食用無碘鹽 山東省鹽業(yè)集團有限公司；正己烷（色譜純）、三氯乙酸、三氯甲烷、乙二胺四乙酸（EDTA）、2-硫代巴比妥酸、冰乙酸、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硼酸鈉、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、瓊脂糖、鹽酸、乙酰氯、無水甲醇、碳酸鉀、甲醛、乙醇 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；總氨基酸測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；Lowry法蛋白濃度測定試劑盒、彩虹245廣譜蛋白Marker 北京索萊寶科技有限公司；DNA抽提試劑盒 美國MP Biomedicals公司；DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

METTLER TOLEDO電子分析天平 瑞士/梅特勒托利多；DHG-9053A電熱鼓風干燥箱 上海沙鷹科學儀器有限公司；HH-4電熱恒溫水浴鍋 山東省煙臺龍口市先科儀器公司；GC-2010高效氣相色譜分析儀 日本島津公司；Multiskan GO酶標儀

美國ThermoFisher公司；XW-80A旋渦混合器 上海精科實業(yè)有限公司；FlavourSpec?風味分析儀

濟南海能儀器股份有限公司；YC-520L醫(yī)用冷藏箱

中科美菱低溫科技股份有限公司；DZQ真空包裝機 上海阿凡佬機械有限公司；DHG-9053A電熱鼓風干燥箱 上海沙鷹科學儀器有限公司；LEICA ICC50HD顯微鏡 德國萊卡公司；FD-2A冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 狹鱈魚片預處理 采用注水法，在4 ℃下用純水解凍狹鱈魚片1 h，將其逐個清洗控干備用。

1.2.2 狹鱈魚片鹽漬工藝 采用干腌法，取漏網(wǎng)塑料筐（規(guī)格：37 cm×35 cm×3.5 cm）若干，底部用保鮮膜鋪好，均勻地撒一層鹽，再將狹鱈魚片擺在塑料筐中，一層鹽，一層狹鱈魚片，每層鹽都要均勻覆蓋魚肉表面，最后一層為鹽，擺好后放置冷藏箱進行鹽漬，鹽漬條件為加鹽量100%（w/w），鹽漬時間15 d，鹽漬溫度10 ℃。分別在鹽漬0、3、6、9、12、15 d取樣，測定其脂肪氧化程度、亞硝酸鹽含量、脂肪酸含量、游離氨基酸總量、蛋白質(zhì)降解、微觀組織結(jié)構和揮發(fā)性風味成分。

1.2.3 脂質(zhì)氧化程度的測定 采用蔡文強等[15]的方法，并略作修改。將去除表面食鹽的狹鱈魚片研碎，準確稱取10 g研碎后的魚肉于錐形瓶中，加入50 mL 7.5%的三氯乙酸溶液（含0.1%的EDTA），用搖床振搖30 min后，雙層濾紙過濾。取5 mL上清液于帶塞比色管中，加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，塞緊管口，沸水浴40 min，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至離心管中，1500 r/min離心25 min。取上清液，加入5 mL三氯甲烷并搖勻，靜置分層后取上清液，測定在532和600 nm波長處的吸光值，同時做試劑空白，平行測定三次，結(jié)果取平均值，用以下公式計算TBA值。

式中：A532、A600分別為在532、600 nm處的吸光值；155為丙二醛的毫摩爾吸光系數(shù)；72.06為丙二醛的分子量；m為稱取的樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 亞硝酸鹽含量的測定 亞硝酸鹽含量依據(jù)GB/T 5009.33-2016測定[16]。

1.2.5 脂肪酸含量的測定 參照譚青等[17]的方法，并稍作更改。將去除表面食鹽的狹鱈魚片真冷凍干燥，取100 mg凍干的樣品于消化管中，加入2 mL 10%乙酰氯甲醇溶液（乙酰氯:無水甲醇=1:10）、1 mL正己烷，塞緊蓋子后混勻。于80 ℃金屬浴中甲酯化2 h，冷卻至室溫，加入5 mL 6% K2CO3、2 mL正己烷，振蕩后靜置10 min。取上清液，用0.22 μm濾膜過濾至脂肪酸測定小瓶，采用氣相色譜儀分析，色譜柱為SP-2560氣相色譜柱（100 mm×0.25 mm×0.2 mm），進樣量為1 μL，根據(jù)脂肪酸標準品的保留時間進行定性。

