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    液氮凍融聯(lián)合胰蛋白酶消化脫細(xì)胞法構(gòu)建豬心臟瓣膜支架的研究

    2022-06-11 09:33:14崔勇梅富楊胡志斌葛根賢孫高忠
    浙江醫(yī)學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:液氮凍融瓣膜

    崔勇 梅富楊 胡志斌 葛根賢 孫高忠

    心臟瓣膜病是我國常見的成人心臟病,瓣膜置換手術(shù)是目前主要的治療方法。目前臨床上應(yīng)用的人造心臟瓣膜主要有機(jī)械瓣和生物瓣兩大類,均能有效改善血流動(dòng)力學(xué),但又各有缺陷。機(jī)械瓣置換后患者需終身抗凝,因抗凝不當(dāng)而造成的出血和血栓栓塞是影響患者長期存活的重要因素,而生物瓣置換后一般15年左右會(huì)發(fā)生衰敗,需要再次更換[1-2]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,組織工程心臟瓣膜(tissue engineered heart valve,TEHV)有望解決上述問題[3-4]。TEHV的研制涉及瓣膜支架的制備、種子細(xì)胞的選擇、細(xì)胞種植與體外預(yù)適應(yīng)等過程。瓣膜支架的制備是TEHV研究的核心內(nèi)容之一,理想的生物材料支架需具備生物相容性、抗鈣化及細(xì)胞親和性等條件[5-6]。脫細(xì)胞瓣膜是將同種異體或者異種心臟瓣膜作為TEHV的支架材料,具有瓣膜形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整、生物相容性好、利于內(nèi)皮細(xì)胞黏附和生長等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。本研究通過液氮凍融聯(lián)合胰蛋白酶消化的方法,對(duì)豬心臟瓣膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理,期望獲得無免疫原性、結(jié)構(gòu)完整、有抗鈣化潛能的去細(xì)胞瓣膜,為TEHV研制提供合適的支架材料。

    1 材料和方法

    1.1 材料和分組 成年豬(由浙江省桐鄉(xiāng)市濮院國聯(lián)商業(yè)有限公司屠宰場(chǎng)提供)宰殺后即刻(熱缺血時(shí)間10 min以內(nèi))在清潔條件下取出主動(dòng)脈瓣膜,肉眼檢查瓣膜質(zhì)量,留取外觀正常的瓣葉,無菌操作下剪成約1 cm×1 cm的小塊,經(jīng)PBS沖洗后置入液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室處理。將豬心臟瓣膜小塊按隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和未處理組,平均每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)標(biāo)本。

    1.2 方法

    1.2.1 豬心臟瓣膜標(biāo)本的處理 將標(biāo)本予5次液氮凍融,每次3 min;經(jīng)PBS清洗后,實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本浸入0.6%胰蛋白酶溶液,37℃搖床,消化3 d;再經(jīng)PBS清洗后浸入5%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)(批號(hào):A100227,上海生工生物工程股份有限公司)溶液中,40℃,3 d。對(duì)照組標(biāo)本經(jīng)液氮凍融后浸入5%SDS溶液中,37℃,6 d。未處理組通過液氮凍融后,浸入無菌0.9%氯化鈉溶液中,常溫,6 d。

    1.2.2 瓣膜組織大體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分變化觀察 將3組豬心臟瓣膜組織標(biāo)本浸入4%多聚甲醛溶液(批號(hào):P0099,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)中固定12 h,經(jīng)石蠟包埋、組織切片和脫蠟,經(jīng)HE(批號(hào):C0105S,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)染色后,用中性樹脂封片,顯微鏡下觀察。

    1.2.3 瓣膜組織膠原纖維結(jié)構(gòu)觀察 將上述脫蠟后的組織切片,經(jīng)維多利亞藍(lán)(Victoria blue,VB)染液、麗春紅-苦味酸染液(批號(hào):A600985,上海生工生物工程股份有限公司)染色后用中性樹脂封片,顯微鏡下觀察。

