沙棘黃酮對大鼠肝臟CYP450酶mRNA表達的影響*

鄔國棟，任燕霞，張 東

(1.包頭醫(yī)學院藥學院，內蒙古 包頭 014060；2.包頭醫(yī)學院基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院)

沙棘(Hippophae rhamnoides L.) 為胡頹子科酸刺屬的落葉灌木或小喬木，又名沙棗、酸柳果、酸柳、其察日嘎察(蒙名)、達普(藏名)、吉漢(維吾爾名)，主要分布在我國的華北、西北、東北及西南地區(qū)[1-2]。沙棘具有相當高的藥用價值，是古代藏藥和蒙藥常用藥材?！吨袊幍洹?2020版1部)記載，沙棘具有健脾消食，止咳祛痰，活血化瘀的作用[3]。藥理學研究表明，沙棘具有保護肝臟、抗高血壓、抗癌、抗?jié)?、促進傷口愈合、抗菌、抗氧化、保護心臟和免疫調節(jié)等作用[4-7]。 沙棘中的主要活性成分是黃酮類，其主要成分有異鼠李素、山奈酚和槲皮素等[8]。

肝臟是代謝藥物的主要器官，而肝臟代謝藥物的主要酶是細胞色素P450酶系(CYP450)，它有很多同工酶，如CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP2B6等。近年來，CYP450在植物藥代謝方面逐漸受到人們的關注。CYP450同工酶的活性容易受到外來物質的誘導或抑制，進而會影響其他藥物的代謝而發(fā)生藥物之間的相互作用[9]。這種相互作用的結果之一就是導致不良反應的發(fā)生甚至毒性反應的產生。所以研究植物藥對CYP450酶活性的影響很有必要。人體內CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP2B6和大鼠體內的CYP2c11、CYP2e1、CYP2d2和CYP2b1分別具有高度同源性[10]。本課題采用實時熒光定量PCR方法研究沙棘黃酮對大鼠肝臟CYP2c11、CYP2e1、CYP2d2和CYP2b1酶 mRNA表達的影響，進而判斷沙棘黃酮對人體CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP2B6酶的活性是否具有抑制或誘導作用，為沙棘以及沙棘黃酮的臨床合理聯(lián)合應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器、藥品和試劑 Nano Drop 2000分光光度計、5020PCR儀、Pacific T-Ⅱ型超純水儀、Micro 2/R 高速低溫離心機(美國 ThermoFisher Scientific 公司)；BT125D 十萬分之一電子天平( 賽多利斯科學儀器北京有限公司)。

沙棘總黃酮(大連美侖生物技術有限公司研制，批號：20181104)。總RNA極速抽提試劑盒kit-RNAfast200(上海飛捷生物技術有限公司，批號：220011)；第一鏈cDNA Synthesis Kit試劑盒以及2X Realtime PCR Master Mix(第二代)試劑盒(南京博爾迪生物科技有限公司，批號：20191103)；DEPC(Sigma公司，批號：p0031)；引物(南京金瑞斯生物科技有限公司)。

1.2實驗動物 Wistar雄性大鼠(體質量200～220 g)，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2016-0002。動物飼養(yǎng)于明暗交替(12 h∶12 h)的清潔級動物飼養(yǎng)室中，環(huán)境溫度24～26 ℃，相對濕度50 %，自由進食飲水。動物實驗遵循包頭醫(yī)學院動物倫理委員會規(guī)定。

1.3給藥方案 40只雄性大鼠按照隨機化原則分為空白對照組，陽性對照組，沙棘黃酮高劑量組、中劑量組和低劑量組。各給藥組分別灌胃400、200和100 mg/kg的沙棘黃酮提取物，空白對照組灌胃等容量蒸餾水，連續(xù)14 d；陽性對照組從第8天開始腹腔注射苯巴比妥鈉50 mg/kg，連續(xù)7 d。末次給藥后禁食不禁水12 h，脫臼處死大鼠，腹主動脈取血檢測大鼠血清生化指標，取肝臟置于無RNA酶的凍存管中，液氮速凍后于-70 ℃冰箱凍存。

1.4肝功能指標的測定 大鼠腹主動脈取血5 mL，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，按照試劑盒說明書測定谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、總蛋白(Total protein, TP)、球蛋白(Globulin, GLB)、白蛋白(Albumin, ALB)和直接膽紅素(Direct bilirubin, DBIL)各項指標。取肝臟稱重，計算肝重/體重比(Liver weight/body weight,L/W)。

