枯草芽孢桿菌對(duì)魚(yú)類氣單胞菌的拮抗作用

閆子豪 , 劉 洋 , 李月紅,2

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118 ； 2. 動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

益生菌可以改善宿主體內(nèi)的生態(tài)環(huán)境，減少疾病的發(fā)生，近年來(lái)成為水生動(dòng)物飼喂抗生素最有潛力的替代品?？莶菅挎邨U菌作為益生菌中的一大類，具有改善水體的生態(tài)環(huán)境、抑制有害菌的生長(zhǎng)、維持和調(diào)整腸道微生態(tài)平衡、提高飼料利用率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、緩解重金屬對(duì)魚(yú)體腸道的影響[1]等優(yōu)良特性;可以形成芽孢，在極端惡劣的條件下生存，細(xì)胞壁中不含內(nèi)毒素，可以分解明膠，還原硝酸鹽，水解淀粉，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中經(jīng)常使用的微生態(tài)制劑[2]。微生態(tài)制劑進(jìn)入腸道后可以通過(guò)生物拮抗和爭(zhēng)奪氧氣含量抑制有害微生物的生長(zhǎng)，拮抗作用是微生物之間普遍存在的自然現(xiàn)象，微生物可以通過(guò)分泌抗生素、有機(jī)酸等拮抗物質(zhì)來(lái)抑制其他微生物生長(zhǎng)?？莶菅挎邨U菌能顯著提高吉富羅非魚(yú)幼體的免疫功能、抗氧化力和攻毒存活率，減少生產(chǎn)上的用藥，有利于構(gòu)建無(wú)公害養(yǎng)殖模式。

氣單胞菌嗜溫型(運(yùn)動(dòng)性)包括維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、舒伯特氣單胞菌和溫和氣單胞菌等。還有一類是嗜冷型(非運(yùn)動(dòng)性)氣單胞菌[4]。氣單胞菌是魚(yú)類運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌敗血癥(MAS)的主要病原體，發(fā)病特征表現(xiàn)為身體充血和腹部膨脹。氣單胞菌主要存在于淡水魚(yú)類中，偶爾也存在于海洋魚(yú)類中。其他水生動(dòng)物，包括對(duì)蝦、螃蟹、貽貝、鰻魚(yú)和青蛙也易感，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌的多種毒力基因，如外毒素(又稱腸毒素)、氣溶素、外膜蛋白、彈性蛋白酶、金屬蛋白酶、各種黏附因子等[5]。氣單胞菌對(duì)我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的威脅越來(lái)越大，更重要的是，氣單胞菌通過(guò)水和水生食物從環(huán)境傳播給人類，導(dǎo)致近年來(lái)人類感染增加，包括急性腹瀉以及皮膚和軟組織感染。目前，氣單胞菌作為食源性致病菌越來(lái)越受到重視[6]。

1 氣單胞菌

1.1 氣單胞菌的致病機(jī)理 以嗜水氣單胞菌為例，它可以產(chǎn)生多種毒力因子。氣溶素(Aerolysin)是嗜水氣單胞菌的主要毒性蛋白，可以通過(guò)在細(xì)胞膜表面形成孔洞造成溶血[7]。彈性蛋白酶(Elastase)是嗜水氣單胞菌產(chǎn)生的一種熱穩(wěn)定的金屬蛋白酶，該蛋白酶可以水解彈性蛋白和酪蛋白，有研究證明，彈性蛋白酶可以造成鰻魚(yú)和小鼠死亡[8]。金屬蛋白酶(Metalloprotease)是一類活性依賴于金屬離子的蛋白酶，可以幫助細(xì)菌入侵宿主和幫助細(xì)菌在宿主體內(nèi)繁殖，并且造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡[9]。Suarez等[10]報(bào)道了嗜水氣單胞菌SSU的6型分泌系統(tǒng)(T6SS)在小鼠模型中發(fā)揮了重要的毒力作用，溶血共調(diào)節(jié)蛋白(Hcp)能夠被運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，通過(guò)Caspase 3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，幫助細(xì)菌逃避宿主的天然免疫，來(lái)讓細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)更好地繁殖。

1.2 氣單胞菌的危害 研究表明[11],由維氏氣單胞菌分泌的氣溶素破壞了斑馬魚(yú)的腸道屏障，促使維氏氣單胞菌本身和其他氣單胞菌進(jìn)入到魚(yú)的體內(nèi)導(dǎo)致魚(yú)死亡。我國(guó)華南地區(qū)血病暴發(fā)的主要原因是維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的聯(lián)合感染，并且維氏氣單胞菌是疾病暴發(fā)的先決條件。近年來(lái)，在我國(guó)發(fā)現(xiàn)的由于感染維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌而引發(fā)疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且因?yàn)榭股氐氖褂?，使得這些菌株耐藥性和毒力也變強(qiáng)。Uzun等[12]在對(duì)市場(chǎng)購(gòu)置的水產(chǎn)品和肉產(chǎn)品中分離的87株菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌占有60%。龔倩等[13]發(fā)現(xiàn)，吉林某養(yǎng)殖場(chǎng)中框鏡鯉細(xì)菌疾病暴發(fā)的致病菌為維氏氣單胞菌。鄧院生等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蘇州地區(qū)大部分鯽魚(yú)出血死亡是由維氏氣單胞菌導(dǎo)致的。Ran等[15]在2018年進(jìn)行的研究顯示，2009—2014年我國(guó)南方各省的鯉魚(yú)敗血癥暴發(fā)是由維氏氣單胞菌而非嗜水氣單胞菌引起的。