    1.2.4 瓣膜組織殘留DNA含量檢測(cè) 將脫細(xì)胞的豬心臟瓣膜標(biāo)本真空抽干后,經(jīng)液氮研磨成粉末,取20 mg,利用 DNA提取試劑盒(批號(hào):9765,日本 TaKaRa公司)提取DNA,利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)殘留DNA含量。

    1.2.5 瓣膜組織α-Gal抗原殘留檢測(cè) 采用Western blot法。將上述的組織粉末,按100 mg組織加入30 μl RIPA溶液(批號(hào):P0013C,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)提取組織蛋白,離心后經(jīng)BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,P0010C)測(cè)定蛋白濃度。以30 μg蛋白作為上樣量,經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入 1∶1 000稀釋的 α-Gal一抗(批號(hào):A01135-2,武漢博士德生物技術(shù)有限公司),4℃孵育過夜;再經(jīng)1∶5 000稀釋的二抗室溫下孵育1 h;清洗后顯影。免疫印跡條帶的灰度值使用Image J軟件分析,并以上樣蛋白量為參照計(jì)算相對(duì)灰度值。

    1.2.6 瓣膜組織抗鈣化潛能觀察 將脫蠟復(fù)水的組織切片,加入茜素紅染色液(批號(hào):ST1078,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)浸染5~10 min;蒸餾水充分洗滌;經(jīng)常規(guī)水化透明后用中性樹脂封片,顯微鏡下觀察。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以 表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 3組豬心臟瓣膜組織大體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分比較實(shí)驗(yàn)組瓣膜組織無明顯的細(xì)胞殘留[(3.8±1.3)%],而對(duì)照組仍有少量細(xì)胞殘留[(17.8±3.7)%],兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);未處理組可見大量的細(xì)胞殘留,見圖 1(插頁)。

    圖1 3組豬心臟瓣膜組織大體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分比較(a:豬心臟瓣膜組織的大體結(jié)構(gòu),HE染色,×200;b:3組心臟瓣膜組織細(xì)胞殘留率比較,**P<0.01)

    2.2 3組豬心臟瓣膜組織膠原纖維結(jié)構(gòu)觀察 實(shí)驗(yàn)組膠原纖維結(jié)構(gòu)完整,纖維束排列整齊,未見明顯破壞和斷裂;對(duì)照組膠原纖維也未受到明顯破壞,但組織略顯疏松,見圖2(插頁)。

    圖2 3組豬心臟瓣膜組織膠原纖維結(jié)構(gòu)觀察(麗春紅-苦味酸染色,×200)

    2.3 3組豬心臟瓣膜組織殘留DNA含量比較 脫細(xì)胞處理后,實(shí)驗(yàn)組瓣膜組織殘留DNA含量為(55.6±16.8)μg/g,對(duì)照組瓣膜組織殘留DNA含量為(750.4±178.1)μg/g,兩組瓣膜組織殘留DNA含量均顯著低于未處理組的(7 563.1±1 169.3)μg/g(均 P<0.01),見圖 3。

    圖3 3組豬心臟瓣膜組織殘留DNA含量比較

    2.4 3組豬心臟瓣膜組織殘留α-Gal抗原比較 與未處理組(0.61±0.07)相比,實(shí)驗(yàn)組無明顯的α-Gal抗原殘留(0.02±0.01),而對(duì)照組仍有少量 α-Gal抗原殘留(0.14±0.02),后兩組的抗原殘留均低于未處理組(均 P<0.01),見圖 4。

    圖4 3組豬心臟瓣膜組織殘留α-Gal抗原比較(a:3組標(biāo)本的α-Gal電泳圖;b:相對(duì)灰度值的比較,**P<0.01)

    2.5 3組豬心臟瓣膜組織抗鈣化潛能比較 大鼠皮下包埋2周后,實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)輕微鈣化結(jié)節(jié),平均結(jié)節(jié)數(shù)為(44±12)個(gè)/mm2;而對(duì)照組鈣化結(jié)節(jié)較多,平均結(jié)節(jié)數(shù)為(157±21)個(gè)/mm2。兩組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量均低于未處理組的(697±165)個(gè)/mm2(均P<0.01),見圖5(插頁)。

