基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在病原微生物鑒定中的應(yīng)用

張浩然 ， 孫冰清 ， 徐 汀 ， 黃家鶯 ， 張亦菲 ，田 愷 ， 華賢輝 ， 孟 和

(1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室 ， 上海 閔行 200240 ； 2. 上海市動物疫病預(yù)防控制中心 ， 上海 長寧 201103)

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技術(shù)最早由田中耕一于1987年提出[1-2]，之后逐漸發(fā)展并應(yīng)用于病原微生物的鑒定[3]。MALDI-TOF MS技術(shù)憑借其簡單快速、高效準(zhǔn)確等優(yōu)點[4]，已廣泛應(yīng)用于食品[5]、水產(chǎn)[6]、人類及獸醫(yī)臨床[7-8]等多個領(lǐng)域的病原微生物鑒定工作，在細(xì)菌、真菌和病毒鑒定方面，展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力[9]。

本文從細(xì)菌、真菌、病毒三方面綜述了MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定病原微生物的研究進(jìn)展，探討了該技術(shù)的優(yōu)勢和不足，并給出其發(fā)展建議。

1 MALDI-TOF MS的基本原理

MALDI-TOF MS主要包含5個模塊，分別是進(jìn)樣模塊、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器和數(shù)據(jù)處理模塊。其中MALDI是離子源，TOF MS是飛行時間質(zhì)量分析器，兩者是MALDI-TOF MS技術(shù)的關(guān)鍵部分。

MALDI的主要原理是首先將病原微生物樣品分散在水、甲醇或乙醇等基質(zhì)中，形成共晶體膜。然后，利用某一波長的激光對共晶體膜進(jìn)行照射，基質(zhì)吸收能量后，將其傳遞給樣品，從而令樣品在瞬間蒸發(fā)解吸達(dá)到離子化的目的[10-13]。TOF MS的主要原理是離子在電場作用下進(jìn)入飛行管道，由于測定離子的質(zhì)荷比不同，其在通過管道到達(dá)檢測器的飛行時間也不同，從而達(dá)到檢測離子的目的[14-15]。利用質(zhì)荷比和信號強度得到質(zhì)譜圖，再通過數(shù)據(jù)處理模塊分析，得到待測病原微生物樣品蛋白的特異性指紋圖譜，并將其與數(shù)據(jù)庫中的參考圖譜進(jìn)行對比，從而得到鑒定結(jié)果并由此達(dá)到病原微生物鑒定的目的[16-17]。

2 MALDI-TOF MS技術(shù)在病原微生物鑒定方面的應(yīng)用

2.1 對細(xì)菌的鑒定

2.1.1 對革蘭陰性菌的鑒定 大腸埃希菌為動物和人類臨床常見的病原微生物，致病性大腸埃希菌會導(dǎo)致新生兒敗血癥、影響畜禽和魚類生長繁殖，嚴(yán)重威脅人類和動物健康[18-19]。但是，許多國家標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌鑒定方法以生化鑒定為主，其用時長、操作繁瑣，因此部分學(xué)者開始尋求新的革蘭陰性菌鑒定技術(shù)。

高蕓等[20]采用MALDI-TOF MS技術(shù)完成了對豬腸道菌群中的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌等的鑒定，并對mcr-1陽性菌株進(jìn)行了分型研究，發(fā)現(xiàn)了mcr-1在豬腸道菌群中克隆傳播的現(xiàn)象及水平傳播的可能，并且肯定了MALDI-TOF MS技術(shù)在細(xì)菌鑒定及分型研究中的技術(shù)優(yōu)勢。此外，為探究MALDI-TOF MS技術(shù)在革蘭陰性菌鑒定方面的可靠性，王旭暉等[21]將MALDI-TOF MS和VITEK-2全自動微生物鑒定2種技術(shù)進(jìn)行比較，對臨床分離得到的120株常見革蘭陰性菌進(jìn)行鑒定，差異結(jié)果采用16S rDNA測序驗證。結(jié)果顯示，115株細(xì)菌的鑒定結(jié)果相符合，5株不符合，符合率達(dá)到95.83%；通過對5株差異菌株進(jìn)行16S rDNA測序，發(fā)現(xiàn)有2株測序結(jié)果與VITEK-2鑒定結(jié)果一致，3株測序結(jié)果與MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果一致。由此表明，MALDI-TOF MS技術(shù)在常見革蘭陰性菌鑒定及分型檢測方面均具有較高的準(zhǔn)確性，有助于實驗室人員的日常高通量檢測任務(wù)。

2.1.2 對革蘭陽性菌的鑒定 如今，飼料減抗是畜牧業(yè)的大勢所趨。因此，作為抗生素的代替品，益生菌類制劑逐漸被畜禽養(yǎng)殖業(yè)所關(guān)注[22]。根據(jù)《飼料添加劑品種目錄(2013)》規(guī)定，糞腸球菌、屎腸球菌作為抗逆性較強的益生菌，被允許在飼料中使用。但是，作為機(jī)會致病菌，腸球菌也會引起人和動物的多種感染[23]，因此，需要建立快速鑒別糞腸球菌、屎腸球菌等革蘭陽性菌的方法，以規(guī)范飼料添加劑市場，從而保障人和動物食品安全。

