磷脂酶D特性及其在磷脂酰絲氨酸合成中的應(yīng)用

郭碧珊，張夢雪，王鋆坦，杜 瑞，朱海華,2, ，許 君，王法云,2，王 慧,4

（1.河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州 450002；2.河南省食品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450002；4.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200025）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）作為構(gòu)成機(jī)體神經(jīng)組織細(xì)胞的基本磷脂類物質(zhì)，是腦細(xì)胞信息讀取，傳遞和記憶的重要介質(zhì)[1]，被譽(yù)為“大腦維生素[2]”。PS具有預(yù)防老年癡呆[3]，改善大腦記憶，緩解抑郁癥，提高兒童注意力[4]等功效。因此，PS被列為新資源食品和功能性食品，在保健食品、化妝品以及制藥工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[5]。PS的制備方法主要有化學(xué)合成法、溶劑萃取法和酶法合成。其中化學(xué)合成法和溶劑萃取法因工藝復(fù)雜、環(huán)境不友好、產(chǎn)率低、純化困難等不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，而酶法合成因反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、PS產(chǎn)量大、成本低等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[6-8]。磷脂酶D（Phospholipase D，PLD，EC 3.1.4.4）是酶法合成PS的關(guān)鍵酶，其屬于磷酸二酯酶超家族成員[9]，不僅可以將磷脂酰膽堿水解生成磷脂酸（Phosphatidic acid，PA），也可通過轉(zhuǎn)磷脂?；铣蒔S等稀有磷脂[10-11]。PLD在植物、動(dòng)物和微生物中無處不在，其中微生物PLD由于較高的催化性能和簡單的純化過程成為目前PS生產(chǎn)中使用最廣泛的酶[6,12-13]。

近年來微生物PLD的研究主要集中在反應(yīng)體系優(yōu)化以及酶的重復(fù)使用上。黃琳等[14]通過重組表達(dá)獲得PLD，優(yōu)化單水相中PS生成條件，使其產(chǎn)率達(dá)33%；Liu等[15]通過將PLD表面展示到畢赤酵母表面實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)利用，繼而優(yōu)化純水體系中PS的生成條件，最終轉(zhuǎn)化率達(dá)53%； Zhang等[16]將PLD固定化到-C18修飾的有序中孔二氧化硅立方體（OMSC）中，優(yōu)化兩相體系中PS的生成條件，轉(zhuǎn)化率高達(dá)91.2%。大量文獻(xiàn)表明，無論P(yáng)LD酶以何種形式發(fā)揮作用，反應(yīng)體系的不同對(duì)PS產(chǎn)率有很大影響。因此，對(duì)PLD催化制備PS的反應(yīng)體系進(jìn)行研究很有必要。

本文對(duì)微生物PLD的特性及其在制備磷脂酰絲氨酸方面的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并重點(diǎn)介紹了不同的反應(yīng)體系下PLD催化生產(chǎn)PS的差異，為PS的綠色高效生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)，從而加快PS在功能食品中的開發(fā)和應(yīng)用，促進(jìn)我國大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 微生物PLD的特性

1.1 PLD的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

PLD作為磷脂酶超家族成員，具有該家族的明顯特征：高度一致的保守序列HxKxxxxD，該保守序列是催化水解的活性部位。Hough[17]在2000年首次解析出了鏈霉菌PMF-PLD的三維結(jié)構(gòu)（圖1）。該酶分子結(jié)構(gòu)呈雙葉型，兩個(gè)HKD保守序列沿著對(duì)稱軸彼此相鄰。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域單體由三十五個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，呈α-β-α-β-α狀排列，每個(gè)β鏈包括8～9個(gè)β折疊，兩側(cè)含有18個(gè)α螺旋。在二聚體界面上存在一個(gè)30 ?孔徑的活性位點(diǎn)以方便底物進(jìn)入，兩個(gè)柔性環(huán)延伸到活性位點(diǎn)的入口上方，從而可以調(diào)節(jié)界面脂質(zhì)的相互作用。

圖 1 鏈霉菌PMF-PLD的三維蛋白結(jié)構(gòu)Fig.1 Tertiary structures of PMF-PLD

1.2 PLD的催化機(jī)理

PLD是具有特殊性質(zhì)的酯鍵水解酶，具備水解磷酸二酯鍵和堿基互換的能力。一方面它能催化水解磷脂分子中的磷酸和有機(jī)堿（如膽堿、乙醇胺等）羥基成酯的鍵，釋放原來磷脂的極性頭部，生成磷脂酸和羥基化合物膽堿；另一方面，除水解作用外還能催化一些含羥基的化合物與磷脂的堿基進(jìn)行堿基交換反應(yīng)，生成新的磷脂。利用此特性可對(duì)磷脂進(jìn)行改性，以富含磷脂酰膽堿的磷脂為底物，進(jìn)行磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，可為大量制備稀有磷脂和純化單體磷脂提供有效的途徑（圖2）[18]。

