皮下與關(guān)節(jié)腔注射A型肉毒毒素對骨關(guān)節(jié)炎大鼠鎮(zhèn)痛效果比較

萬慧偉,李鑫河,王琳,楊慧,李鐵山

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)二科,山東 青島 266003)

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，疼痛是其最突出的臨床表現(xiàn)，也是導(dǎo)致求醫(yī)的主要原因[1]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎的疼痛存在神經(jīng)病理性痛的成分[2-3]。因此，治療上必須考慮對其神經(jīng)病理性痛的成分進(jìn)行治療[4-5]。已經(jīng)有臨床研究發(fā)現(xiàn)，A型肉毒毒素(BoNT/A)注射可以顯著減輕神經(jīng)病理性疼痛癥狀[6-7]。而關(guān)于其鎮(zhèn)痛機制，目前大多數(shù)研究者認(rèn)為BoNT/A通過逆向軸漿運輸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[8-9]。根據(jù)BoNT/A的逆向軸漿運輸特性，本文研究探討皮下注射BoNT/A對骨關(guān)節(jié)炎的治療效果，并通過比較后爪皮下注射和關(guān)節(jié)腔注射BoNT/A的療效差異，為臨床治療尋找最佳的治療方法。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SPF級成年雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量180～220 g，由青島大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠于12 h光照/12 h黑暗、室溫23 ℃條件下分籠飼養(yǎng)，不限制水和飼料的供應(yīng)。所有動物實驗操作都遵照青島大學(xué)動物保護(hù)和使用委員會的要求，并最大程度減少實驗動物的痛苦及其使用數(shù)量。A型肉毒毒素(BoNT/A，美國Allergan公司產(chǎn)品)；單碘乙酸鈉(MIA，美國Sigma公司)；Von-Frey Hair(美國North Coast公司)；通道式鼠足支撐力測量儀(濟南益延科技有限公司)；兔抗大鼠P2X4嘌呤受體(P2X4R)抗體(美國Bioss公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型制備 將大鼠隨機分為Sham組(12只)和造模組(63只)，造模組大鼠應(yīng)用50 g/L異氟烷麻醉后，消毒大鼠踝關(guān)節(jié)周圍的皮膚，固定大鼠左側(cè)下肢，使用50 μL微量注射器將4 mg(50 μL)的MIA沿脛骨-跗骨間隙注射到大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)腔中；Sham組大鼠給予相同體積的生理鹽水關(guān)節(jié)腔注射。于造模后21 d對兩組大鼠進(jìn)行50%縮足反應(yīng)閾值(PWT)及雙下肢負(fù)重(WB)測試，造模組大鼠PWT及WB明顯降低者提示造模成功，將造模成功的大鼠納入后續(xù)實驗。

1.2.2實驗分組及處理 將造模成功的大鼠隨機分為4組，每組15只。后爪皮下注射對照組(A組)：于大鼠左側(cè)后爪皮下注射20 μL生理鹽水；后爪皮下注射給藥組(B組)：于大鼠左側(cè)后爪皮下注射BoNT/A 5 U(20 μL)；關(guān)節(jié)腔注射對照組(C組)：于大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)腔注射20 μL生理鹽水；關(guān)節(jié)腔注射給藥組(D組)：于大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)腔注射BoNT/A 5 U(20 μL)。

1.2.3疼痛行為學(xué)測試 分別于造模前3 d、造模后21 d隨機抽取Sham組和造模組各6只大鼠進(jìn)行PWT及WB測試；給藥后1、7、14、21 d隨機抽取A組、B組、C組、D組各6只大鼠進(jìn)行PWT及WB測試。①PWT測定：將大鼠放入鐵絲網(wǎng)為底的特制有機玻璃籠子中,等待20 min使大鼠適應(yīng)周圍環(huán)境,采用up and down法將一系列Von-Frey細(xì)絲從2.0 g力度開始刺激大鼠左側(cè)后爪掌中部皮膚,輕微施力使軟絲彎曲,保持4～6 s,觀察大鼠的縮足反應(yīng)，陽性反應(yīng)表現(xiàn)為后足撤回。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)方法計算PWT[10]。②WB測定：將大鼠放入透明通道中,驅(qū)趕大鼠使其爬上稱量架，當(dāng)大鼠兩側(cè)后爪分別放置于兩側(cè)稱量架上、并出現(xiàn)向斜面探究的動作或屈蹲在稱量架上時(以相對穩(wěn)定為準(zhǔn))，測量大鼠左右下肢的支撐力，連續(xù)測量5次，記錄數(shù)值并取平均值。結(jié)果以雙足靜態(tài)支撐的比值來表示[11]。

