山西省3種野生黃芩屬植物表型及分子水平分析

詹海仙，杜晨暉，劉曉麗，裴香萍，李 睿，張?jiān)聵s，張朔生

(山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院，山西晉中 030619)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)為山西省十大晉藥之一，根部具有抗氧化、抗炎、抗微生物、抗衰老、保肝等作用[1]。利用黃芩地上部分生產(chǎn)黃芩茶或黃金茶在中國(guó)北方地區(qū)由來(lái)已久，該藥茶具有清熱燥濕，瀉火解毒，消炎和促消化等功效。黃芩還具有抗菌性好，不產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)，是中國(guó)藥典收錄的常用中藥[2]。

近年的研究發(fā)現(xiàn)黃芩提取物還可在細(xì)胞水平有效抑制新冠病毒的復(fù)制[3]。隨著黃芩功效的不斷開(kāi)發(fā)，其需求也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，但是對(duì)野生藥用植物的無(wú)序采挖導(dǎo)致野生黃芩資源破壞嚴(yán)重，已無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。藥用植物親緣學(xué)提出親緣關(guān)系越近的藥用植物，其外觀性狀和化學(xué)成分越接近[4]。因此，從近緣種中挖掘適合的黃芩代用品是解決野生黃芩資源不足的方法之一[5]。粘毛黃芩(S.viscidulaBunge.)和并頭黃芩(S.scordifoliaFisch.ex Schrank)是山西省北部分布的兩種野生唇形科黃芩屬植物。其中，粘毛黃芩又稱黃花黃芩，以根部入藥，味苦、性寒，主治肺熱咳嗽、目赤腫痛、濕熱等癥，由于含有黃芩苷且藥效相近在部分地區(qū)作為黃芩替代品使用[1,6]。并頭黃芩又稱頭巾草，是以全草入藥，性寒，微苦，具有清熱解毒、瀉熱利尿的作用，可用于各種熱毒病癥的治療，部分地區(qū)有作為藥茶飲用的習(xí)俗[1,7]。上述3種材料在植株形態(tài)、葉形、花形等性狀方面相似度較高，導(dǎo)致準(zhǔn)確鑒定的難度較大。

目前黃芩屬相關(guān)的研究主要聚焦于化學(xué)成分分析、黃酮等成分生物合成等藥理、藥效方面[8-9]。關(guān)于黃芩屬植物學(xué)性狀和種質(zhì)資源的分析主要涉及黃芩和粘毛黃芩種子形態(tài)、3種黃芩植物花粉形態(tài)、黃芩植物根、莖、葉表皮形態(tài)、黃芩DNA條形碼、黃芩生境和群落方面的研究[10-14]。以上研究盡管對(duì)3種黃芩的有效成分等研究相對(duì)比較明確，但仍無(wú)法快速準(zhǔn)確對(duì)上述3種植物和藥材進(jìn)行鑒定。

表型性狀分析是通過(guò)植物株高、葉片形態(tài)、花色、種子等形態(tài)上的差異進(jìn)行材料分析，是眾多鑒定方法中最直觀、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的方法[15]。該方法在藥用植物資源鑒定等研究上沿用至今，《中國(guó)植物志》《中國(guó)高等植物圖鑒》和Flora of China等植物資源鑒定方面的書(shū)籍均主要以植物各部分形態(tài)特征作為分類依據(jù)。葉綠體微衛(wèi)星(cpSSR)是一類基于葉綠體基因組序列開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)，既保留了核基因組分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，又具有共顯性高、多態(tài)性好、重復(fù)性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單和分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)，可從分子水平對(duì)藥用植物進(jìn)行分析[16]。在表型分析的基礎(chǔ)上利用葉綠體分子標(biāo)記已在近緣種屬藥用植物材料的鑒定中得到應(yīng)用。李思巧等[17]利用開(kāi)發(fā)的cpSSR標(biāo)記將花椒、竹葉花椒和日本花椒進(jìn)行了準(zhǔn)確的區(qū)分。董博然等[18]以葉綠體基因組序列為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)出的分子標(biāo)記可以對(duì)長(zhǎng)梗秦艽和全萼秦艽進(jìn)行鑒定。借鑒其他藥用植物鑒定的方法，本研究從植物學(xué)形態(tài)和分子水平對(duì)黃芩、粘毛黃芩和并頭黃芩進(jìn)行系統(tǒng)分析和鑒定，以期為開(kāi)發(fā)和利用上述3種山西省野生黃芩資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、粘毛黃芩S.viscidulaBunge.)、并頭黃芩(S.scordifoliaFisch.ex Schrank)均為山西省左云縣內(nèi)采集的野生資源。左云縣屬于溫帶半干旱大陸性季風(fēng)氣候，春季干旱多風(fēng)，夏季較熱多雨，秋季潮濕溫?zé)幔竞渖傺19]。境內(nèi)四面多山，中部為丘陵，平川少，山地和丘陵多。采樣時(shí)分別從縣域內(nèi)北(張家場(chǎng)鄉(xiāng)東紅崖村，地理坐標(biāo)N 40°03′35.35″，E 112°38′47.36″，海拔1 413.0 m)、西南(小京莊鄉(xiāng)西碾頭村，地理坐標(biāo)N 39°53′55.75″，E 112°40′19.02″，海拔1 483.0 m)、東南(水窯鄉(xiāng)五豐咀村，地理坐標(biāo)N 39°55′26.39″，E 112°49′56.09″，海拔1 687.0 m)3個(gè)位置進(jìn)行采樣，3種黃芩每個(gè)居群采5株，共采集45株樣品。3個(gè)采集地植株的采集日期分別為2020-07-11、2020-07-08、2020-07-10，種子收集時(shí)間為2020-08-20、2020-08-19、2020-08-21。

