前癃通膠囊對前列腺增生大鼠前列腺組織TFF2、Wnt4、Wnt6的影響

朱文雄　袁軼峰　陳立蔓　張熙　劉濤　李博　陳其華

〔摘要〕 目的 觀察前癃通膠囊對前列腺增生大鼠前列腺組織三葉因子2（trefoil factor 2， TFF2）、Wnt4、Wnt6的影響及其作用機制。方法 取12只大鼠作為空白對照組。另取60只大鼠行去勢手術(shù)，術(shù)后隨機均分為前癃通高、中、低劑量組和癃閉舒組、模型對照組，于術(shù)后第8天開始皮下注射丙酸睪酮，每次1 mg/300 g，1次/d，連續(xù)30 d，建立前列腺增生大鼠模型。造模的同時，進行灌胃干預(yù)，每次1 mL/100 g，1次/d，持續(xù)30 d。前癃通低、中、高劑量組前癃通藥液56.25、112.5、225.0 mg/mL;癃閉舒組給予癃閉舒藥液168.75 mg/mL;空白對照組、模型對照組給予蒸餾水。末次給藥結(jié)束后24 h，比較各組體質(zhì)量及前列腺濕質(zhì)量、體積、指數(shù);采用HE染色法觀察前列腺組織;采用Western blot檢測各組大鼠前列腺組織中TFF2、Wnt4、Wnt6蛋白表達情況。結(jié)果 空白對照組前列腺腔平滑圓潤，上皮低柱狀，管腔內(nèi)見淡粉染均質(zhì)狀物，間質(zhì)內(nèi)幾乎沒有血管充血、炎性細胞浸潤;模型對照組前列腺腔明顯擴張，腺上皮呈高柱狀，腔內(nèi)充滿粉色濃染均質(zhì)狀物，有明顯的炎性細胞浸潤;前癃通各劑量組和癃閉舒組前列腺組織病理改變較模型對照組有不同程度的改善，腔內(nèi)均質(zhì)狀物顏色變淺，上皮低柱狀，未見明顯炎性細胞浸潤。其中，前癃通高劑量組與癃閉舒組改善效果更為明顯。模型對照組TFF2、Wnt4、Wnt6蛋白表達水平、前列腺濕質(zhì)量、體積、指數(shù)均明顯大于空白對照組（P<0.05，P<0.01）。前癃通中、高劑量組及癃閉舒組TFF2、Wnt4、Wnt6蛋白表達水平、前列腺濕質(zhì)量、體積、指數(shù)均明顯小于模型對照組（P<0.05，P<0.01）。前癃通低劑量組前列腺濕質(zhì)量、體積、指數(shù)均明顯大于癃閉舒組（P<0.05，P<0.01）。前癃通中、高劑量組Wnt4、Wnt6蛋白表達水平、前列腺濕質(zhì)量、體積、指數(shù)及前癃通高劑量組TFF2蛋白表達水平均明顯小于前癃通低劑量組（P<0.05，P<0.01）。前癃通高劑量組前列腺體積明顯小于前癃通中劑量組、癃閉舒組（P<0.01）。前癃通中、高劑量組Wnt4、Wnt6蛋白及前癃通高劑量組TFF2蛋白表達水平均明顯小于癃閉舒組（P<0.01）。前癃通高劑量組TFF2、Wnt4蛋白表達水平明顯小于前癃通中劑量組（P<0.01）。結(jié)論 前癃通各劑量組在降低前列腺濕質(zhì)量、減少前列腺體積與指數(shù)方面呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)性量效關(guān)系。前癃通膠囊治療前列腺增生療效確切，其作用機制可能與干預(yù)TFF/Wnt信號通路，下調(diào)TFF2、Wnt4、Wnt6蛋白表達有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 前列腺增生;前癃通膠囊;Wnt;三葉因子2;Wnt4;Wnt6

〔中圖分類號〕R277.5? ? ? ? 〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.05.009

Effect of Qianlongtong Capsule on TFF2， Wnt4 and Wnt6 in prostate tissue of

rats with prostatic hyperplasia

ZHU Wenxiong1， YUAN Yifeng1， CHEN Liman1， ZHANG Xi2， LIU Tao1， LI Bo1， CHEN Qihua1*