1.2.4P2X4R蛋白表達(dá)檢測 Sham組和造模組于造模后21 d隨機抽取3只大鼠，A組、B組、C組、D組分別于給藥后7、14、21 d隨機各取3只大鼠，麻醉后脫頸處死，迅速剪下腰段脊柱，取出L2～L6段脊髓。提取蛋白后，使用BCA試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行測定，配合5×上樣緩沖液及PBS將所有樣本稀釋至同一濃度，加熱變性后保存。將等量的各組蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作后，將PVDF膜置于兔抗大鼠P2X4R抗體稀釋液(1∶1 000)中，4 ℃過夜。漂洗后于FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG稀釋液(1∶1 000, Abcam)中室溫下低速搖床孵育120 min，將孵育完成的PVDF膜漂洗后放入顯影儀中，加入ECL化學(xué)發(fā)光顯影液進(jìn)行顯影，使用Image J軟件對圖像進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠PWT比較

造模前3 d，造模組與Sham組大鼠PWT比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在造模后21 d，Sham組與造模組大鼠的PWT分別為(15.00±0.00)、(0.62±0.38)g，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=92.31，P<0.05)。給藥后大鼠的PWT隨給藥時間逐漸變化(F=23.98，P<0.05)。組內(nèi)比較，后爪皮下注射給藥組及關(guān)節(jié)腔注射給藥組PWT各時間點變化明顯(F=8.69、26.76，P<0.01)，兩組大鼠PWT在給藥后持續(xù)上升，21 d時到達(dá)峰值，并有繼續(xù)上升的趨勢。各組大鼠PWT差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.40，P<0.05), 后爪皮下注射給藥組的PWT較后爪皮下注射對照組明顯改善，關(guān)節(jié)腔注射給藥組大鼠的PWT較關(guān)節(jié)腔注射對照組明顯改善,關(guān)節(jié)腔注射給藥組與后爪皮下注射給藥組PWT差異無顯著性(P>0.05)。給藥后不同時間比較，后爪皮下注射給藥組PWT在給藥后21 d較后爪皮下注射對照組改善明顯，關(guān)節(jié)腔注射給藥組PWT在給藥后21 d較關(guān)節(jié)腔注射對照組改善明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.42、42.06，P<0.01)；其他時間點各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥時間及分組之間存在交互效應(yīng)(F=4.04，P<0.01)。見表1。

表1 給藥后不同時間各組PWT比較

2.2 各組大鼠WB比較

在造模前3 d，Sham組與造模組大鼠的WB比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后21 d，Sham組與造模組大鼠的WB分別為1.00±0.16、0.46±0.15，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.98，P<0.05)。給藥后大鼠的WB隨給藥時間逐漸變化(F=25.05，P<0.05)。組內(nèi)比較，后爪皮下注射給藥組及關(guān)節(jié)腔注射給藥組各時間點WB變化明顯(F=25.05、12.27，P<0.01)，兩組的WB在給藥后持續(xù)上升，21 d時到達(dá)峰值，并有繼續(xù)上升趨勢。各組間WB比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.96，P<0.05),后爪皮下注射給藥組的WB較后爪皮下注射對照組明顯改善，關(guān)節(jié)腔注射給藥組大鼠的WB較關(guān)節(jié)腔注射對照組明顯改善,關(guān)節(jié)腔注射給藥組與后爪皮下注射給藥組WB差異無顯著性。給藥后不同時間比較，后爪皮下注射給藥組WB在給藥后14、21 d較后爪皮下注射對照組改善明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.23、38.96，P<0.01)；關(guān)節(jié)腔注射給藥組WB在給藥后7、14、21 d較關(guān)節(jié)腔注射對照組改善明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.04～38.96，P<0.01)；其他時間點各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。后爪皮下注射給藥組與關(guān)節(jié)腔注射給藥組給藥后各時間點WB差異均無顯著性(P>0.05)。給藥時間及分組之間存在交互效應(yīng)(F=8.01，P<0.01)。見表2。

表2 給藥后不同時間各組WB比較

2.3 各組大鼠脊髓P2X4R蛋白表達(dá)比較

造模后21 d，Sham組、造模組大鼠脊髓背角內(nèi)P2X4R蛋白表達(dá)量分別為0.87±0.06、0.97±0.05，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.08，P<0.05)。給藥后7、14、21 d，后爪皮下給藥組大鼠脊髓背角內(nèi)P2X4R蛋白表達(dá)較后爪皮下注射對照組減少，關(guān)節(jié)腔注射給藥組較關(guān)節(jié)腔注射對照組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.44～317.32，P<0.05)。見表3。

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，疼痛為其主要的臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，并給社會帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。相關(guān)研究結(jié)果已表明，關(guān)節(jié)腔注射BoNT/A可以用于治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛[12]。由于BoNT/A可以通過逆向軸漿運輸發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，因此在運輸路徑上的不同部位注射BoNT/A有潛在的治療作用。但目前缺乏關(guān)節(jié)外注射BoNT/A對骨關(guān)節(jié)炎鎮(zhèn)痛作用的研究，以及不同部位注射效果的比較研究[13]。