馬艷寧等[24]利用MALDI-TOF MS技術(shù)對2013年1月—2014年9月間臨床分離的革蘭陽性菌進(jìn)行確認(rèn)，共鑒定出革蘭陽性球菌3 812株，分別為2 094株葡萄球菌屬共18種、1 254株腸球菌屬共10種、374株鏈球菌屬共19種以及90株其他革蘭陽性球菌9個屬，通過鑒定還發(fā)現(xiàn)了常規(guī)鑒定方法不能鑒定出的罕見菌種及其亞種。該研究表明，MALDI-TOF MS技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地鑒定臨床常見的革蘭陽性球菌，并且在罕見菌種鑒定方面具有明顯優(yōu)勢。此外，王海花等[25]用16S rRNA測序結(jié)果分析了MALDI-TOF MS技術(shù)和VITEK-2技術(shù)鑒定革蘭氏陽性菌的準(zhǔn)確性。根據(jù)16S rRNA測序結(jié)果，33株豬源性腸球菌分別為10株糞腸球菌和23株屎腸球菌。相較之下，VITEK-2技術(shù)僅有26株細(xì)菌被鑒定至種的水平，其中糞腸球菌8株，屎腸球菌0株，鉛黃腸球菌18株，與測序結(jié)果的一致性較低，為21%(7/33)；利用MALDI-TOF MS技術(shù)33株細(xì)菌全部被鑒定至種的水平，其中糞腸球菌13株，屎腸球菌20株，與測序結(jié)果的一致性較高，為88%(29/33)。該研究表明，對于腸球菌的檢定，MALDI-TOF MS技術(shù)比VITEK-2技術(shù)更具優(yōu)勢。

另有研究表明[26]，動物源性屎腸球菌會因為傳代次數(shù)不同而發(fā)生變化，從而影響VITEK-2技術(shù)的鑒定結(jié)果，這與王?；ǖ萚25]的研究結(jié)果一致，也進(jìn)一步解釋了VITEK-2技術(shù)在鑒定屎腸球菌方面存在的不足，而MALDI-TOF MS技術(shù)存在優(yōu)勢。

2.2 對真菌的鑒定 真菌又名霉菌毒素。飼料被真菌污染后適口性變差，導(dǎo)致畜禽采食量下降從而影響其生長[27]，還會降低畜禽的繁殖性能甚至損害其肝臟、腎臟等器官[28]。此外，霉菌毒素會在肉、蛋、奶等動物源性食品中富集，威脅人類健康[29]。國際上NHI、Bruker Daltonik等機(jī)構(gòu)相繼建立了質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫并利用MALDI-TOF MS技術(shù)取得了90%以上的鑒定準(zhǔn)確率[30-31]。Mcmullen等[32]采用MALDI-TOF MS技術(shù)對144株曲霉菌進(jìn)行了鑒定，鑒定至種水平的有133株，占93.6%，并且能夠?qū)⑿螒B(tài)學(xué)鑒定為屬水平的13株菌進(jìn)一步鑒定至種。張偉錚等[33]采用MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定了254株絲狀真菌，并以測序技術(shù)對鑒定結(jié)果進(jìn)行驗證，總體符合率為83.97%，其中，毛癬菌屬、毛孢子菌屬和毛霉菌屬符合率為100%，曲霉菌屬符合率為96.5%，并且形態(tài)學(xué)難以區(qū)分的真菌也能夠得到鑒定。

真菌鑒定常用的方法有形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定。其中形態(tài)學(xué)鑒定具有主觀因素，并且很多菌落形態(tài)在鏡檢時難以判斷，而分子生物學(xué)鑒定對實驗室及操作人員的要求較高且操作復(fù)雜，不利于大量樣品的鑒定工作[34]。MALDI-TOF MS技術(shù)在真菌鑒定方面準(zhǔn)確高效，并且隨著質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的不斷更新，其鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性會進(jìn)一步提高。

2.3 對病毒的鑒定 雖然MALDI-TOF MS技術(shù)主要應(yīng)用于細(xì)菌鑒定，但已有部分研究人員將該技術(shù)應(yīng)用于鑒定病毒的研究中，并且取得了良好進(jìn)展[35]。萬敏等[36]比較了MALDI-TOF MS技術(shù)和表面等離子諧振技術(shù)(SPR)對人乳頭瘤病毒(HPV)的鑒定，發(fā)現(xiàn)2種技術(shù)對國家參考品的檢測結(jié)果一致。利用測序技術(shù)鑒別了93份陽性樣本(高危型77份)和36份陰性樣本;MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定陽性樣本82份，陰性樣本32份，分型靈敏性為88.2%(82/93)，特異性為88.9%(32/36)，對高危型樣本的分型準(zhǔn)確率為100%(77/77)，說明MALDI-TOF MS技術(shù)能夠較好地應(yīng)用于病毒鑒定。