1.2 方 法

1.2.1 植株形態(tài)學(xué)鑒定 比對(duì)中國(guó)科學(xué)院1977版的《中國(guó)植物志》對(duì)3種材料進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[1]。

1.2.2 種子形態(tài)鑒定 利用手持?jǐn)?shù)碼電子顯微鏡(國(guó)產(chǎn)光學(xué)優(yōu)品，型號(hào)UM039)對(duì)3種黃芩種子的種皮表面特征分別進(jìn)行觀察。

1.2.3 葉綠體序列分析及引物開(kāi)發(fā) 從NCBI下載黃芩和并頭黃芩葉綠體基因組序列，利用MISA軟件分別對(duì)序列進(jìn)行分析，SSR位點(diǎn)搜索的標(biāo)準(zhǔn)為核苷酸1～6 bp，重復(fù)次數(shù)不少于10次、6次和5次，復(fù)合SSR<100 bp。

Primer 5.0軟件以重復(fù)位點(diǎn)上、下游300 bp的序列為模板序列進(jìn)行引物開(kāi)發(fā)。引物的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為：GC含量在30%～70%，產(chǎn)物大小為100～300 bp，Tm值為55 ℃～65 ℃，上下游引物Tm值差異不超過(guò)5 ℃，引物長(zhǎng)度為15～25 bp，引物GC含量30%～70%。

1.2.4 分子鑒定 參考Dellaporta等[20]的方法，采用改良SDS法提取3種黃芩葉、根條的DNA。PCR反應(yīng)體系為15 μL，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 4 min，變性94 ℃ 1 min、復(fù)性55 ℃ 45 s、延伸72 ℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)，延伸72 ℃ 10 min。利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株表型調(diào)查

植株采挖當(dāng)天對(duì)株高、莖、花、葉和根的形態(tài)特征(圖1～圖2)等信息進(jìn)行調(diào)查，待臘葉標(biāo)本制作完成后對(duì)部分信息進(jìn)行補(bǔ)充。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)3種黃芩主要特征比較接近，最明顯的區(qū)分點(diǎn)為花色、根形態(tài)和顏色等特征(表1)。其中，株高方面黃芩最高，并頭黃芩次之，粘毛黃芩最低。黃芩和粘毛黃芩花序頂生，并頭黃芩花序單生，黃芩和并頭黃芩花冠呈藍(lán)色或藍(lán)紫色，粘毛黃芩花冠為黃白色。根莖方面，黃芩和粘毛黃芩的根粗壯，外皮深棕色，而并頭黃芩根莖纖細(xì)，外皮為白色。

表1 3種黃芩屬植物形態(tài)

圖1 植株表型

圖2 花的表型

2.2 種子表型鑒定

肉眼觀察發(fā)現(xiàn)3種黃芩的種子不易區(qū)分，黃芩和粘毛黃芩種子直徑大小接近，黃芩種子為黑褐色，粘毛黃芩種子發(fā)白。并頭黃芩直徑最小，顏色接近綠棕色(圖3)。利用手持?jǐn)?shù)碼電子顯微鏡則很容易區(qū)分3種黃芩的種子，黃芩和粘毛黃芩種子均呈卵球形，粘毛黃芩種子表面有明顯的白色膜狀物，并頭黃芩種子表面則密布明顯的瘤狀突起(圖4)。

圖3 肉眼觀察的種子形態(tài)

圖4 顯微鏡下的種子形態(tài)

2.3 分子鑒定

2.3.1 黃芩和并頭黃芩cpSSR重復(fù)基元分析 MISA軟件搜索黃芩和并頭黃芩葉綠體基因組的SSR位點(diǎn)，獲得55個(gè)cpSSR位點(diǎn)(表2)。其中，黃芩葉綠體基因組中，單核苷酸重復(fù)基元A/T和C/G的cpSSR位點(diǎn)28個(gè)(占總位點(diǎn)數(shù)的 93.33%)，二核苷酸重復(fù)基元(AT/TA)的cpSSR位點(diǎn)有2個(gè)(占總位點(diǎn)數(shù)的6.67%)。并頭黃芩葉綠體基因組中，單核苷酸重復(fù)基元A/T和C/G的cpSSR位點(diǎn)23個(gè)(占總位點(diǎn)數(shù)的92.00%)，二核苷酸重復(fù)基元(AT/AT)2個(gè)(占總位點(diǎn)數(shù)的8.00%)。