表3 給藥后不同時間點各組大鼠P2X4R蛋白表達(dá)比較

本研究通過對大鼠疼痛相關(guān)行為學(xué)檢測顯示，在給藥后14 d，后爪皮下給藥能明顯改善大鼠的WB，而對大鼠的PWT無明顯改善；在給藥后7 d，關(guān)節(jié)腔注射給藥能明顯改善大鼠WB，而對大鼠的PWT無明顯改善；在給藥后21 d，后爪皮下給藥與關(guān)節(jié)腔注射給藥均能明顯改善大鼠的PWT。各時間點后爪皮下給藥組大鼠PWT及WB與關(guān)節(jié)腔注射給藥組無明顯差異。表明后爪皮下及關(guān)節(jié)腔注射BoNT/A均具有鎮(zhèn)痛作用，但關(guān)節(jié)腔注射給藥組大鼠的WB較后爪皮下注射給藥組更早得到改善，而在各時間點兩種治療方法的鎮(zhèn)痛效果沒有差別。

BoNT/A是由肉毒桿菌分泌的一種神經(jīng)毒素，關(guān)于其鎮(zhèn)痛機制，有研究認(rèn)為BoNT/A可以抑制外周疼痛相關(guān)遞質(zhì)的釋放，從而減輕疼痛癥狀[14-16]，也有研究表明，BoNT/A可以通過逆向軸漿運輸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，減少疼痛信號的傳遞[17]，這兩種機制可能同時存在于BoNT/A的鎮(zhèn)痛過程中。相關(guān)研究結(jié)果表明，大鼠后爪皮膚、膝關(guān)節(jié)腔以及踝關(guān)節(jié)腔的感覺神經(jīng)均來源于L3、L4脊髓對應(yīng)的背根神經(jīng)節(jié)[9]。因此，在大鼠的后爪皮下注射BoNT/A，可以通過逆向軸漿運輸作用，到達(dá)支配關(guān)節(jié)腔感覺的脊髓節(jié)段，從而發(fā)揮與關(guān)節(jié)腔注射BoNT/A類似的鎮(zhèn)痛效果。本文研究結(jié)果顯示，后爪皮下注射與關(guān)節(jié)腔注射均在給藥后期(21 d)出現(xiàn)PWT的改善，這可能是由于PWT是對痛覺超敏進(jìn)行評估的指標(biāo)，而痛覺超敏的改善與BoNT/A的中樞調(diào)節(jié)作用有關(guān)，盡管后爪皮下注射與關(guān)節(jié)腔注射BoNT/A均可發(fā)揮中樞鎮(zhèn)痛作用，但這個過程需要的時間較長。關(guān)節(jié)腔注射給藥組大鼠較后爪皮下注射給藥組更早出現(xiàn)WB的改善，究其原因：一方面可能是由于關(guān)節(jié)腔注射BoNT/A不僅可以發(fā)揮中樞鎮(zhèn)痛作用，還可以抑制關(guān)節(jié)腔內(nèi)疼痛相關(guān)遞質(zhì)的釋放，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔注射給藥能更早地發(fā)揮作用[18]；另一方面，兩種途徑注射后組織對藥物的吸收效率及運輸距離不同導(dǎo)致其作用時間存在差異。但其具體作用機制仍需進(jìn)一步探討。

本研究結(jié)果顯示，MIA注射后大鼠的PWT和WB明顯下降，并且L2～L6脊髓中P2X4R的表達(dá)明顯上升，這與前人的研究結(jié)果一致[19]。MIA是一種不可逆的還原型輔酶Ⅱ抑制劑，關(guān)節(jié)腔注射后可以抑制軟骨細(xì)胞的代謝，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨缺失,軟骨下骨損傷，模擬骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程，產(chǎn)生疼痛癥狀[20-21]。P2X4R是一種與神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)的嘌呤受體，主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞中，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)遭受傷害性刺激時，小膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致P2X4R的分子結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，增強了感覺信息的傳遞，從而產(chǎn)生疼痛[22-23]。MIA骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠具有明顯的神經(jīng)損傷，這是導(dǎo)致其L2～L6節(jié)段脊髓中P2X4R蛋白表達(dá)升高的主要原因。而在后爪皮下及關(guān)節(jié)腔注射BoNT/A后，大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中P2X4R蛋白表達(dá)下降，提示BoNT/A可能通過抑制P2X4R的表達(dá)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。我們之前的研究也顯示，BoNT/A輕鏈C末端和P2X4R具有很高的親和力，提示BoNT/A與P2X4R可能存在結(jié)合位點，通過影響P2X4R-P38MAPK信號通路，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[24-25]。

綜上所述，后爪皮下及關(guān)節(jié)腔注射BoNT/A均能緩解MIA誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎大鼠的疼痛相關(guān)行為，關(guān)節(jié)腔注射給藥可以更早發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，但兩組各時間點的鎮(zhèn)痛效果相似；后爪皮下與關(guān)節(jié)腔注射給藥均能對大鼠脊髓中的P2X4R蛋白表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，表明兩種治療方式均發(fā)揮了中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用。此外，兩種治療方式均未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。本文結(jié)果可為臨床治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛提供參考。