蒙藥制劑額日敦·烏日勒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

楊雪苗，陳 希，徐楠冰，鄔國(guó)棟，薄彧坤，楊 丹，安 明

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

額日敦·烏日勒為蒙藥復(fù)方制劑，別名珍寶丸，該處方由甘草、木香、梔子、訶子、川楝子、苘麻子、丁香、沉香等三十味名貴藥材組成，該制劑已獲得內(nèi)藥制字 M14020112 的批準(zhǔn)文號(hào)。額日敦·烏日勒具有清熱安神、舒筋活絡(luò)的功效。主要用于治療白脈病、半身不遂、風(fēng)濕、類風(fēng)濕、布病、肌筋萎縮、神經(jīng)麻痹、腎脈損傷、瘟疫熱病、久熱不愈等疾病。額日敦·烏日勒現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)》1984版，但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀和檢查項(xiàng)，不能保證該藥品的質(zhì)量，擬增加薄層鑒別項(xiàng)和含量測(cè)定項(xiàng)以保證該制劑的質(zhì)量。

該處方中甘草為君藥，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效[1-2]。臨床主要用于治療脾胃虛弱、中氣不足、咳嗽哮喘、緩和藥物烈性、解藥物毒性。木香屬于理氣藥，具有行氣止痛、健脾消食的功效。臨床上主要用于胸脅、脘腹脹滿、瀉痢后重、不思飲食。梔子為清熱瀉火藥，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效，其活性成分梔子苷[3]具有緩瀉、鎮(zhèn)痛、利膽、抗炎等作用。因此，額日敦·烏日勒發(fā)揮主要藥理作用與處方中甘草、木香、梔子間相互作用密切相關(guān)。

為進(jìn)一步控制該藥品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜(Thin Layer chromatography, TLC)法對(duì)處方中的甘草、梔子、木香進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC-UV)法對(duì)甘草中主要成分甘草苷、甘草酸[4]進(jìn)行含量測(cè)定，并通過(guò)方法學(xué)考察，為完善蒙藥制劑額日敦·烏日勒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器 Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)、BSA224S-CW 萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、SQP 型十萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、超純水儀 (美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)、AS10200 超聲波清洗機(jī)(40/60 Hz)(北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司)、TDZ5-WS 多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2試藥 樣品(批號(hào)2009091、2009092、2009093)：本制劑由包頭市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院提供。梔子苷對(duì)照品(110749-201919)、木香烴內(nèi)酯(111524-201710)、去氫木香烴內(nèi)酯(111525-201711)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。甘草苷對(duì)照品(AF21020853)、甘草酸銨對(duì)照品(批號(hào)AF21020859)、梔子對(duì)照藥材(AF20102601)、甘草對(duì)照藥材(AF20110113)均購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司。乙腈為色譜純，甲醇為色譜純和分析純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1薄層鑒別

1.3.1.1梔子薄層鑒別 取額日敦·烏日勒丸4.6 g，加入50 %甲醇10 mL，超聲處理40 min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。依照處方比例稱取缺梔子的陰性樣品，同供試品溶液制法相同，即得陰性樣品溶液。取梔子藥材1.0 g和梔子對(duì)照藥材1.0 g，同供試品溶液制法相同，即得梔子藥材和梔子對(duì)照藥材溶液。取一定量梔子苷對(duì)照品, 加乙醇制成每1 mL含有4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(通則 0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)、取出、晾干，再噴以10 %的硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.3.1.2木香薄層鑒別 取額日敦·烏日勒丸3.5 g，加甲醇15 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。依照處方比例稱取缺木香的陰性樣品，同供試品溶液制法相同，即得陰性樣品溶液。取木香對(duì)照藥材0.5 g，同供試品溶液制法相同，即得木香對(duì)照藥材溶液。分別取一定量去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品，加甲醇分別制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(通則 0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠 G 薄層板上，以環(huán)己烷 - 甲酸乙酯 - 甲酸(15∶ 15∶ 1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1 %香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.3.1.3甘草薄層鑒別 取額日敦·烏日勒丸6.9 g，加乙醚40 mL，加熱回流1小時(shí)，濾過(guò)，棄去醚液，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。依照處方比例稱取缺甘草的陰性樣品，同供試品溶液制法相同，即得陰性樣品溶液。取甘草藥材1 g、甘草對(duì)照藥材1 g，同法制成藥材溶液、對(duì)照藥材溶液。取甘草酸銨對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(通則 0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各1～2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶ 1∶ 1∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置熒光燈(256 nm)下檢視。

