不同種類中藥廢棄物和中藥復(fù)方的體外抑菌試驗

陸祖瑜 ， 濮春娟 ， 劉 莎 ， 羅鈺枝 ， 陳美蘭

(中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心 ， 北京 東城 100007)

隨著畜禽飼料禁抗令的全面推進(jìn)，尋找更為安全高效的抑菌殺菌藥物迫在眉睫。天然中草藥因具有抗菌范圍廣、毒性低、不易產(chǎn)生耐藥性以及價格低廉等優(yōu)點成為動物替抗藥研究的焦點。大量的文獻(xiàn)表明，清熱解毒類中藥在細(xì)菌感染治療中表現(xiàn)出很好的療效，如清熱藥黃芩、黃連、黃柏能有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和嗜酸乳桿菌的增殖[1]。中藥(Traditional Chinease medicine,TCM)的許多有效成分都具有抗菌活性，黃酮類如黃芩苷，生物堿類如黃連小檗堿，有機(jī)酸類如綠原酸，以及揮發(fā)油成分等都具有顯著的抑菌殺菌作用[2]?，F(xiàn)代中藥企業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生了大量的中藥廢棄物——中藥渣、中藥材非藥用部位等，清熱類中藥廢棄物大都保留多種抗菌抑菌活性成分，也極具開發(fā)利用價值。例如，楊璇璇等[3]優(yōu)化提取工藝,從1 g苦參渣中提取到5.632 mg苦參堿；李靜等[4]研究發(fā)現(xiàn)，忍冬根、藤、葉和果都含有抗菌活性成分——綠原酸?；诖?，本試驗以7種中藥廢棄物和3種中藥復(fù)方為材料，研究它們對大腸埃希菌、腸炎沙門菌和金黃色葡菌球菌的體外抑制作用，為畜禽細(xì)菌感染的防治以及中藥廢棄物的綜合利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料 中藥復(fù)方1(金銀花、連翹、黃芩等)、中藥復(fù)方2(地錦草、石膏、梔子等)、中藥復(fù)方3(黃連、石膏、苦參等)、牛黃上清藥渣(黃連、黃柏、黃芩等17種藥渣)、連花清瘟藥渣(連翹、金銀花、炙麻黃等13種藥渣)、銀翹藥渣(金銀花、連翹、薄荷等9種藥渣)、清開靈藥渣(梔子、板藍(lán)根、金銀花)、苦參藥渣、忍冬藤、忍冬葉，中藥復(fù)方和中藥廢棄物均來自河北森隆藥業(yè)。中藥渣來自以嶺藥業(yè)和白云山明興制藥有限公司。氨芐西林粉末(>98%)，購自北京華越洋生物公司，批號：BC2008K。頭孢噻肟鈉粉末(>98%),購自生工生物工程(上海)股份有限公司,批號：FA29BA0009。氨芐西林藥敏紙片和頭孢噻肟鈉藥敏紙片，均購自上海源葉生物科技有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂糖，均購自英國OXOID生物公司。NaCl，購自天津鼎盛鑫化工有限公司。

1.2 供試菌種 大腸埃希菌(CVCC3959)、腸炎沙門菌(CVCC3949)、金黃色葡萄球菌(CVCC4098)凍干粉，均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 方法

1.3.1 藥液制備 中藥復(fù)方/中藥廢棄物粉碎成粗粉。分別取40 g藥粉，1∶10(m/V)加入400 mL 70%乙醇-水溶液浸泡過夜，超聲提取2次，合并濾液。旋蒸濾液濃縮至1 g/mL。濃縮液過0.22 μm濾膜除菌，放置4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 菌液制備 吸取少量培養(yǎng)基溶解菌凍干粉，吸取40 μL菌液到培養(yǎng)基中，200 r/min,37 ℃培養(yǎng)24 h復(fù)活菌種。吸取菌液平板劃線分離單菌落。挑取單菌落到液體培養(yǎng)基，200 r/min，37 ℃培養(yǎng)6 h。在對數(shù)期將菌液稀釋到106CFU/mL，備用。

1.3.3 抑菌圈檢測 參照文獻(xiàn)[4]將直徑6 mm空白藥敏紙片浸泡在1 g/mL中藥提取液中，待浸透后取出，超凈臺內(nèi)風(fēng)干備用。吸取少量菌液均勻涂布平板，待菌液稍吸收后取含藥紙片貼在平板上。每個平板均勻貼2張含藥紙片及1張對照藥物藥敏紙片(氨芐西林或頭孢噻肟鈉)。紙片間圓心距要大于3 cm。每組設(shè)置3個平行。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后分別測量抑菌圈直徑，并計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