1.2.6 游離氨基酸總量的測定 采用總氨基酸測定試劑盒的比色法進行氨基酸總量的測定；采用Lowry法蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度的測定。

1.2.7 SDS-PAGE電泳 參考劉家維等[18]的方法并作適當修改。制備分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，加入玻璃板中。將樣品與5×上樣緩沖液（40 μL+10 μL）混勻，沸水浴5 min后上樣，樣品上樣量為10 μL，彩色245廣譜蛋白Marker上樣量為5 μL。以80 V的恒壓進行電泳，當樣品進入分離膠時，將電壓改為120 V，待溴酚藍跑到膠的底部時停止電泳。取出凝膠，使用考馬斯亮藍染液染色30 min后倒掉。用蒸餾水清洗凝膠2～3次，加入脫色液，放在搖床上振搖，每30 min更換一次脫色液，直至得到清晰的條帶。隨后，用凝膠成像分析儀進行拍照分析。

1.2.8 微觀組織結(jié)構觀察 根據(jù)沈暉等[19]的方法進行石蠟切片，并稍作修改。用手術刀片把樣品切成3 mm×3 mm×3 mm的大小，配制含苦味酸飽和液（1.22%）75 mL、福爾馬林25 mL、乙酸5 mL的Bolin氏液作為固定液，將樣品置于固定液中固定23 h，置于70%乙醇中進行置換。隨后將樣品放入全自動組織脫水機中，進行乙醇梯度脫水、二甲苯透明和浸蠟。浸蠟之后，用鑷子取樣，使用石蠟包埋機，于5 cm×3 cm×3 cm的紙盒內(nèi)進行包埋，包埋后迅速冷卻。修剪石蠟塊，用旋轉(zhuǎn)切片機切片，每片厚度為4 μm，取至少3片完整的連續(xù)切片，于40 ℃的水浴中展片，轉(zhuǎn)移至載玻片，置于烘箱中（37 ℃）烘干。烘干的切片經(jīng)脫蠟、蘇木精-伊紅染色、乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，用中性樹膠封片，蓋上蓋玻片，置于烘箱（37 ℃）烘片48 h，用電子顯微鏡觀察、拍照。

1.2.9 揮發(fā)性風味成分的測定 采用HS-GC-IMS技術，使用FlavourSpec?風味分析儀測定鹽漬狹鱈樣品中的揮發(fā)性成分。稱取2 g鹽漬狹鱈樣品，置于20 mL頂空瓶中，在60 ℃孵育15 min后，直接頂空進樣，進樣量為500 μL。參考Zhang等[20]的方法，設定分析條件見表1。

表1 HS-GC-IMS分析條件Table 1 Experimental conditions of HS-GC-IMS

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3次，實驗結(jié)果以平均值±標準差表示。采用SPSS23.0以及Microsoft Office Excel 2016完成數(shù)據(jù)的處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽漬過程中鹽漬狹鱈魚片脂質(zhì)氧化程度的變化

在魚腌制過程中，脂肪氧化對魚類腌制產(chǎn)品的感官、風味、品質(zhì)特性起著重要的作用[21]。由圖1可知，隨著鹽漬時間的增加，魚肉的TBA值由0.14 mg/kg升至0.26 mg/kg，呈緩慢上升趨勢，說明脂質(zhì)在鹽漬過程中發(fā)生了氧化，此階段主要是脂肪氧化酶的作用。TBA值均小于1.0 mg/kg，說明鹽漬狹鱈魚片的脂質(zhì)氧化程度均在安全范圍內(nèi)[22]。

圖 1 鹽漬過程中鹽漬狹鱈魚片脂質(zhì)氧化程度的變化Fig.1 Changes of degree of lipid oxidation of dry-salted Alaska pollock fillets during salting