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. The Second People's Hospital of Hunan Province， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Qianlongtong Capsule on trefoil factor 2 （TFF2）， Wnt4， Wnt6 in prostate tissue of rats with prostatic hyperplasia and its mechanism. Methods 20 rats were used as blank control group. 60 rats were selected for castration surgery. After surgery， they were randomly divided equally into Qianlongtong high-dose， medium-dose， and low-dose group， Longbishu group， and model control group. The rat model of prostatic hyperplasia was established by subcutaneous injection of testosterone propionate at 1 mg/300 g once a day for 30 consecutive days on the 8th postoperative day. At the same time of modeling， gavage intervention was performed， 1 mL/100 g each time， once a day， for 30 d. Blank control group and model control group were given distilled water. Qianlongtong low-dose， middle-dose， and high-dose groups were given the Qianlongtong drug liquid 56.25， 112.5， 225.0 mg/mL. Longbishu group was given Longbishu drug liquid 168.75 mg/mL. 24 h after the last administration， body weight， wet weight， volume and index of prostate were compared among all groups. Prostate tissue was observed by HE staining. The protein expression levels of TFF2， Wnt4 and Wnt6 in prostate tissues were detected by Western blot. Results In the blank control group， the prostate lumen was smooth and round， the epithelium was low columnar， and there was light powder stained homogeneous substance in the lumen， and there was almost no vascular congestion and inflammatory cell infiltration in the interstitium. In the model control group， the prostate lumen was obviously dilated， and the glandular epithelium was tall columnar， and the lumen was full of pink stained homogeneous material， with obvious inflammatory cell infiltration. Compared with model control group， the pathological changes of prostate tissue in the Qianlongtong each dose group and Longbishu group were improved in varying degrees. The homogenous luminal structures became pale in color， the epithelium was low columnar， and no obvious inflammatory cell infiltration was observed. Among them， the Qianlongtong high-dose group and Longbishu group had more obvious improvement. Compared with blank control group， the protein expression levels of TFF2， Wnt4 and Wnt6 and wet weight， volume and index of prostate in model control group increased （P<0.05， P<0.01）. Compared with model control group， the protein expression levels of TFF2， Wnt4 and Wnt6 and wet weight， volume and index of prostate in Qianlongtong middle-dose， and high-dose groups and Longbishu group decreased （P<0.05， P<0.01）. Compared with Longbishu group， the wet weight， volume and index of prostate in Qianlongtong low-dose group increased （P<0.05， P<0.01）. Compared with Qianlongtong low-dose group， the protein expression levels of Wnt4 and Wnt6 and wet weight， volume and index of prostate in Qianlongtong middle-dose and high-dose groups， as well as the protein expression level of TFF2 in Qianlongtong high-dose group decreased （P<0.05， P<0.01）. Compared with Qianlongtong middle-dose group and Longbishu group， volume of prostate in Qianlongtong high-dose group decreased （P<0.01）. Compared with Longbishu group， the protein expression levels of Wnt4 and Wnt6 in Qianlongtong middle-dose and high-dose groups and the protein expression level of TFF2 in Qianlongtong high-dose group decreased （P<0.01）. Compared with Qianlongtong middle-dose group， the protein expression levels of TFF2 and Wnt4 in Qianlongtong high-dose group decreased （P<0.01）. Conclusion Qianlongtong each dose group showed a certain positive correlation in reducing wet weight， volume and index of prostate. Qianlongtong Capsule is effective in treating prostatic hyperplasia， and its mechanism may be related to interfering TFF/Wnt signaling pathway and down-regulating TFF2， Wnt4 and Wnt6 protein expression.EB65E8DF-5337-45BA-A6FD-4CA01EDF54A7

〔Keywords〕 prostatic hyperplasia; Qianlongtong Capsule; Wnt; trefoil factor 2; Wnt4; Wnt6

前列腺增生（prostatic hyperplasia， PH）是男性解剖學(xué)前列腺增大及其間質(zhì)、腺體的增生[1]，其以尿急、尿頻、尿痛、排尿不暢及腰背部不適[2]為主要臨床表現(xiàn)。PH屬于中醫(yī)學(xué)“精癃”范疇，膀胱為人體水液匯聚之所，腎虛氣化不利，故水液內(nèi)停于膀胱。國家級名中醫(yī)賀菊喬教授結(jié)合臨床實踐，認為PH應(yīng)屬于“癥瘕病”范疇，其發(fā)病不離兩個核心病機——“虛損生積”和“血瘀致癥”，治法宜益氣利水、活血消癥，特擬前癃通湯進行治療，療效顯著[3-4]。目前，PH的治療方案包括侵入性手術(shù)治療、微波熱療和藥理學(xué)治療[5]。侵入性手術(shù)和微波熱療存在一定的風(fēng)險，而長期使用西藥又存在一定的不良反應(yīng)[6]，因此，尋找一種相對安全有效的中藥復(fù)方對防治PH意義重大。