1.3.2含量測(cè)定

1.3.2.1色譜條件 選用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱：依利特SinoChrom ODS-BP色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1 %磷酸溶液為流動(dòng)相B，按照表1色譜條件進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.8 mL/min，柱溫為 25 ℃，進(jìn)樣體積為 10 μL ，在237 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。理論塔板數(shù)按甘草苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

表1 梯度洗脫條件

1.3.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘草苷對(duì)照品2 mg, 置10 mL容量瓶中，加70 %乙醇溶解并稀釋至刻度，再精密吸取1 mL至10 mL 容量瓶中，用70 %乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。稱取甘草酸銨對(duì)照品2 mg，置10 mL 容量瓶中，加70 %乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207)。

1.3.2.3供試品溶液的制備 稱取蒙藥額日敦·烏日勒丸適量，置于研缽研細(xì)，取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1.39 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70 %乙醇20 mL ，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻，再稱定重量，用70 % 乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2.4陰性溶液的制備 按照蒙藥額日敦·烏日勒處方比例稱取除甘草以外的其它藥材，充分研細(xì)混勻，參照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制成(缺甘草)的陰性對(duì)照溶液。

2 結(jié)果

2.1薄層鑒別

2.1.1梔子薄層鑒別 在薄層色譜中，供試品溶液與對(duì)照藥材溶液色譜、對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 蒙藥額日敦·烏日勒中梔子的TLC圖譜

2.1.2木香薄層鑒別 在薄層色譜中，供試品溶液與對(duì)照藥材溶液色譜、對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 蒙藥額日敦·烏日勒中木香的TLC圖譜

2.1.3甘草薄層鑒別 在薄層色譜中，供試品溶液與對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖3。

圖3 蒙藥額日敦·烏日勒中甘草的TLC圖譜

2.2含量測(cè)定

2.2.1提取效率考察 取額日敦·烏日勒丸適量，置于研缽研細(xì)，取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)1.39 g，精密稱定3份，超聲時(shí)間分別設(shè)置為20、30、40 min，按“2.2.3”項(xiàng)方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，根據(jù)色譜圖結(jié)果用外標(biāo)法計(jì)算出甘草苷、甘草酸的含量。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 各組分提取時(shí)間考察

2.2.2專屬性考察 精密吸取額日敦·烏日勒供試品、甘草苷對(duì)照品、甘草酸銨對(duì)照品、額日敦·烏日勒陰性對(duì)照溶液適量，按照“2.2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣檢測(cè)。甘草苷、甘草酸的色譜峰分離效果良好，并且陰性對(duì)照沒(méi)有干擾。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4～6。

圖4 蒙藥額日敦·烏日勒供試品溶液色譜圖

圖5 甘草苷對(duì)照品色譜圖(A)、甘草酸對(duì)照品色譜圖(B)

2.2.3線性關(guān)系的考察 取濃度為8.7 μg/mL甘草苷溶液0.435 mL，濃度為44.32 μg/mL甘草酸溶液2.216 mL，將上述溶液放置10 mL容量瓶，用70 %乙醇溶解，即得到儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液適量，加70 %甲醇稀釋制成系列濃度的對(duì)照品溶液，參照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。以色譜峰面積A為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)曲線。結(jié)果表明甘草苷在濃度為0.00348～0.01218 mg/mL的范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系。甘草酸在濃度0.017723～0.06205 mg/mL的范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組分線性回歸方程

2.2.4精密度試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)得甘草苷峰面積值RSD %為0.36 %，甘草酸峰面積值RSD %為0.55 %，表明儀器精密度良好。

2.2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(2009091)樣品，按“2.2.3”項(xiàng)方法平行配制供試品溶液6份， 按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，記錄色譜圖峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算甘草苷、甘草酸含量并計(jì)算 RSD 值，RSD<4.0 %，在規(guī)定范圍內(nèi)，表明該試驗(yàn)方法的重復(fù)性好。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 4和表 5。

表4 甘草苷重復(fù)性試驗(yàn)

表5 甘草酸重復(fù)性試驗(yàn)