2.2 鹽漬過程中鹽漬狹鱈魚片中亞硝酸鹽含量的變化

由圖2可知，隨著鹽漬時間的增加，狹鱈魚片中的亞硝酸鹽含量呈先上升后下降的趨勢，鹽漬后亞硝酸鹽含量由2.00 mg/kg增加到2.91 mg/kg，小于國標規(guī)定的30 mg/kg，說明鹽漬使魚肉中亞硝酸鹽的含量增加，且在安全范圍內(nèi)[23]。由于魚體本身就含有硝酸鹽和亞硝酸鹽，在鹽漬前期，一部分硝酸鹽被硝酸鹽還原菌還原，生成亞硝酸鹽，因此亞硝酸鹽的含量升高；在鹽漬中后期，亞硝酸鹽被其他微生物還原成氮氣、氨氣等氣體，而且由于鹽漬后期魚肉含鹽量的升高，硝酸鹽還原菌的活性受到抑制，因此亞硝酸鹽的含量下降[24]。另外，由于鹽漬狹鱈魚片加工過程中未額外添加硝酸鹽和亞硝酸鹽，因此亞硝酸鹽的含量總體處于較低水平。這與劉敏[25]的研究結(jié)果類似，在腌制過程中，鰳魚的亞硝酸鹽含量先增加后減少，且在腌制第6 d達到最大值。

圖 2 鹽漬過程中鹽漬狹鱈魚片亞硝酸鹽含量的變化Fig.2 Changes of the content of nitrite in dry-salted Alaska pollock fillets during salting

2.3 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片脂肪酸含量的影響

采用氣相色譜檢測到鹽漬過程中魚肉20種脂肪酸含量的變化，結(jié)果見表2。在鹽漬過程中，鹽漬狹鱈魚片的飽和脂肪酸總量略升高，其中硬脂酸（C18:0）含量最高，且在鹽漬過程中（3、6、12、15 d）顯著升高（P＜0.05）；單不飽和脂肪酸中，十五碳烯酸（C15:1）的含量最高，油酸（C18:1n-9c）含量僅次于十五碳烯酸的含量，且兩者的含量在鹽漬過程中呈升高趨勢，說明脂肪酸水解的產(chǎn)物主要是十五碳烯酸和油酸；多不飽和脂肪酸中，DHA含量最高，其次是EPA，且兩者的含量在鹽漬過程中均呈下降趨勢。以上結(jié)果表明脂質(zhì)在鹽漬過程中發(fā)生了氧化，且以多不飽和脂肪酸氧化為主。這與郭雅[26]的研究結(jié)果一致，在腌制過程中，風干鳊魚的多不飽和脂肪酸含量減少，飽和脂肪酸含量明顯升高。

表2 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片的脂肪酸組成及含量的影響Table 2 Effect of salting on fatty acid composition and content of dry-salted Alaska pollock fillets

2.4 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片中游離氨基酸總量的影響

由圖3可知，隨著鹽漬時間的增加，狹鱈中游離氨基酸總量先急劇減小，再逐漸增加。這可能是因為鹽漬前期水分的大量流失，導致游離氨基酸也跟著流失；鹽漬中后期，魚肉中蛋白質(zhì)在蛋白酶、氨肽酶的作用下水解，生成了游離氨基酸，因此游離氨基酸總量逐漸增加。

圖 3 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片中游離氨基酸總量的影響Fig.3 Effect of salting on the total free amino acids in drysalted Alaska pollock fillets

圖 4 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片中蛋白質(zhì)降解的影響Fig.4 Effect of salting on the protein degradation of dry-salted Alaska pollock fillets

2.5 鹽漬對魚肉中蛋白質(zhì)降解情況的影響

由圖4可知，隨著鹽漬時間的增加，在100～245 kDa之間的條帶顏色明顯變淺，說明大分子蛋白在鹽漬過程中逐漸降解；肌動蛋白（48 kDa）在鹽漬過程中（9～15 d）逐漸增加；分子量在20 kDa以下的蛋白發(fā)生部分降解。這可能是因為，在鹽漬過程中，某些蛋白在高鹽的作用下析出并降解，生成了分子量更小的蛋白片段，并進一步反應生成鹽漬狹鱈魚片的滋味物質(zhì)[27]。鹽漬的低溫環(huán)境抑制了組織蛋白酶的活性，使蛋白質(zhì)降解較緩慢。