    圖5 3組豬心臟瓣膜組織抗鈣化潛能比較(a:3組豬心臟瓣膜組織的茜素紅染色所見,×200;b:?jiǎn)挝幻娣e的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)比較,**P<0.01)

    3 討論

    經(jīng)典的TEHV構(gòu)建方法是按照組織工程學(xué)原理,先構(gòu)建具有心臟瓣膜形態(tài)的支架,然后在支架上種植自體活細(xì)胞,細(xì)胞在支架上生長并逐漸對(duì)原來的支架進(jìn)行改建,最終形成完全由自體細(xì)胞和基質(zhì)所構(gòu)成的瓣膜組織。目前組織工程瓣膜的發(fā)展尚需克服當(dāng)前建模材料的臨床應(yīng)用局限性,才有可能徹底改變瓣膜置換手術(shù)的現(xiàn)狀[9-10]。由于異種移植物具有幾乎無限的可用性,因此可以作為理想的供體組織類型[4]。本研究采用豬心臟瓣膜為研究對(duì)象,通過對(duì)脫細(xì)胞瓣膜的結(jié)構(gòu)完整性、免疫原性及抗鈣化等分析,明確了其作為TEHV支架材料的可行性和潛在優(yōu)勢(shì)。

    支架材料為種子細(xì)胞提供一個(gè)生長、發(fā)育、分泌細(xì)胞外基質(zhì)及發(fā)揮其他功能的生物學(xué)空間,同時(shí)也為鄰近細(xì)胞遷移、生長、分化提供良好的微環(huán)境,為TEHV構(gòu)建提供了細(xì)胞載體與組織結(jié)構(gòu)平臺(tái)。良好的細(xì)胞外支架應(yīng)具備生物相容性良好、表面活性利于細(xì)胞黏附與增殖、適宜的生物降解性、力學(xué)性能好等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。前期研究證實(shí),乙酸和膠原酶方案盡管能分離出基質(zhì)成分,但會(huì)破壞機(jī)械性能[13]。真空冷凍干燥是提高脫細(xì)胞材料支架孔隙率的方法,但一些研究發(fā)現(xiàn)真空冷凍干燥會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白破裂,組織機(jī)械性能有所下降[14-15]。本研究中采用液氮凍融聯(lián)合胰蛋白酶消化和SDS的方法,既有效清除了細(xì)胞及DNA殘留,又保證了組織結(jié)構(gòu)的完整性,是瓣膜材料的優(yōu)化脫細(xì)胞方法。

    成熟TEHV的構(gòu)建需要脫細(xì)胞基質(zhì)框架支持種植細(xì)胞的生長黏附。研究證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是目前TEHV再細(xì)胞化的首選細(xì)胞群,但種植后細(xì)胞生長會(huì)出現(xiàn)極性缺失、排列松散、黏附力較低等問題[16-17]。因此,在脫細(xì)胞去除免疫原性的同時(shí),不破壞基質(zhì)細(xì)胞生長黏附的性能顯得尤為重要。目前,各種類型的涂層具備良好的細(xì)胞生長特性,顯著提升脫細(xì)胞支架的細(xì)胞附著性能,如PHBHHx涂層[18]、鈦基表面納米銀復(fù)合涂層[19]、Galectin-8[20]等。本研究中采用液氮凍融聯(lián)合胰蛋白酶消化和SDS的方法,在基質(zhì)完整性保持方面具有較好的效果,但對(duì)于種植細(xì)胞的黏附生長等方面的特性還需進(jìn)一步研究,為生物材料的組織工程瓣膜發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

    本研究采用液氮凍融聯(lián)合胰蛋白酶消化對(duì)豬心臟瓣膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理,可有效去除殘余細(xì)胞成分,降低免疫排斥反應(yīng);保留基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性,維持天然的組織結(jié)構(gòu)和功能;具有一定的抗鈣化效果,延長生物材料的潛在使用期。運(yùn)用該方法獲得的脫細(xì)胞豬心臟瓣膜,可作為TEHV的優(yōu)質(zhì)支架材料。

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