TFF/Wnt信號通路作為經(jīng)典的影響細胞增殖和纖維化的通路，其在增生性疾病中的作用機制已成為近年來研究的熱點議題[7-8]。TFF/Wnt信號通路與PH的發(fā)病密切相關(guān)，可能是引發(fā)前列腺細胞增生的關(guān)鍵通路[9]。前癃通膠囊在前期研究中發(fā)現(xiàn)，可以縮小前列腺體積、降低前列腺指數(shù)[10]，從而改善尿道癥狀。為了更深入地探討其作用機制，本實驗研究了前癃通膠囊對前列腺組織三葉因子2（trefoil factor 2， TFF2）、Wnt4、Wnt6蛋白表達的影響，為臨床治療PH提供用藥指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1? 動物

健康成年SPF級雄性SD大鼠72只，7～8周齡，體質(zhì)量（290±20） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。室溫18～20 ℃，濕度65%～70%，光照時間12 h/d，自由進食飲水。動物實驗倫理審批號：HN-LL-GZR-202108。

1.2? 主要藥物與試劑

前癃通膠囊（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，0.45 g×40粒/瓶，批號：20180619）;癃閉舒膠囊（石家莊科迪藥業(yè)有限公司，0.3 g×36粒/盒，批號：171004）。伊紅染色液（武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR11800-2）;超凈高級封片膠（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：YZB）;Scott藍化液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1865）;BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號：CW0014S）;丙烯酰胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：J173005）。

1.3? 主要儀器及設(shè)備

切片機（湖北伯納醫(yī)療科技有限公司，型號：BQ-318）;單道可調(diào)移液器（上海梅特勒-托利多儀器有限公司，型號：E4-10XLS+）;藥品冷藏柜（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，型號：BYC-310）;高速冷凍離心機（常州中捷實驗儀器制造有限公司，型號：TGL-16D）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號：DHG-9070A）;紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司，型號：UV-1600PC）;蛋白垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ）;顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：CX41）;超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號：ChemiDoc XRS+）。

1.4? 造模、分組及給藥[11]

72只SD大鼠普通飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，隨機抽取60只大鼠行去勢手術(shù)：麻醉，固定后消毒并切開皮膚，經(jīng)陰囊摘除兩側(cè)睪丸，殘端處縫扎止血，關(guān)閉皮膚，常規(guī)肌內(nèi)注射青霉素20萬U/只。術(shù)后隨機分為5組，即模型對照組、癃閉舒組、前癃通低劑量組、前癃通中劑量組、前癃通高劑量組，每組12只;未行去勢手術(shù)的12只大鼠作為空白對照組。模型對照組、癃閉舒組、前癃通低劑量組、前癃通中劑量組、前癃通高劑量組于術(shù)后第8天開始皮下注射丙酸睪酮每次1 mg/300 g，1次/d，連續(xù)30 d，建立前列腺增生大鼠模型。造模的同時，進行藥物干預(yù)（大鼠給藥劑量均按照人和大鼠的體表面積計算法進行計算）：空白對照組、模型對照組大鼠給予蒸餾水灌胃，每次1 mL/100 g，1次/d，持續(xù)30 d;前癃通低、中、高劑量組大鼠給予相應(yīng)濃度的前癃通藥液（取前癃通膠囊中藥粉溶入蒸餾水中，前癃通低、中、高劑量組藥液濃度分別配制成56.25、112.5、225.0 mg/mL，分別為臨床常用劑量的1、2、4倍）灌胃，每次1 mL/100 g，1次/d，持續(xù)30 d;癃閉舒組大鼠給予癃閉舒藥液（取癃閉舒膠囊中藥粉溶入蒸餾水中，配制成168.75 mg/mL，為臨床常用劑量的2倍）灌胃，每次1 mL/100 g，1次/d，持續(xù)30 d。末次給藥結(jié)束后24 h，給大鼠稱質(zhì)量，用異氟烷處死大鼠后摘除前列腺組織，測量前列腺濕質(zhì)量、體積（采用水取代法），計算前列腺指數(shù)（前列腺濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%），并進行后續(xù)的指標(biāo)檢測。

1.5? HE染色觀察前列腺組織

先用流水沖洗各組大鼠的前列腺組織，再經(jīng)濃度為70%、80%、90%的乙醇脫水，置入無水乙醇與二甲苯的等量混合液中15 min，二甲苯Ⅰ 15 min，二甲苯Ⅱ 15 min，直至透明為止。置入二甲苯與石蠟各半的混合液中15 min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ中透蠟各50～60 min。石蠟包埋后切片，烤片，脫蠟，水化。將已入蒸餾水的切片依次用蘇木精染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返藍液返藍15 s，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，中性樹脂封片，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠前列腺組織的病理形態(tài)學(xué)改變情況。

