miR-122-5p對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其機(jī)制

郭占非,吳潔,楊學(xué)華,許振丹,范文強(qiáng),高曉

(1 新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第四臨床學(xué)院)風(fēng)濕免疫科,河南 新鄉(xiāng) 453000； 2 新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種影響多個關(guān)節(jié)的全身自身免疫性疾病，其可導(dǎo)致關(guān)節(jié)中滑膜細(xì)胞的增殖，而血管翳的形成可能導(dǎo)致潛在的軟骨破壞和骨侵蝕，以及促炎細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生，加快破壞進(jìn)程的發(fā)展[1-2]。RA的發(fā)病原因與其他自身免疫性疾病一樣，病因復(fù)雜多樣。臨床上的藥物以抑制免疫反應(yīng)、減輕炎癥為主，不能達(dá)到根治的目的，而且長期使用對機(jī)體產(chǎn)生的副作用較大[3-4]。因此，提高RA的治療效果成為該領(lǐng)域的一大難題。miRNA是由長度為20個左右的核苷酸組成的短鏈內(nèi)源性非編碼的微小RAN分子，在機(jī)體各種疾病的發(fā)生中具有舉足輕重的作用[5]。據(jù)報道，miRNA在RA中也具有調(diào)控作用[6]，其中包括miR-122-5p[7]。盤狀結(jié)構(gòu)域受體激酶(DDR2)屬于受體激酶酪氨酸的一種，大量研究顯示，其在RA中具有重要的促炎作用[8]。本研究擬以RA病人滑膜細(xì)胞為研究對象，檢測miR-122-5p和DDR2在滑膜細(xì)胞的表達(dá)，并觀察調(diào)控 miR-122-5p和DDR2表達(dá)對該細(xì)胞增殖、凋亡的影響，揭示miR-122-5p與DDR2的靶向關(guān)系，旨在為RA的治療提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本文所用組織標(biāo)本，均來自新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的8例RA病人及意外交通事故導(dǎo)致關(guān)節(jié)粉碎性骨折的5例病人。DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自GIBCO公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；甲基噻唑基四唑(MTT)試劑購自美國Sellect公司；LipofectamineTM2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司；Trizol液購自北京百奧萊博；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)發(fā)光液和放射免疫沉淀試驗(RIPA)蛋白裂解液等均購自碧云天生物技術(shù)公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及分組處理 按照梁曉輝等[9]報道的方法，取新鮮滑膜組織剪碎，用DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶消化后進(jìn)行分離培養(yǎng)RA滑膜細(xì)胞和正?；ぜ?xì)胞。將miR-122-5p寡核苷酸模擬物(miR-122-5p mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-122-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-122-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)、miR-122-5p mimics+空載體(pcDNA)、miR-122-5p mimics+DDR2過表達(dá)載體(pcDNA-DDR2)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至RA滑膜細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別標(biāo)記為miR-NC組(A組)、miR-122-5p組(B組)、anti-miR-NC組(C組)、anti-miR-122-5p組(D組)、miR-122-5p+pcDNA組(E組)和miR-122-5p+pcDNA-DDR2組(F組)用于后續(xù)實驗。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測細(xì)胞中miR-122-5p和DDR2的表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞樣本總RNA,并用Nano-Drop 2000微量分光光度計進(jìn)行RNA定量。DNase Ⅰ 消化RNA中可能污染的DNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成模板鏈cDNA。按擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，每個樣品重復(fù)3次，取平均值，反應(yīng)結(jié)束后分析Ct值，以2-△△Ct法計算miR-122-5p和DDR2的相對表達(dá)水平。

1.2.3Western blot法檢測細(xì)胞中DDR2、P21和Survival的蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解20～30 min。以12 000 r/min離心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉將膜封閉2 h；洗膜，加入一抗，4 ℃過夜孵育；洗膜，加二抗，4 ℃孵育2 h。加發(fā)光液，曝光。以GAPDH為內(nèi)參照，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)。

1.2.4MTT實驗檢測細(xì)胞增殖 調(diào)整細(xì)胞密度至107/L，然后接種至96孔板中，取適量的細(xì)胞(每孔1 000個)，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，孵育4 h。終止細(xì)胞培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液上清，然后每孔加入150 μL的DMSO，振蕩使結(jié)晶充分融解，在490 nm波長處檢測細(xì)胞吸光度(OD490)。細(xì)胞增殖能力與細(xì)胞的吸光度值呈正比。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，用500 μL的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，首先加入5 μL的Annexin V-FITC避光反應(yīng)20 min，然后再加入5 μL的PI避光反應(yīng)20 min，最后在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀結(jié)束檢測。細(xì)胞凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.6雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細(xì)胞miR-122-5p與DDR2的結(jié)合力 將熒光素酶報告載體(psiCHECK2-DDR2-WT,psiCHECK2-DDR2-MUT)分別加入用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染miR-122-5p mi-mics和miR-NC的 RA滑膜細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。結(jié)果以海腎熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值表示miR-122-5p與DDR2的結(jié)合力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-122-5p和DDR2在RA滑膜細(xì)胞表達(dá)

qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，與正?；ぜ?xì)胞組相比較，RA滑膜細(xì)胞組細(xì)胞中miR-122-5p表達(dá)顯著降低，DDR2 的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(t=27.714～48.853,P<0.001)。見圖1和表1。