抑菌強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥20 mm為極敏，抑菌圈直徑在15～19 mm為高敏，抑菌圈直徑在10～14 mm為中敏，抑菌圈直徑<10 mm為低敏，無抑菌圈為耐藥。

1.3.4 最低抑菌濃度(MIC)檢測 參照文獻(xiàn)[5]通過二倍稀釋法測中藥最低抑菌濃度。取96孔微量板，在第1～11孔加入100 μL培養(yǎng)基，第1孔加入 100 μL藥液，混勻后吸取100 μL到第2孔，重復(fù)操作，第8孔棄100 μL。最終1～8孔濃度分別為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.81 mg/mL和3.91 mg/mL。第9孔為陰性對照，加100 μL培養(yǎng)基。第10孔為藥物對照，加入氨芐西林(金黃色葡萄球菌的藥物對照)或頭孢噻肟鈉。每個藥物設(shè)置3個平行。每孔加入10 μL菌液，置于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。培養(yǎng)基肉眼可見澄清即認(rèn)為該濃度對相應(yīng)菌種有抑菌作用。

藥物抑菌強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)MIC<7.81 mg/mL為高度敏感；當(dāng)7.81 mg/mL≤MIC≤250 mg/mL為中度敏感；MIC>250 mg/mL為不敏感。

1.3.5 最低殺菌濃度(MBC)檢測 挑選出對應(yīng)中藥抑菌MIC以及比MIC高1倍濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布，每組濃度設(shè)置3個平行。置于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。平板內(nèi)菌落數(shù)≤5可認(rèn)為該濃度能有效殺菌。

2 結(jié)果

2.1 3種中藥復(fù)方和7種中藥廢棄物對3種病原菌的抑菌圈檢測 不同種類的中藥廢棄物以及中藥復(fù)方對金黃色葡萄球圖和其他2種病原菌的抑菌作用有明顯差異。對于金黃色葡萄球菌，3種中藥廢棄物和3種中藥復(fù)方都具有明顯的抑菌作用，但是抑菌作用強(qiáng)度不同，結(jié)果見表1。其中中藥復(fù)方1、中藥復(fù)方3、銀翹藥渣對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均>20 mm，為金黃色葡萄球菌極敏藥物。中藥復(fù)方2、牛黃上清藥渣的抑菌圈直徑分別為17.11 mm和18.17 mm，介于15～19 mm，為金黃色葡萄球菌高敏藥物。連花清瘟的抑菌圈直徑為13.58 mm，介于10～14 mm，表現(xiàn)為金黃色葡萄球菌中敏藥物。而忍冬藤、忍冬葉、苦參渣、清開靈渣對金黃色葡萄球菌沒有明顯抑菌圈。另外，對照藥物氨芐西林對金黃色葡萄球菌抑菌圈的平均直徑為41.06 mm，為金黃色葡萄球菌極敏藥物。而對于大腸埃希菌，只有中藥復(fù)方1對大腸埃希菌有明顯抑菌透明圈，平均抑菌圈直徑為13.89 mm，這表示大腸埃希菌對該藥中度敏感。然而，10種藥物對于腸炎沙門菌都沒有抑菌透明圈。

表1 金黃色葡萄球菌抑菌圈檢測

另外，對照藥氨芐西林對于大腸埃希菌和腸炎沙門菌也沒有明顯的抑菌透明圈，而另一種對照藥頭孢噻肟鈉對上述2種病原菌具有明顯的抑菌圈，抑菌圈大小分別為25.18 mm和38.60 mm，為極敏藥物。該結(jié)果表明大腸埃希菌和腸炎沙門菌對于氨芐西林具有耐藥性，而對頭孢噻肟鈉極敏。因此在進(jìn)行大腸埃希菌和腸炎沙門菌的MIC和MBC試驗時采用頭孢噻肟鈉作為對照藥物。