1.6? Western blot檢測TFF2、Wnt4、Wnt6蛋白表達水平EB65E8DF-5337-45BA-A6FD-4CA01EDF54A7

按要求配制SDS-PAGE分離膠與濃縮膠，加入已經(jīng)架好的制膠板中，待分離膠凝固后，加入濃縮膠，并插上齒梳。等濃縮膠完全凝固后，稀釋成10倍的電泳液，將架子放入電泳液里并拔去齒梳，加入一定體積的蛋白樣品和Marker。開始電泳，60 V壓縮蛋白，80 V分離蛋白，當(dāng)條帶跑至膠板一半的時候配制轉(zhuǎn)膜液，并預(yù)冷。根據(jù)預(yù)計條帶的位置裁剪好PVDF膜，甲醇激活15 s。切好大小合適的膠，含有目的條帶。布好“三明治”（海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿），配制5%的BSA封閉液，封閉過夜。配制一抗稀釋液，將PVDF膜孵育一抗3 h。洗膜3次，每次10 min，配制二抗稀釋液，將PVDF膜孵育二抗2 h。洗膜3次，每次10 min，配制發(fā)光液，成像。

1.7? 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以“x±s”表示，滿足正態(tài)性、方差齊性，采用隨機設(shè)計的方差分析，采用LSD法兩兩比較，不滿足方差齊性則應(yīng)采用Kruskal-Wallis H檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組大鼠體質(zhì)量及前列腺濕質(zhì)量、體積、指數(shù)比較

各組體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。模型對照組前列腺濕質(zhì)量、體積、指數(shù)均明顯大于空白對照組（P<0.01）。前癃通中、高劑量組及癃閉舒組前列腺濕質(zhì)量、體積、指數(shù)均明顯小于模型對照組（P<0.05，P<0.01）。前癃通低劑量組前列腺濕質(zhì)量、體積、指數(shù)均明顯大于癃閉舒組（P<0.05，P<0.01）。前癃通中、高劑量組前列腺濕質(zhì)量、體積、指數(shù)均明顯小于前癃通低劑量組（P<0.05，P<0.01）。前癃通高劑量組前列腺體積明顯小于前癃通中劑量組、癃閉舒組（P<0.01）。詳見表1。

2.2? 各組大鼠前列腺組織病理形態(tài)學(xué)比較

空白對照組前列腺腔平滑圓潤，上皮低柱狀，管腔內(nèi)見淡粉染均質(zhì)狀物，間質(zhì)內(nèi)幾乎沒有血管充血、炎性細胞浸潤;模型對照組前列腺腔明顯擴張，腺上皮呈高柱狀，腔內(nèi)充滿粉色濃染均質(zhì)狀物，有明顯的炎性細胞浸潤;前癃通各劑量組和癃閉舒組前列腺組織病理改變較模型對照組有不同程度的改善，腔內(nèi)均質(zhì)狀物顏色變淺，上皮低柱狀，未見明顯炎性細胞浸潤。其中，前癃通高劑量組與癃閉舒組改善效果更為明顯。詳見圖1。

2.3? 各組大鼠前列腺組織中TFF2、Wnt4、Wnt6蛋白表達水平比較

模型對照組TFF2、Wnt4、Wnt6蛋白表達水平均明顯大于空白對照組（P<0.05）。前癃通低、中、高劑量組及癃閉舒組TFF2、Wnt4、Wnt6蛋白表達水平均明顯小于模型對照組（P<0.05，P<0.01）。前癃通中、高劑量組Wnt4、Wnt6蛋白及前癃通高劑量組TFF2蛋白表達水平均明顯小于癃閉舒組（P<0.01）。前癃通中、高劑量組Wnt4、Wnt6蛋白及前癃通高劑量組TFF2蛋白表達水平均明顯小于前癃通低劑量組（P<0.01）。前癃通高劑量組TFF2、Wnt4蛋白表達水平明顯小于前癃通中劑量組（P<0.01）。詳見表2、圖2。