圖 2 磷脂酶D的催化反應(yīng)Fig.2 Phospholipase D-catalyzed reaction

1.3 PLD的底物特異性

PLD酶因其來源及結(jié)構(gòu)不同，其底物特異性也不同，可作用于含有不同頭部基團(tuán)的磷脂。且在轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中，受體醇與水分子互為競爭關(guān)系，因此，不同來源PLD的轉(zhuǎn)酯能力取決于兩個(gè)HKD模塊的化學(xué)和空間環(huán)境。與動(dòng)植物來源的PLD相比，微生物來源的PLD有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)酰能力以及更為廣泛的底物選擇譜，其中，鏈霉菌來源的PLD與其它來源PLD相比，由于呈現(xiàn)出最緊密的結(jié)構(gòu)，且轉(zhuǎn)酯與水解能力之比相對(duì)較高，而被廣泛研究[19]。

即使酶來源相同，同種PLD酶的底物特異性也不同，其水解和轉(zhuǎn)酯活力受底物多種因素影響：磷脂?；溄M成、頭部醇的結(jié)構(gòu)尺寸以及底物聚合形態(tài)。通常脂肪酸中含有6～8個(gè)碳原子的?；湵雀L鏈具有更快的催化速率，對(duì)卷心菜和罌粟重組PLD同工酶的研究表明，氨基酸的少量變化也可導(dǎo)致水解和轉(zhuǎn)酯活性的顯著變化[20]。Dippe等[21]通過定點(diǎn)飽和酪氨酸殘基突變研究發(fā)現(xiàn)，頭部醇尺寸越小越有利于酶與底物結(jié)合并發(fā)揮作用。Dawson等[22]對(duì)菠蘿PLD催化多種聚合形態(tài)底物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)底物以小聚合狀態(tài)存在時(shí)，PLD催化能力較強(qiáng)。

1.4 影響PLD活力的因素

影響PLD活力的因素有很多，包括溫度、pH、鹽類、溶劑以及反應(yīng)體系等[23]。PLD最適溫度和pH受其來源影響較大：大多數(shù)PLD的最適催化溫度為25～45 °C，部分在55～60 °C時(shí)活力最高[24]；來源于植物的PLD最適pH在5～6之間，微生物來源的范圍較寬，在4～8之間。鹽對(duì)酶活性的影響也較顯著。研究表明，對(duì)PLD催化反應(yīng)影響最顯著的為鈣離子[25]，鈣離子不僅能激發(fā)PLD的催化活力，而且能提高其熱穩(wěn)定性；TritionX-100等具有乳化作用的鹽也能提高PLD的活性[26]；除此之外，還有Mg2+、Mn2+、Fe2+等均影響PLD酶活，酶來源不同，離子對(duì)其活性作用不同。不同體系中PLD表現(xiàn)的活力也不同，PLD對(duì)水溶性底物的作用比較緩慢，而在油-水界面上作用較好。因此，增加油-水界面條件和有利于酶吸附在界面的因素，可提高酶活力，增加催化反應(yīng)速率。

2 微生物PLD催化制備磷脂酰絲氨酸研究

PS是從牛腦中發(fā)現(xiàn)并被定性的[27]。在PS的結(jié)構(gòu)組成中，帶有負(fù)電荷的頭部為親水性，而由脂肪酸組成的尾部為親脂性[28]。不同來源的PS其脂酰殘基差別較大，因此PS是混合物，不是單一成分。而該性質(zhì)也決定了PS制備方法的多樣性，主要包括化學(xué)合成法、溶劑提取法和PLD酶轉(zhuǎn)化法。

化學(xué)合成法和溶劑提取法屬于非酶催化法?；瘜W(xué)合成工藝復(fù)雜，成本較高，且合成結(jié)束會(huì)出現(xiàn)有機(jī)溶劑濃縮回收以及合成產(chǎn)品中溶劑殘留問題，易使PS受到污染；溶劑提取法有機(jī)溶劑消耗量大，獲得的PS純度低，且由于“瘋牛病”的流行，其安全性受到質(zhì)疑，已經(jīng)逐漸被淘汰[29]。因此，這兩種方法均不符合我國大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和國民綠色健康的理念。而PLD酶法制備磷脂酰絲氨酸既環(huán)保又安全，已經(jīng)成為生產(chǎn)PS的理想方法[30]。