1.5肝臟 CYP450 mRNA 表達水平的測定 總RNA提取 取冷凍肝組織約50 mg加生理鹽水勻漿，然后按照kit-RNAfast200極速抽提試劑盒說明提取總RNA。各總RNA樣本 A260/A280比值為 1.8～2.0。

cDNA 合成 取適量總RNA(使其終濃度為500 ng·μL-1)，分別加入 1μL random hexamer primer、4μL 5×RT Buffer、1μL RT Enzyme Mix、1μL dNTPs和RNase free dd H2O至終體積 20 μL。逆轉錄條件為：25 ℃(10 min)，50 ℃(45 min)，85 ℃(5 min)。得到的cDNA產物用于 PCR 反應或于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RT-PCR 測定mRNA表達水平 取1 μL cDNA產物，分別加入12.5 μL 2X Realtime PCR Master Mix、10uM的上下游引物各0.5 μL，加Nuclease-Free Water to至25 μL。PCR反應條件為：95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1min，45個循環(huán)。測定樣本CT值后，采用 2-ΔΔCT法計算各組CYP450 酶基因表達相對于空白對照組的倍數(shù)變化。大鼠 CYP2c11、CYP2e1、CYP2d2、CYP2b1和β-actin(內參)引物序列見表1。

表1 實時熒光定量引物序列

2 結果

2.1沙棘黃酮對大鼠肝功能的影響 與空白對照組相比，沙棘黃酮各給藥組對ALT、AST、TP、GLB、ALB和L/W沒有影響(P>0.05)，但是中劑量組和低劑量組可以顯著降低DBIL(P<0.05)。提示沙棘黃酮對大鼠肝功能沒有影響，不會造成肝損傷，DBIL的降低沒有太大意義。見表2。

表2 大鼠肝功能各項指標

2.2沙棘黃酮對CYP450各同工酶mRNA表達的影響 與空白對照組相比，高劑量組CYP2d2 mRNA表達上調了3.2倍(P<0.01)，而CYP2c11、CYP2e1和CYP2b1 mRNA表達沒有顯著性變化(P>0.05)(圖1)。

圖1 沙棘黃酮對大鼠肝臟CYP450酶mRNA表達的影響

3 討論

3.1沙棘黃酮對大鼠肝臟CYP2b1、CYP2c11和CYP2e1 mRNA表達的影響 CYP2B6、CYP2C9和CYP2E1是人體肝臟中非常重要的代謝藥物的CYP450酶系同工酶。CYP2B6占人體肝臟中CYP450含量的2 %～10 %，并且可能參與了市場上近25 %的藥物的代謝，例如麻醉藥，抗癌藥，抗逆轉錄病毒依非韋倫和某些促癌物等[11-13]。CYP2C9可能參與了16%的臨床藥物的代謝，如非甾體抗炎藥，AT1受體阻滯劑，抗驚厥藥等[14-16]。CYP2E1在酒精、有機溶劑、毒素、致癌物和致癌物代謝中起重要作用[17-18]。本實驗結果表明，沙棘黃酮對大鼠肝臟CYP2b1、CYP2c11和CYP2e1 mRNA表達沒有影響，說明沙棘黃酮對CYP2B6、CYP2C9和CYP2E1的活性沒有影響。即沙棘黃酮可以安全地與通過CYP2E1、CYP2B6和CYP2C9代謝的藥物聯(lián)合使用，它們之間不會發(fā)生草藥-藥物之間的相互作用。

3.2沙棘黃酮對大鼠肝臟CYP2d2 mRNA表達的影響 CYP2D6也是肝臟中非常重要的CYP450同工酶之一。CYP2D6可以代謝約20 %的目前已知的臨床治療藥物[19]，如β受體阻滯劑(丁呋洛爾、卡維地洛、甲氧普羅爾)、抗抑郁藥(阿米替林、帕羅西汀、地昔帕明、氟伏沙明、文拉法辛)抗心律不齊藥物(普羅帕酮、美西律、氟利卡胺)、抗精神病藥(阿立哌唑、利培酮)、抗癌藥(他莫昔芬、吉非替尼、司巴汀)和阿片類鎮(zhèn)痛藥(可待因、曲馬多、曲馬多)等[20-21]。本實驗結果表明，TFH可以上調CYP2d2 mRNA的表達，也就是說，TFH可以誘導CYP2D6的活性，提示沙棘黃酮與CYP2D6的底物之間存在代謝層面的相互作用。當沙棘黃酮與經CYP2D6代謝的藥物一起使用時，這些藥物的代謝可能會加快，導致藥理效應下降，所以在聯(lián)合用藥時需要調整這些藥物的給藥方案。如果這些藥物的代謝產物是有毒的，則聯(lián)合使用也會引起嚴重的不良反應。

3.3沙棘黃酮對大鼠肝功能的影響 從表2結果可知，沙棘黃酮對大鼠肝臟的ALT、AST、TP、ALB、GLB和L/W沒有影響，但可以降低DBIL的水平，說明沙棘黃酮對大鼠肝功能沒有影響，不會引起肝損傷。至于 DBIL降低沒有意義。

綜上所述，沙棘黃酮可以上調大鼠CYP2d2 mRNA的表達，而對CYP2b1、CYP2e1和CYP2c11 mRNA的表達沒有影響，這提示沙棘黃酮可能會誘導人CYP2D6酶的活性。當沙棘或沙棘黃酮與經CYP2D6代謝的藥物合用時，可能發(fā)生草藥-藥物相互作用。因此，在臨床實踐中應給予足夠的重視。