3 MALDI-TOF MS技術(shù)的優(yōu)勢與不足

3.1 MALDI-TOF MS技術(shù)的優(yōu)勢 目前多數(shù)病原微生物鑒定以生化和形態(tài)鑒定為主，其成本低且對設(shè)備需求不高，但是普遍存在效率低下、準(zhǔn)確性欠佳等問題，難以滿足時效性及高通量作業(yè)的要求[37-38]。分子生物學(xué)鑒定(如16S rDNA技術(shù))的結(jié)果可靠，但其檢測成本和操作門檻較高，推廣起來存在諸多限制[39-40]。MALDI-TOF MS技術(shù)在病原微生物鑒定方面具有高效、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、檢測價格低廉等優(yōu)勢[38]，有望成為替代傳統(tǒng)生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定的新技術(shù)。

3.2 MALDI-TOF MS技術(shù)的不足 MALDI-TOF MS技術(shù)最大的局限性在于數(shù)據(jù)庫。MALDI-TOF MS在鑒定時需要進(jìn)行數(shù)據(jù)庫匹配，難以識別沒有添加到數(shù)據(jù)庫中的病原微生物[41]。國際上一些機(jī)構(gòu)已著手建立數(shù)據(jù)庫[30-31]，國內(nèi)的數(shù)據(jù)庫建立工作也已經(jīng)起步。鮑春梅等[42]在國際上首次建立了宋內(nèi)志賀菌質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，并利用MALDI-TOF MS技術(shù)分別分析了直接涂抹法及提取法對50株宋內(nèi)志賀菌的鑒定情況，其中，提取法處理的鑒定結(jié)果符合率為100%，直接涂抹法處理的鑒定結(jié)果符合率為60%。該結(jié)果說明，數(shù)據(jù)庫的建立為MALDI-TOF MS技術(shù)的長久發(fā)展提供了保障，但不同的前處理方式會干擾鑒定結(jié)果。

不僅如此，有研究指出，病原微生物的培養(yǎng)時間[43]、培養(yǎng)基的選擇[44]也會影響鑒定結(jié)果。目前，國內(nèi)部分?jǐn)?shù)據(jù)庫圖譜直接引自國外，那么國內(nèi)外地域環(huán)境的差異、實驗室間病原微生物培養(yǎng)方式的差異等，都對數(shù)據(jù)庫圖譜造成影響，從而干擾鑒定結(jié)果[45]。由此引出另一個問題，即缺乏一套標(biāo)準(zhǔn)化的流程。這會使各實驗室操作人員對于MALDI-TOF MS的參數(shù)設(shè)置、待鑒定病原微生物的培養(yǎng)條件、試驗的前處理方式難以統(tǒng)一，對MALDI-TOF MS技術(shù)從新興走向成熟提出了挑戰(zhàn)。

4 MALDI-TOF MS技術(shù)的發(fā)展方向

4.1 建立數(shù)據(jù)共享平臺 數(shù)據(jù)庫看似制約了MALDI-TOF MS技術(shù)的發(fā)展，實則是該技術(shù)擁有無限潛力的有力保證。目前各大品牌的數(shù)據(jù)庫均支持用戶自我添加，并且會定期進(jìn)行更新。此外，隨著各領(lǐng)域研究的不斷深入，越來越多的本土化標(biāo)準(zhǔn)圖譜會進(jìn)一步完善數(shù)據(jù)庫內(nèi)容[46-48]，從而逐漸避免因國內(nèi)外地域差異和試驗操作差異對鑒定結(jié)果的影響。因此，目前的首要任務(wù)是建立一個完善的數(shù)據(jù)共享機(jī)制，在確保數(shù)據(jù)科學(xué)準(zhǔn)確的前提下，讓每個實驗室都能分享各自的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，共同打造一個本土化的數(shù)據(jù)共享平臺，這將是MALDI-TOF MS技術(shù)未來的發(fā)展方向。

4.2 推行MALDI-TOF MS技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化 國家標(biāo)準(zhǔn)《基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則》(GB/T 33682—2017)的出臺推進(jìn)了MALDI-TOF MS技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化工作的進(jìn)程。但是，除了頂層的通則標(biāo)準(zhǔn)，還需要在細(xì)節(jié)上制定相應(yīng)的方法標(biāo)準(zhǔn)，針對不同病原微生物建立相應(yīng)的培養(yǎng)、前處理標(biāo)準(zhǔn)流程，建立統(tǒng)一的評判標(biāo)準(zhǔn)等，從而對儀器的規(guī)范操作、質(zhì)控手段、鑒定流程、報告格式等多方面進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范。當(dāng)然，隨著MALDI-TOF MS技術(shù)的廣泛應(yīng)用，數(shù)據(jù)庫的建庫標(biāo)準(zhǔn)也必將提上日程。因此，一整套科學(xué)規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)化體系將是MALDI-TOF MS技術(shù)的走向成熟的關(guān)鍵。