2.1 PLD酶催化法制備磷脂酰絲氨酸

酶催化法是指底物PC和L-絲氨酸在PLD的作用下生成PS。酶催化法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)易控、高效簡單等優(yōu)勢，逐漸得到廣泛的研究及應(yīng)用。由于底物PC和產(chǎn)物PS易溶于有機(jī)相，而PLD和L-絲氨酸易溶于水相，造就了PS制備體系的多樣性，這些體系主要包括單相反應(yīng)體系、兩相反應(yīng)體系和新型環(huán)保溶劑反應(yīng)體系。因此，該研究進(jìn)展對(duì)PS生產(chǎn)的反應(yīng)體系進(jìn)行了總結(jié)。

2.1.1 單相反應(yīng)體系

2.1.1.1 傳統(tǒng)單相反應(yīng)體系 傳統(tǒng)單相反應(yīng)體系即反應(yīng)只在水相中進(jìn)行，全程沒有有機(jī)溶劑的使用。由于卵磷脂的雙親性，反應(yīng)液多為均質(zhì)膠或懸濁液狀態(tài)。一般是先將底物卵磷脂利用均質(zhì)設(shè)備打散，然后在絲氨酸和酶的作用下共同反應(yīng)。黃琳等[14]利用重組PLD在單水相體系中催化大豆卵磷脂進(jìn)行轉(zhuǎn)酯酰反應(yīng)，6 h后PS產(chǎn)率可達(dá)33%；黃婷婷[31]優(yōu)化純水相中生產(chǎn)PS工藝，以PC60為底物，反應(yīng)6 h后，PS轉(zhuǎn)化率可達(dá)到96.7%，副產(chǎn)物PA僅生成0.2%，實(shí)現(xiàn)了底物向產(chǎn)物高效轉(zhuǎn)化。但不可否認(rèn)，單水相中水的存在會(huì)導(dǎo)致PLD的水解活性增強(qiáng)，因此需要進(jìn)一步優(yōu)化條件以降低PC的水解率及提高PS的生成率。

一方面是調(diào)整PC與水的比例和絲氨酸的濃度等條件，一方面是利用硫酸鈣和硅膠作為吸附載體吸附底物PC進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化。Zhang等[32]研究了兩種PC吸附模型：TritonX-100與二氧化硅共價(jià)結(jié)合模型和二氧化硅吸附PC模型。兩種模型被成功用于純水相中PLD介導(dǎo)的轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)，PC裝載量達(dá)到98.9%，PS收益率達(dá)到99.0%，為PS的連續(xù)生物合成提供了一種很有前景的方法。

2.1.1.2 固定化酶單相反應(yīng)體系 到目前為止，固定化PLD已在多種有機(jī)溶劑（如乙醚、氯仿、甲苯）中進(jìn)行轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)，以達(dá)到PS的最大產(chǎn)率[33]。但是有機(jī)溶劑具有易燃性、揮發(fā)性和毒性，使其生產(chǎn)的PS難以應(yīng)用在功能食品和醫(yī)藥制品中，因此提高單水相中轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的效率勢在必行。Mao等[34]將PLD固定在環(huán)氧基載體上，在純水溶液中采用固定化PLD合成PS，轉(zhuǎn)化率65%，整個(gè)過程避免了有機(jī)溶劑的影響，由于其具有安全性，且產(chǎn)品回收過程簡單，因此在PS的工業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的前景。

2.1.2 兩相反應(yīng)體系

2.1.2.1 傳統(tǒng)兩相反應(yīng)體系 傳統(tǒng)的兩相反應(yīng)體系為水-有機(jī)溶劑體系。在兩相體系中，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)和水解反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，且水解反應(yīng)會(huì)影響目的產(chǎn)物PS的生成。一方面有機(jī)溶劑會(huì)與水化層發(fā)生作用，影響酶的活力，另一方面水的存在會(huì)導(dǎo)致水解副產(chǎn)物PA大量生成，降低PS生成率。因此，Chen等[6]首次利用含水量為6.25%（V/V）的微水相-有機(jī)溶劑兩相體系，通過減少水的存在來抑制水解反應(yīng)；馮小娜等[35]則是利用蛋白質(zhì)工程改造策略擴(kuò)大底物PC催化通道，降低位阻效應(yīng)，同時(shí)提高活性位點(diǎn)與絲氨酸的親和力，降低水解反應(yīng)的同時(shí)提高了PS生成率。

兩相反應(yīng)體系的酶轉(zhuǎn)化研究集中在有機(jī)相種類選擇、兩相體積比、PC與絲氨酸質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、pH等方面。表1總結(jié)了目前一些具有代表性的研究結(jié)果。