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定樣品粉末1.4 g，以“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在0、4、8、12、24 h按照“2.2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定，且RSD<4.0 %,該方法可行。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7加樣回收試驗(yàn) 取同一批號(hào)(2009091)樣品，精密稱定 9 份，每份 0.69 g，分為3組，每組分別加入供試品含量的 50 %、100 %、150 %的對(duì)照品溶液，按“2.2.3” 項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄甘草苷、甘草酸的色譜峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算甘草苷、甘草酸含量、平均回收率，平均回收率在規(guī)定范圍內(nèi)(85 %～110 %)，且RSD<4.0 %。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7，表明該方法準(zhǔn)確度好。

2.2.8耐用性的考察 換不同廠家、不同型號(hào)色譜柱，取供試品約1.39 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，按外標(biāo)法計(jì)算甘草苷、甘草酸含量，RSD<4.0 %。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。

2.2.9樣品含量測(cè)定 取三個(gè)批號(hào)的樣品(2009091、2009092、2009093)及實(shí)驗(yàn)室自制模擬樣品一份，4個(gè)樣品各取 3 份，按照“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別精密量取各溶液 10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定, 記錄甘草苷、甘草酸的色譜峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中甘草苷、甘草酸的含量，并求RSD值，各項(xiàng)下RSD<4.0 %。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。

表7 各組分加樣回收實(shí)驗(yàn)

表8 耐用性考察

表9 含量測(cè)定

3 討論

3.1薄層板的選擇 在甘草TLC鑒別中，分別考察了硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板、硅膠H薄層板對(duì)甘草酸的分離能力，結(jié)果表明硅膠GF254板中甘草酸斑點(diǎn)顯示清晰，分離度良好，陰性溶液無(wú)干擾。因此在甘草TLC中選擇硅膠GF254薄層板對(duì)甘草酸進(jìn)行定性鑒別。

3.2流動(dòng)相的選取 流動(dòng)相的選擇參照《中國(guó)藥典》2020年版一部卷柏中甘草苷、甘草酸含量測(cè)定，結(jié)合文獻(xiàn)，以乙腈- 0.05 %磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫(0～8 min,19 %乙腈；8～35 min, 19 %～50 %乙腈；35～36 min, 50 %～100 % 乙腈；36～40 min，100 %～19 %乙腈)，在此條件下甘草苷、甘草酸分離效果不理想。鑒于以上，本研究增加磷酸水溶液的濃度并改變流動(dòng)相的梯度，以乙腈-0.1 %磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫(0～6 min, 19 %乙腈；6～12 min，19 %～25 %乙腈；12～16 min，25 %～27 %乙腈；16～20 min，27 %～36 %乙腈；20～33 min，36 %～47 % 乙腈；33～36 min，47 %～19 %乙腈)，結(jié)果表明在此條件下蒙藥制劑額日敦·烏日勒中甘草的主要成分甘草苷、甘草酸保持良好的峰形，各峰分離度良好，該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，因此，最終使用乙腈- 0.1 % 磷酸水溶液作為本研究的流動(dòng)相[5]。

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取“2.2.3”項(xiàng)下的溶液，在200～500 nm下通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器做全波長(zhǎng)掃描，甘草苷、甘草酸分別在198 nm、256 nm處有最大吸收。查閱文獻(xiàn)并參考《中國(guó)藥典》2020版卷柏中甘草苷、甘草酸的含量測(cè)定，在237 nm下考察甘草苷、甘草酸的吸收情況，結(jié)果顯示各峰均有吸收并保持良好的峰型，故最終選擇 237 nm 作為本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4流速的選擇 參照2020 年版《中國(guó)藥典》，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，考察了不同流速對(duì)甘草苷、甘草酸的分離效果。本研究分別考察了流速為0.6、0.8、1.0 mL/min時(shí)各峰的出峰情況，結(jié)果表明甘草苷、甘草酸在流速為0.8 mL/min時(shí)，基線穩(wěn)定，各峰峰形、分離度良好，因此選擇流速為0.8 mL/min時(shí)對(duì)甘草苷、甘草酸進(jìn)行定量分析。

綜上所述，本研究建立了蒙藥制劑額日敦·烏日勒中甘草、梔子、木香TLC定性鑒別的方法，該方法重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)。采用HPLC法建立了蒙藥制劑額日敦·烏日勒中甘草的主要藥效成分甘草苷、甘草酸含量測(cè)定方法，該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好。因此，本研究成功地將蒙藥制劑額日敦·烏日勒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行完善，該方法可用于蒙藥制劑敦·烏日勒的質(zhì)量控制[6]。