2.2 過表達(dá)miR-122-5p對RA滑膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響

MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖與凋亡結(jié)果顯示，不同時間、不同組別及其二者交互作用下OD490比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與miR-NC組相比較，miR-122-5p組RA滑膜細(xì)胞中miR-122-5p表達(dá)顯著升高，48、72 h時細(xì)胞增殖顯著降低、細(xì)胞凋亡率顯著升高，P21和Survival蛋白表達(dá)均顯著降低(t=16.716～121.500，P<0.001)。見圖2和表2。

A：正?；ぜ?xì)胞；B：RA滑膜細(xì)胞。

表1 兩組滑膜細(xì)胞miR-122-5p和DDR2表達(dá)的比較

A：miR-NC組；B：miR-122-5p組。

表2 過表達(dá)miR-122-5p對RA滑膜細(xì)胞增殖和凋亡影響

2.3 miR-122-5p與DDR2的結(jié)合力檢測

miR-122-5p靶向DDR2的生物信息學(xué)預(yù)測顯示，DDR2與miR-122-5p的5′端存在8個互補(bǔ)的核苷酸序列(見圖3)。雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-122-5p組WT-DDR2細(xì)胞的熒光活性顯著降低(t=100.623，P<0.001)，MUT-DDR2細(xì)胞的熒光活性無顯著變化。見表3。與anti-miR-NC組(1.00±0.01)相比，anti-miR-122-5p組(1.89±0.13)細(xì)胞中DDR2蛋白表達(dá)顯著升高，與miR-NC組(1.01±0.01)相比，miR-122-5p組(0.21±0.02)細(xì)胞中DDR2蛋白表達(dá)顯著降低(F=969.103，P<0.001)。見圖4。

2.4 DDR2過表達(dá)對miR-122-5p調(diào)控RA滑膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響

不同時間、不同組別及二者交互作用下OD490比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與miR-122-5p+pcDNA組相比，miR-122-5p+pcDNA-DDR2組細(xì)胞中DDR2蛋白表達(dá)顯著升高，48、72 h時細(xì)胞增殖顯著升高、細(xì)胞凋亡率顯著降低，P21和Survival蛋白表達(dá)均顯著升高(t=106.335～327.990，P<0.001)。見表4和圖5。

表3 雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果

表4 DDR2過表達(dá)對miR-122-5p調(diào)控RA滑膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖3 miR-122-5p與DDR2的結(jié)合位點(diǎn)

A：miR-NC組，B：miR-122-5p組，C：anti-miR-NC組，D：anti-miR-122-5p組。

B：miR-122-5p組，E：miR-122-5p+pcDNA組，F(xiàn)：miR-122-5p+pcDNA-DDR2組。

3 討 論

miRNA在包括RA的多種疾病中具有重要的作用[10]。如miR-146a、miR-203和miR-223等在關(guān)節(jié)炎中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用[11-13]。WANG等[14]使用miRNA陣列技術(shù)篩選RA病人血漿中的差異miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-122-3p的表達(dá)水平明顯降低。張瑩瑩等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，miR-122-3p在RA病人血漿中異常降低。研究顯示，ANRIL可以通過miR-122-5p/DUSP4軸調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的增殖和凋亡[16-22]。但關(guān)于miR-122-5p在RA中的作用及其對滑膜細(xì)胞的影響尚未見報道。本研究檢測了RA病人滑膜細(xì)胞中miR-122-5p的表達(dá)，研究結(jié)果顯示，miR-122-5p低表達(dá)。進(jìn)一步過表達(dá)miR-122-5p后的結(jié)果顯示，RA滑膜細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，P21和Survival蛋白表達(dá)均顯著降低，說明過表達(dá)miR-122-5p可抑制RA滑膜細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡。這為RA病人滑膜病變機(jī)制提供了基礎(chǔ)，也為miRNA在RA中的診斷和治療研究及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

DDR2為酪氨酸激酶受體家族成員之一，其在RA滑膜組織中的表達(dá)異常升高，對軟骨細(xì)胞具有破壞作用[23]。抑制DDR-2可降低關(guān)節(jié)炎模型小鼠炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞嚴(yán)重程度[24-27]。此外，研究發(fā)現(xiàn)DDR2-CYR61-MMP1信號通路通過調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞的遷移和侵襲，促進(jìn)RA的骨侵蝕[28]。本文研究結(jié)果也顯示，RA滑膜細(xì)胞中DDR2高表達(dá)，與文獻(xiàn)報道結(jié)果相一致[23]，這為探索DDR2在RA中的功能提供了體外研究的理論依據(jù)。本實驗結(jié)果還表明，miR-122-5p靶向負(fù)調(diào)控DDR2的表達(dá)，以及過表達(dá)DDR2可抑制miR-122-5p對RA滑膜細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，這說明不僅miR-122-5p可靶向調(diào)控DDR2的表達(dá)，而且DDR2也可逆向調(diào)控miR-122-5p的表達(dá)，從而發(fā)揮對RA的調(diào)控功能。這為miR-122-5p在RA治療中的潛在價值開發(fā)提供了更充分的理論依據(jù)。

綜上所述，miR-122-5p可抑制RA滑膜細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與miR-122-5p靶向調(diào)控DDR2有關(guān)，本研究結(jié)果為RA治療提供了新的方向。但miR-122-5p上游基因是如何調(diào)控其表達(dá)及其在RA發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未明確。