2.1.2.2 固定化酶兩相反應(yīng)體系 Wu等[40]制備了一種新型的固定化PLD的環(huán)氧樹脂基納米復(fù)合材料。固定化酶在正庚烷為有機(jī)相，磷酸鹽緩沖液為水相的反應(yīng)體系中，實(shí)現(xiàn)了底物PC的高轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)96.2%；Liu等[7]利用基因工程和分子生物技術(shù)將PLD成功展示在畢赤酵母表面，在乙醚為有機(jī)相，乙酸鈉緩沖液為水相的反應(yīng)體系中，PC轉(zhuǎn)化率為67.5%。固定化酶可增強(qiáng)PLD的穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性，表面展示系統(tǒng)還避免了酶的分離純化，具有極大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）是長鏈多不飽和脂肪酸，主要存在于海洋微生物、動(dòng)物和浮游植物體內(nèi)，具有極好的營養(yǎng)保健功能。Zhou等[41]從鯡魚卵中提取富含DHA的磷脂酰膽堿（DHA-PC），合成DHA-PS；于剛等[42]以魷魚卵磷脂為原料，利用PLD酶法合成富含EPA和DHA的PS。然而酶法合成用到的有機(jī)溶劑具有一定的毒性，濃縮回收過程中加熱時(shí)間過長也會(huì)導(dǎo)致熱敏性PS的過氧化值過高。因此兩相反應(yīng)體系生產(chǎn)的PS不適合添加到食品、醫(yī)藥中，所以生物安全型、環(huán)境友好型試劑被逐漸研發(fā)用于PS的合成。

2.1.3 綠色環(huán)保溶劑反應(yīng)體系 水單相反應(yīng)體系會(huì)使反應(yīng)向有利于水解反應(yīng)的方向進(jìn)行，造成副產(chǎn)物PA的大量生成；傳統(tǒng)兩相反應(yīng)體系所用有機(jī)溶劑有毒，生成的PS不適合添加到食品、醫(yī)藥中。因此，各種綠色生物質(zhì)溶劑應(yīng)運(yùn)而生。如γ-戊內(nèi)酯[43-44]、脂肪酸甲酯[45]、檸檬烯[46]、離子液體[47]、深共晶溶劑[48-49]和2-甲基四氫呋喃[44]等，在實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境無污染無毒的同時(shí)，也保證了PLD催化的轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)具有70%～95%的轉(zhuǎn)化率。因此隨著人們健康理念的深入，綠色生物質(zhì)溶劑將具有極大的市場前景。

綜上，PLD酶催化法制備PS的反應(yīng)體系可細(xì)分為五類，表2對(duì)這幾種反應(yīng)體系的特點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)?？傮w而言，目前對(duì)單水相和有機(jī)相/水相雙相系統(tǒng)的研究較多，其PS產(chǎn)率整體上可達(dá)到較高的水平。綠色生物質(zhì)溶劑雖有其獨(dú)特的優(yōu)勢，但是因?yàn)槠鋵儆谛滦腿軇?，目前?duì)這類化合物的研究應(yīng)用還不是很多，和傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑相比究竟哪個(gè)具有更高的人體安全性尚無定論，因此未來仍要著重探索PLD酶在新型溶劑中的催化機(jī)理。

表2 不同反應(yīng)體系的特點(diǎn)Table 2 Characteristics of different reaction systems

3 總結(jié)與展望

隨著我國大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展以及“健康中國”、“綠色產(chǎn)業(yè)”的理念倡導(dǎo)，國民營養(yǎng)健康的需求會(huì)越來越多。磷脂酰絲氨酸作為一種新型食品資源，在改善老年人記憶力、治療抑郁癥和兒童多動(dòng)癥等方面具有重要作用，因此高純度的PS在功能食品和保健食品中市場潛力巨大。本文主要對(duì)微生物PLD酶法制備PS的不同反應(yīng)體系進(jìn)行了綜述?？傮w而言，雖然在單相體系純水溶液中PS的生成率一般低于水-有機(jī)溶劑兩相體系中的生成率，但是要實(shí)現(xiàn)PS在功能食品和醫(yī)藥制品中的安全應(yīng)用，在純水溶液中生產(chǎn)PS是大勢所趨，未來仍是研究方向的重點(diǎn)。建議一方面在PS生成過程中，選擇合適的載體，吸附底物PC或?qū)LD酶固定化，提高酶的利用率，實(shí)現(xiàn)PS的連續(xù)生物合成，降低PS生產(chǎn)成本。另一方面篩選出高轉(zhuǎn)磷脂活性酶的微生物，降低PLD的生產(chǎn)成本，并利用生物技術(shù)手段從分子層面出發(fā)，提高PLD的轉(zhuǎn)酯效率，并繼續(xù)驗(yàn)證新型綠色環(huán)保溶劑的毒理學(xué)評(píng)價(jià)。相信在研究人員的共同努力下，PLD的相關(guān)研究能夠?yàn)榧涌霵S在功能食品新產(chǎn)品中的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為國民健康保駕護(hù)航。