表2 不同SSR重復(fù)基序

2.3.2 引物的篩選及驗(yàn)證 引物信息見(jiàn)表3。以黃芩和并頭黃芩葉綠體基因組中重復(fù)序列為基礎(chǔ)，分別設(shè)計(jì)出78對(duì)黃芩cpSSR引物和69對(duì)并頭黃芩cpSSR引物。隨機(jī)選取黃芩和并頭黃芩各10對(duì)引物對(duì)3種黃芩進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)有5對(duì)引物能擴(kuò)增出特異性條帶。來(lái)源于并頭黃芩的1對(duì)引物BTHQY1能對(duì)3種材料進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，其中，BTHQY1在黃芩樣品中擴(kuò)增出約240 bp和500 bp大小的條帶，在粘毛黃芩樣品中擴(kuò)增出約350 bp和750 bp大小的片帶，在并頭黃芩中擴(kuò)增出約300 bp和800 bp大小的片段。其他4對(duì)引物只能對(duì)1種黃芩進(jìn)行鑒定，BTHQY5和HQY7分別在粘毛黃芩中擴(kuò)增出約200 bp和370 bp特異的條帶，可將粘毛黃芩單獨(dú)進(jìn)行區(qū)分。來(lái)源于黃芩的引物HQY5和HQY8能在并頭黃芩中擴(kuò)增出約360 bp和230 bp的條帶，從而可對(duì)并頭黃芩進(jìn)行鑒定(圖5)。

表3 引物信息

M.Marker; 1.黃芩; 2.粘毛黃芩; 3.并頭黃芩

3 討 論

黃芩、粘毛黃芩和并頭黃芩是山西省北部分布數(shù)量較多的3種黃芩屬野生資源。研究表明，黃芩根條中含有黃芩苷和黃芩素等黃酮類成分，而黃芩地上部分中野黃芩苷、芹菜素、白楊素等成分含量相對(duì)較高[21-22]。粘毛黃芩根條中主要含有黃芩素、漢黃芩素、白楊素等多個(gè)黃酮類化學(xué)成分，粘毛黃芩和并頭黃芩全草中含有白楊素等黃酮類成分[23-25]。上述3種黃芩屬植物不僅具有相同或相似的化學(xué)成分，且在植株、種子和根條形態(tài)上相似度也較高，為充分利用山西省野生黃芩屬資源，本研究對(duì)3種黃芩的植株表型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其花色、根形態(tài)和顏色具有一定的區(qū)分度。但三者種子顏色和形態(tài)比較接近，肉眼很難進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。趙麗麗等[10]利用掃描電鏡對(duì)黃芩和粘毛黃芩進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)二者種皮表面超微結(jié)構(gòu)差異明顯，但是掃描電鏡不適用于大田直接觀察。而本研究利用手持?jǐn)?shù)碼電子顯微鏡明顯區(qū)分出3種材料種皮顏色不同，同時(shí)還可根據(jù)種皮表面是否有瘤狀突起對(duì)3種材料的種子進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定。

與核基因組相比葉綠體基因組具有基因數(shù)量少、編碼區(qū)范圍小、進(jìn)化速度慢、母系遺傳、有效變異位點(diǎn)多的優(yōu)點(diǎn)[26-27]。在葉綠體基因組基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出的cpSSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于三七、薏苡、花椒、丹參、菊科植物遺傳多樣性、資源鑒定、親緣關(guān)系的研究中[28-31]。本研究對(duì)黃芩和并頭黃芩葉綠體基因組序列的SSR位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)黃芩和并頭黃芩葉綠體重復(fù)基元具有堿基偏好性，均以A/T為主要重復(fù)單元，而黃芩二核苷酸重復(fù)基元為AT/TA基序，并頭黃芩則為AT/AT基序。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)黃芩和并頭黃芩的cpSSR引物，經(jīng)篩選有5對(duì)引物可對(duì)黃芩、粘毛黃芩和并頭黃芩進(jìn)行鑒定。同時(shí)，分子鑒定過(guò)程中分別提取3種材料的葉片和干燥根部的DNA，最終電泳結(jié)果一致，說(shuō)明本研究篩選出的特異性標(biāo)記，既可用于植物材料的鑒定，也可用于黃芩屬藥材的區(qū)分。

綜上所述，本研究通過(guò)花色、根形態(tài)、根顏色和種子等表型性狀可初步區(qū)分黃芩、粘毛黃芩和并頭黃芩。同時(shí)，在分析黃芩和并頭黃芩葉綠體基因組的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出5對(duì)可用的cpSSR標(biāo)記，從而將表型和分子技術(shù)相結(jié)合對(duì)3種山西省黃芩屬野生資源進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，結(jié)果對(duì)充分開(kāi)發(fā)和利用山西省省域內(nèi)黃芩屬資源具有重要的意義。