3 討論

目前，PH發(fā)生的具體機制尚不明確，其可能與年齡、性激素、間質(zhì)-上皮細胞相互作用、生長因子相關(guān)[12]。研究表明，PH的發(fā)生是由于前列腺上皮和間質(zhì)細胞的增殖和凋亡的平衡性破壞引起，尤其與細胞的凋亡減少有關(guān)[13-14]。以調(diào)控細胞增殖與凋亡為干預(yù)靶點可為防治PH提供新的可行途徑[15]。TFF/Wnt信號通路是一條在生物進化中極為保守的通路，參與細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤的發(fā)生、組織器官的形成、發(fā)育等諸多生命過程，其作為經(jīng)典的影響細胞增殖和纖維化的通路，其在增生性疾病中的作用機制已成為近年來研究的熱點[7-8]。研究證實，TFF/Wnt信號通路參與了雄激素對前列腺上皮細胞的有絲分裂的影響[16-17]。目前，在脊椎動物中共發(fā)現(xiàn)了Wnt1、Wnt3、Wnt4、Wnt5a、Wnt6、Wnt11等19種Wnt基因，其中Wnt4對泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要[18]。研究發(fā)現(xiàn)，TFF2對支氣管上皮細胞增殖、遷移、分化具有協(xié)同作用，同時對肺和胃損傷后上皮細胞增殖也有影響，并且發(fā)現(xiàn)TFF2可以影響Wnt信號通路，特別是Wnt4和Wnt6蛋白，TFF/Wnt信號通路與PH的發(fā)病密切相關(guān)，可能是引發(fā)前列腺細胞增生的關(guān)鍵通路[9]。因此，深入探討TFF/Wnt通路對PH發(fā)生的影響及其作用機制，可為PH的治療提供新的靶點。

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國家級名老中醫(yī)賀菊喬教授從事中醫(yī)男性病的臨床、教學(xué)、科研工作近50年，于2003年在國內(nèi)首次提出PH當(dāng)屬“癥瘕病”的范疇[19]。特擬前癃通湯進行治療，全方由黃芪、三七、丹參、炒王不留行、蒲黃、大血藤、黨參、益母草等藥物組成，目前，該方已制成院內(nèi)制劑前癃通膠囊，并在臨床使用[10，20]，其療效佳，見效快。賀教授認為PH的病機關(guān)鍵在于氣虛血瘀癥積[21-22]，治宜益氣利水、活血消癥，患者因年事漸高，肝腎漸虧，肺脾之氣不足，氣血生化乏源，導(dǎo)致氣虛體弱、中氣不足，氣虛則氣行無力，氣機阻滯，氣滯則血隨氣阻，氣停則水道不利，氣虛則生積，血瘀則癥生。前癃通膠囊中重用黃芪為君藥，益氣健脾、保護氣血，使祛瘀消癥而不傷正;黨參、蒲黃為臣，益氣、活血、利水三法齊備;益母草、大血藤清熱利尿、活血通絡(luò)，三七、丹參活血化瘀、消癥散結(jié)，炒王不留行利尿通淋、活血通經(jīng)，上5味共為佐藥，以輔助君臣藥益氣利水、活血消癥。諸藥相合，相輔相成，既能緩解PH的主要癥狀，又能縮小前列腺體積，將益氣活血消癥的思想貫徹全方。

本實驗結(jié)果表明，前癃通膠囊與對照藥物癃閉舒膠囊均能夠不同程度地降低PH模型大鼠的前列腺濕質(zhì)量、減少前列腺體積與前列腺指數(shù)，其中前癃通高劑量組的療效優(yōu)于癃閉舒組，且前癃通各劑量組在降低前列腺濕質(zhì)量、減少前列腺體積與指數(shù)方面呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)性量效關(guān)系。通過Western blot法檢測各組大鼠前列腺組織中TFF2、Wnt4、Wnt6蛋白的表達情況，模型對照組前列腺濕質(zhì)量及體積、前列腺指數(shù)均顯著升高（P<0.05），而前癃通膠囊和癃閉舒膠囊的治療可以逆轉(zhuǎn)這一趨勢，各治療組的TFF2、Wnt4、Wnt6蛋白表達水平都有不同程度的降低（P<0.05，P<0.01），其中，前癃通中、高劑量組的療效強于癃閉舒組（P<0.01），且前癃通各劑量組降低TFF2、Wnt4蛋白表達水平的作用隨著劑量的增加而增強（P<0.01）。本研究證實前癃通膠囊可以降低前列腺濕質(zhì)量、縮小前列腺體積與前列腺指數(shù)，減少前列腺的腺上皮面積和間質(zhì)面積，改善前列腺組織的病理形態(tài)學(xué)，從而發(fā)揮治療PH的作用。綜上所述，前癃通膠囊對于改善PH的機制可能與干預(yù)TFF/Wnt信號通路，下調(diào)TFF2、Wnt4、Wnt6蛋白的表達密切相關(guān)。EB65E8DF-5337-45BA-A6FD-4CA01EDF54A7

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