2.6 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片微觀組織結(jié)構的影響

在顯微鏡放大倍數(shù)為20倍時，狹鱈肌纖維橫截面的微觀結(jié)構如圖5，可以看到鹽漬前魚肉肌纖維的橫截面呈規(guī)則的長圓形且大小相似，細胞間隙較均勻；而隨著鹽漬時間的增加，肌纖維的橫截面變得不規(guī)則，肌纖維明顯收縮，細胞間隙先變大后變小。這些變化可能是由蛋白質(zhì)鹽析和肌肉結(jié)構成分的酶降解引起的。這與大西洋真鱈在鹽漬過程中的微觀結(jié)構變化相似，Thorarinsdottir等[28]研究發(fā)現(xiàn)，腌制使大西洋真鱈肌肉纖維收縮，且擴大了細胞間隙。

圖 5 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片微觀結(jié)構的影響Fig.5 Effect of salting on microstructure of dry-salted Alaska pollock fillets

2.7 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片中揮發(fā)性風味成分的影響

從圖6和表3中對比分析可知，不同鹽漬時間下狹鱈中的揮發(fā)性成分顯示了較大差異（紅色框區(qū)域）?？梢钥吹?，鹽漬15 d后，壬醛、2-甲基丙醛、1-己醇、3-甲基-1-丁醇、異丙醇、乙酸丁酯、乙酸丙酯、2-丁酮、2,3-丁二酮、2-丙酮等物質(zhì)的含量顯著降低（P＜0.05）。其中壬醛主要來源于油酸的氧化，呈魚腥味[29]；3-羥基-2-丁酮呈黃油味，2-丁酮呈辛辣味，為魚類腐敗的主要物質(zhì)[30]，鹽漬過程中這些物質(zhì)的相對含量降低，說明鹽漬降低了魚肉的魚腥味，且魚肉的整體風味得到改善。隨著鹽漬時間的增加，庚醛、己醛、酯類、醇類物質(zhì)等相對含量增加，其中，庚醛呈焦香味和油脂味，己醛呈青草味，均來源于亞油酸氧化，且閾值較低，鹽漬過程中其相對含量均呈增加趨勢，對鹽漬狹鱈的風味起到了積極的作用；酯類、醇類物質(zhì)相對含量均明顯增加，其中，乙酸乙酯呈果香，且閾值較低，其相對含量在鹽漬15 d后顯著增加（P＜0.05），對鹽漬狹鱈的風味起到了積極的作用。

圖 6 不同鹽漬時間下鹽漬狹鱈魚片揮發(fā)性成分指紋譜圖Fig.6 Fingerprint of volatile organic compounds in dry-salted Alaska pollock fillets at different salting time

續(xù)表3

3 結(jié)論

本文采用加鹽量100%（w/w），鹽漬時間15 d，鹽漬溫度10 ℃的條件鹽漬狹鱈魚片，研究鹽漬過程中狹鱈魚片的品質(zhì)變化。隨著鹽漬時間的增加，狹鱈魚肉的TBA值由0.14 mg/kg升至0.26 mg/kg，亞硝酸鹽含量由2.00 mg/kg增加到2.91 mg/kg，兩者均在安全范圍內(nèi)。在鹽漬過程中，鹽漬狹鱈魚片的飽和脂肪酸中硬脂酸（C18:0）和單不飽和脂肪酸中十五碳烯酸（C15:1）和油酸（C18:1n-9c）含量在鹽漬過程中呈升高趨勢，多不飽和脂肪酸中DHA和EPA含量在鹽漬過程中均呈下降趨勢，鹽漬過程中以多不飽和脂肪酸氧化為主。隨著鹽漬時間的增加，狹鱈中游離氨基酸總量呈現(xiàn)先減少后增加，大分子蛋白在鹽漬過程中逐漸降解，在100～245 kDa之間的條帶顏色明顯變淺，肌動蛋白（48 kDa）逐漸增加；在20 kDa以下的蛋白發(fā)生部分降解，肌纖維的橫截面變得不規(guī)則，肌纖維明顯收縮，細胞間隙先變大后變小。在鹽漬過程中，鹽漬狹鱈魚片的腥味成分減少，酯類、醇類物質(zhì)含量增加。關于狹鱈魚片鹽漬過程中微生物群對其品質(zhì)的影響還需進一步研究探討，以期為加工出口型鹽漬狹鱈產(chǎn)品提供了理論支撐，并為鱈魚深加工及其他魚類加工提供了理論支持和參考。