2.2 3種中藥復(fù)方和7種中藥廢棄物對3種病原菌的MIC 結(jié)果表明不同種類中藥復(fù)方以及中藥廢棄物對于金黃色葡萄球菌和其他2種病原菌的最低抑菌濃度有差異(表2)。對于金黃色葡萄球菌，3種中藥復(fù)方和6種中藥廢棄物(除清開靈藥渣外)都能有效抑制金黃色葡萄球菌生長，但是MIC不同。其中牛黃上清、銀翹、連花清瘟藥渣和中藥復(fù)方1的MIC值為3.91 mg/mL，說明金黃色葡萄球菌對這4種藥物高度敏感。其余6種藥物對金黃色葡萄球菌MIC值均在7.81～250 mg/mL，屬于中度敏感藥物，抑菌強(qiáng)度(MIC值大小)：中藥復(fù)方2>中藥復(fù)方3>忍冬藤>忍冬葉=苦參>清開靈藥渣。

表2 3種中藥復(fù)方和7種中藥廢棄物對3種病原細(xì)菌最低抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentration of 3 TCM compounds and 7 TCM residues to 3 pathogenic bacteria (mg/mL)

對于大腸埃希菌，3種中藥復(fù)方和4種中藥廢棄物有中度抑制該菌生長的作用。抑菌有效的7種藥物對大腸埃希菌MIC值在62.5～250 mg/mL，為中度敏感藥物，抑菌強(qiáng)度(MIC值大小)：中藥復(fù)方1>中藥復(fù)方3>中藥復(fù)方2=牛黃上清藥渣=銀翹藥渣=清開靈藥渣=忍冬藤。連花清瘟藥渣、忍冬葉和苦參渣MIC值均≥500 mg/mL,抑菌無效。

針對腸炎沙門菌，4種中藥廢棄物以及中藥復(fù)方1對該菌有中度抑菌作用。中藥復(fù)方1和忍冬藤等4種中藥廢棄物對腸炎沙門菌的MIC值在125～250 mg/mL，為腸炎沙門菌中度敏感藥物，抑菌強(qiáng)度(MIC值大小)：中藥復(fù)方1=忍冬藤>牛黃上清藥渣=銀翹藥渣=清開靈藥渣。中藥復(fù)方2、中藥復(fù)方3、連花清瘟藥渣、忍冬葉和苦參渣MIC值均≥500 mg/mL，抑菌無效。

2.3 3種中藥復(fù)方和7種中藥廢棄物對3種病原菌的MBC 3種中藥復(fù)方和7種中藥廢棄物對金黃色葡萄球菌有顯著殺菌作用，但對大腸埃希菌和腸炎沙門菌殺菌作用不佳，結(jié)果見表3。試驗中10種藥物對金黃色葡萄球菌都有不同程度的殺菌效果。中藥復(fù)方1、牛黃上清藥渣、銀翹藥渣、中藥復(fù)方2和連花清瘟藥渣對金黃色葡萄球菌的MBC值在3.91～7.81 mg/mL，為金黃色葡萄球菌強(qiáng)效殺菌藥物。10種藥物的殺菌強(qiáng)度(MBC值)：中藥復(fù)方1=銀翹藥渣>中藥復(fù)方2=連花清瘟藥渣>牛黃上清藥渣>苦參渣>忍冬葉>清開靈藥渣。

表3 3種中藥復(fù)方和7種中藥廢棄物對3種細(xì)菌最低殺菌濃度Table 3 Minimum bactericidal concentration of 3 TCM compounds and 7 TCM residues to 3 pathogenic bacteria (mg/mL)

10種藥物對大腸埃希菌和腸炎沙門菌的殺菌作用較弱。對于大腸埃希菌，中藥復(fù)方1和5種中藥廢棄物(牛黃上清藥渣、銀翹藥渣、忍冬葉、忍冬藤和清開靈藥渣)MBC值均為500 mg/mL。然而，連花清瘟藥渣、中藥復(fù)方2、中藥復(fù)方3和苦參渣的MBC值在500 mg/mL以下，沒有殺大腸埃希菌作用。對于腸炎沙門菌，中藥復(fù)方1殺菌效果最好，MBC值為250 mg/mL。而牛黃上清藥渣、銀翹藥渣、中藥復(fù)方2和清開靈藥渣的MBC值均為500 mg/mL,說明這4種藥物在高濃度下也能有效殺菌。而連花清瘟藥渣、中藥復(fù)方3、忍冬葉、忍冬藤、苦參渣的MBC值為500 mg/mL，也沒有表現(xiàn)出殺腸炎沙門菌作用。

