液相色譜-質(zhì)譜法高精準(zhǔn)檢測獸肉中萊克多巴胺

黃永生　葉夏聲　何玉榆　黃婷　陳彤

摘? 要：本研究基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了一種高精準(zhǔn)檢測鹽酸萊克多巴胺的方法，對所建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)的考察與驗證。參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對標(biāo)準(zhǔn)的前處理步驟進(jìn)行優(yōu)化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析。其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.999 93，方法檢出限為0.068 8 μg/kg，回收率范圍為93.4%～100.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～3.7%。所得結(jié)果表明該方法檢出限較低，回收率好，處理步驟簡單，得到的結(jié)果精準(zhǔn)度高，重復(fù)性好，為萊克多巴胺的檢測提供了新思路。

關(guān)鍵詞：萊克多巴胺;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;前處理優(yōu)化;高精密度

中圖分類號：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2022）04-0085-04

鹽酸萊克多巴胺（ractopamine，RAC），別名雷托巴胺、舒喘靈、金萊多巴、權(quán)萊克、Paylean，化學(xué)名稱為4-[3-[2-羥基-2-（4-羥基苯基）-乙基]氨基丁基]苯酚（4-[3-[2-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）-ethyl]aminobutyl]phenol），是美國研制合成的一種β-腎上腺受體激動劑類化合物，但被非法商家用作新一代的瘦肉精，被添加于飼料產(chǎn)品中，用于替代克倫特羅來提高動物生產(chǎn)效率[1]。相比克倫特羅，RAC具有毒性小、代謝快的特性，故各國政府對其在養(yǎng)殖業(yè)中適用范圍的規(guī)定各不相同。目前，在美國、日本、墨西哥、澳大利亞等國家，RAC可作為瘦肉精被用在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，以此來提高畜禽的蛋白質(zhì)含量及瘦肉率。但消費者大量食用含RAC殘留的肉制品后，大概率會引發(fā)中毒癥狀，如惡心、嘔吐、頭暈、頭痛、肌肉震顫、心悸、心律失常、血壓上升等，嚴(yán)重時甚至?xí)绊懮诚到y(tǒng)[2-4]。故為了國民身體健康安全，我國政府已經(jīng)對該類藥物實施全面禁用，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中將萊克多巴胺及其鹽類物質(zhì)列為檢測藥品，并于2011年12月5日起在中國境內(nèi)禁止生產(chǎn)和銷售RAC;在第176號等公告中明確了在動物飼養(yǎng)過程中禁止使用鹽酸克倫特羅。

目前，對萊克多巴胺的檢測有多種方法，主要有氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、毛細(xì)管電泳技術(shù)、液相色譜—質(zhì)譜法? ? ? ? ?等[5-7]，但這些方法大多存在前處理過程繁瑣、復(fù)雜、費時的缺點，快速檢測的方法則存在精準(zhǔn)度低、檢測對象單一等不足。故本研究基于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025公告-18-2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、GB/T21313-2017《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》、GB/T22286-2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》等[8-10]，建立了一種樣品的快速凈化手段，縮短了前處理的時間，有效地提高了檢測工作的效率。

1? 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

安捷倫1290液相色譜儀、AB Science質(zhì)譜儀、氮吹儀、多管漩渦混合儀、天平、旋渦混合器、冷凍離心機(jī)、超純水儀、超聲波清洗機(jī)、混合陽性離子（mixed-mode cation exchanger，MCX固相萃取柱（規(guī)格為3 cc、60 mg）、恒溫水浴搖床。

1.1.2 藥品與試劑

0.2 mol/L乙酸銨（pH=5.2）;0.1 mol/L高氯酸溶液;5%氨化甲醇;甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）;乙酸（分析純）;氫氧化鈉（分析純）;β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶（20 U/mL）;復(fù)溶液：甲醇/水/甲酸（v/v/v =10∶90∶0.09）。

1.2 樣品準(zhǔn)備

取適量新鮮牛肉組織，將其攪碎為肉質(zhì)均勻的狀態(tài)，于-20 ℃避光保存。

1.3 標(biāo)液配制

準(zhǔn)確稱取萊克多巴胺的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃冰箱中保存，有效期6個月;再分別移取適量的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇逐級稀釋成適當(dāng)濃度的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g（±0.01 g）試樣，置于50 mL離心管中，加入8.0 mL 0.2 moL/L乙酸銨溶液（pH=5.2）和40 ?L β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶（20 U/mL），加蓋? ? ?2 000 r/min渦旋振蕩8 min，37 ℃恒溫?fù)u床避光酶解18 h。酶解后放置至室溫，在酶解液中加入300 ?L高氯酸（將pH調(diào)至1.00），渦旋30 s，10 000 r/min低溫離心5 min，移上清液于另一離心管中。在殘渣中加入2 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，渦旋30 s，10 000 r/min 低溫離心5 min，合并上清液。上清液中加入570 μL 5 mol/L的NaOH（將pH調(diào)至4.00），備用。

MCX固相萃取柱分別依次用5 mL甲醇、5 mL水活化。取備用液全部過柱，再依次用? ?5 mL水、5 mL甲醇淋洗小柱，抽干。用5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集至15 mL塑料離心管。洗脫液在50 ℃下氮氣吹干，用復(fù)溶劑將濃縮液定容至1 mL，劇烈振蕩5 min，用1 mL針筒移取過0.22 μm濾膜，供液質(zhì)儀測定。

2? 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號公告-18-2008《動物源食品中磺胺類藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn)條件設(shè)置儀器參數(shù)，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液（0.25 μg/kg、? ?0.50 μg/kg、1.00 μg/kg、2.50 μg/kg、5.00 μg/kg），待儀器基線穩(wěn)定后，對系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 93。

2.2 檢出限測定

使用空白牛肉樣品做基質(zhì)，設(shè)置一個濃度C （0.25 μg/kg）的陽性樣，按照操作進(jìn)行前處理，之后上機(jī)測定，測得萊克多巴胺的信噪比為S/N=10.9，可計算檢出限（method detection limit，MDL）為0.068 8 μg/kg。計算公式如下：

檢出限（MDL）（μg/kg） =3C/（S/N）

2.3 方法精密度和回收率測定

以空白牛肉樣品為基質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，加標(biāo)濃度為0.25 ?g/kg、0.50 ?g/kg、 2.50 ?g/kg。將加標(biāo)樣品和空白樣品按方法進(jìn)行前處理，上機(jī)測試，方法精密度和回收率結(jié)果分別見表1、表2所示。根據(jù)表1與表2中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，且回收率表現(xiàn)較好，萊克多巴胺的回收率介于93.4%～100.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～3.7%。該方法的檢出限較低、重復(fù)性較好，也能保持較為優(yōu)異的回收率，可用于萊克多巴胺的準(zhǔn)確定性、定量 檢測。

3? 結(jié)論

本研究提出了一種高效檢測萊克多巴胺的方法，優(yōu)化了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提取步驟，采用乙酸銨對酶解后的牛肉進(jìn)行提取，提取離心后過固相萃取柱進(jìn)行凈化，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定。整個過程所進(jìn)行操作簡單，對前處理過程設(shè)備要求低，所需溶劑相對較少。同時，結(jié)果表明，該方法的檢出限低，回收率較好，且重復(fù)效果好，有效地消除了基質(zhì)效應(yīng)的干擾，提高了萊克多巴胺的方法檢測的準(zhǔn)確性及精密度，有效地節(jié)約了檢測時間和人力，提升了檢測的效果。通過多種食品樣品的實測實驗證明，本方法適用于畜禽肌肉組織中萊克多巴胺的快速定性、定量檢測。

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