3 討論

大腸埃希菌、腸炎沙門菌和金黃色葡萄球菌發(fā)病率高、致病性強(qiáng)，對畜禽動物的生命健康有很大的威脅，同時直接影響到食品安全。相比于抗生素，清熱類中藥治療細(xì)菌感染更為安全有效。本試驗結(jié)果表明，9種藥物(除清開靈藥渣外)都對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌和殺菌作用，其中中藥復(fù)方1、中藥復(fù)方2、牛黃上清藥渣、連花清瘟藥渣和銀翹藥渣對金黃色葡萄球菌為高度敏感藥物。因此中藥復(fù)方1、中藥復(fù)方2、牛黃上清藥渣、連花清瘟藥渣和銀翹藥渣都可進(jìn)一步研究開發(fā)成用于防治由金黃色葡萄球菌引起的家禽、家畜疾病的藥物。然而，僅有中藥復(fù)方1和中藥復(fù)方3對大腸埃希菌表現(xiàn)為中度敏感；僅有忍冬藤和中藥復(fù)方1表現(xiàn)為腸炎沙門菌中度敏感。因此為了篩選出對大腸埃希菌和腸炎沙門菌表現(xiàn)為高敏感的中藥復(fù)方或中藥廢棄物，我們將選擇更多的中藥復(fù)方和中藥廢棄物來進(jìn)行抑菌試驗。

大部分清熱類中藥本身具有廣譜抑菌作用。由于提取工藝和成本限制，藥渣會殘留部分藥效成分，再次提取依然能發(fā)揮出不同程度的抑菌作用。史利克等[7]試驗發(fā)現(xiàn)，連花清瘟浸膏在低濃度(2～8 mg/mL)對耐藥金黃色葡萄球菌有抑菌作用，在128 mg/mL下抑制大腸埃希菌生長。本試驗結(jié)果與史利克等[7]的結(jié)果相符，連花清瘟藥渣在低濃度(7.81 mg/mL)下可以對金黃色葡萄球菌有抑制作用，在高濃度(500 mg/mL)下對腸炎沙門菌和大腸埃希菌也有抑菌作用?？赡苁且驗檫B花清瘟本身含有多種抗炎抑菌作用成分，如薄荷腦、綠原酸、連翹苷和大黃黃酮類等[8]，提取后的連花清瘟藥渣也保留了部分的抑菌成分。而另一種清熱燥濕中藥——苦參，也含有多種抑菌活性成分，苦參總生物堿、苦參黃酮等對多種致病菌有一定的抑制作用[9]，本試驗結(jié)果也表明苦參渣對金黃色葡萄球菌具有中度抑菌作用。

忍冬藥用部位忍冬花通常被認(rèn)為是藥效成分積累最多的植物部位，但同一藥用植物上非藥用部位也有含量稍低的相同藥效成分，也能在一定程度上發(fā)揮出藥效[10]。金銀花、忍冬葉、忍冬藤都含有抑菌成分如綠原酸和黃酮類，但抑菌活性成分在忍冬不同部位的濃度不同[11]。李瑞國等[12]研究發(fā)現(xiàn),忍冬藤提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性強(qiáng)于忍冬葉，而對大腸埃希菌的抑菌活性不及忍冬葉。本試驗同樣發(fā)現(xiàn)，忍冬葉和忍冬藤都有抑制金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的作用。但忍冬藤對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑制作用都強(qiáng)于忍冬葉。本試驗結(jié)果優(yōu)于前人的結(jié)果，可能是因為試驗采用的提取方法不同導(dǎo)致提取效率有差異，本次采用的提取方法可能對忍冬藤有效成分的提取效率更優(yōu)。

大部分中藥非藥用部位和中藥渣目前主要是當(dāng)作生活垃圾進(jìn)行焚燒、填埋和固定區(qū)域堆放處理。這不僅要投入大量的資金，占用了大量的土地資源，還污染了土地及地下水，也造成中藥廢棄物資源的浪費[13]。本試驗結(jié)果表明，7種清熱類中藥非藥用部位和中藥藥渣仍保留部分藥效成分，依然可以發(fā)揮出藥效價值，具有開發(fā)成動物替抗藥物的潛力。本試驗可為將來利用中藥廢棄物開發(fā)中藥抗生素提供思路和指導(dǎo)。另外，為了進(jìn)一步將此類藥物開發(fā)成動物替抗藥物，還需要深入考察其在染病畜禽體內(nèi)的作用機(jī)制及安全性。