2 枯草芽孢桿菌

2.1 枯草芽孢桿菌的作用機(jī)理 在水生生物中，枯草芽孢桿菌主要有2種行為方式，競(jìng)爭(zhēng)排斥和免疫調(diào)節(jié)，通過(guò)刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，增強(qiáng)細(xì)胞免疫誘導(dǎo)動(dòng)物自身免疫反應(yīng)，提高自身免疫力。加入水體或者通過(guò)魚(yú)類排便進(jìn)入水體后，枯草芽孢桿菌可以去除水體中的氨氮、亞硝酸鹽和沉降金屬，凈化水質(zhì)，增加水體溶氧量，能有效地改良養(yǎng)殖水體，提高水生動(dòng)物的整體健康水平，從而減少養(yǎng)殖水體污染導(dǎo)致的魚(yú)類疾病和死亡[6]?？莶菅挎邨U菌通常在消化道和腸道黏膜上定植，使病原菌不能黏附在腸道中，從而減少病原菌。有些益生菌通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)酸，改變腸道內(nèi)環(huán)境的pH，產(chǎn)生一些廣泛的拮抗物質(zhì)和抗生素化合物，抑制病原菌和其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。通過(guò)產(chǎn)生各種化合物激活動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，從而提高對(duì)病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)的抵抗能力[11]?？莶菅挎邨U菌具有廣譜抗菌和抗生物膜活性[16]。

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)氣單胞菌的拮抗作用

2.2.1 體外拮抗 沈智華等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌對(duì)河蟹氣單胞菌致病菌和魚(yú)類細(xì)菌性敗血癥病原菌有抑制作用，但對(duì)甲魚(yú)致病性氣單胞菌無(wú)明顯抑制作用。有研究表明，枯草芽孢桿菌對(duì)溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌都具有一定的抑制作用。但對(duì)于嗜水氣單胞菌只有在枯草芽孢桿菌初始接種濃度高于嗜水氣單胞菌的初始接種濃度時(shí)才能發(fā)揮抑制作用，對(duì)于不同病原菌引發(fā)的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病要挑選不同的治療方案[18]。楊麗莉等[19]的研究表明，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌脂肽可以增加嗜水氣單胞菌的細(xì)胞膜通透性，造成細(xì)菌滲透壓失衡和胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，最終引起細(xì)菌死亡。任雨薇[20]通過(guò)共同培養(yǎng)枯草芽孢菌和嗜水氣單胞菌，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可以抑制嗜水氣單胞菌的多個(gè)毒力基因的表達(dá)，包括氣溶素aer、彈性蛋白酶ahyB、溶血共調(diào)解蛋白hcp、金屬蛋白酶emp以及其他群體感應(yīng)luxS基因表達(dá);此外，還證明當(dāng)luxS表達(dá)下降，嗜水氣單胞菌的毒力因子表達(dá)也下降，可能是由于枯草芽孢桿菌產(chǎn)生了某種化合物能夠干擾嗜水氣單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)。在王娜[21]的研究中，把嗜水氣單胞菌J-1的luxS基因敲除，結(jié)果顯示該菌的毒力基因aer、ahe、emp和hcp等表達(dá)量也出現(xiàn)了下降的現(xiàn)象。體外的拮抗作用是枯草芽孢桿菌的首選篩選方式，不同來(lái)源、不同群落的枯草芽孢桿菌對(duì)氣單胞菌的拮抗效果也不同。

2.2.2 體內(nèi)拮抗 早在1986年Kozasa[22]首次將益生菌用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，因其降低了愛(ài)德華氏菌引起的日本鰻鱺魚(yú)苗死亡，此后益生菌特別是芽孢桿菌受到了水生生物學(xué)家們的注意，在水生動(dòng)物上的研究和應(yīng)用得到了迅速發(fā)展。Kong等[23]研究了口服芽孢桿菌對(duì)嗜水氣單胞菌引起的草魚(yú)腸道黏膜屏障功能損害和炎癥的影響，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌可以保護(hù)腸道絨毛的完整性和緊密的連接結(jié)構(gòu)，減少嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)的腸黏膜屏障功能損壞和炎癥。Tang等[24]通過(guò)在飼料中添加枯草芽孢桿菌并測(cè)定嗜水氣單胞菌對(duì)草魚(yú)的氧化應(yīng)激損傷，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌可以為魚(yú)類提供有效的保護(hù)，使魚(yú)體免受嗜水氣單胞菌感染引起的氧化應(yīng)激損害。Hao等[25]在草魚(yú)日糧中添加了枯草芽孢桿菌，然后對(duì)草魚(yú)腸道中的菌群進(jìn)行16S rDNA基因序列比較，結(jié)果證明枯草芽孢桿菌可以積極改善草魚(yú)腸道內(nèi)微生物群落的組成，這與調(diào)節(jié)草魚(yú)的免疫力有關(guān)，可能會(huì)降低草魚(yú)養(yǎng)殖期間疾病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。Banerjee等[26]評(píng)估了從魚(yú)胃腸道分離的枯草芽孢桿菌LR1的益生菌潛力，包括拮抗活性、酶產(chǎn)生、溶血活性、生物安全性、抗生素敏感性和膽汁耐受水平，結(jié)果顯示LR1對(duì)分歧桿菌和鮭魚(yú)氣單胞菌等致病菌的活性有抑制作用，并且可以有效降低印度主要鯉魚(yú)的細(xì)菌致病性。Newaj等[27]的研究也證明了通過(guò)飼喂從魚(yú)腸獲得的枯草芽孢桿菌可以有效控制魚(yú)致病性氣單胞菌感染。還有研究使用富含枯草芽孢桿菌的鹵蟲(chóng)飼喂觀賞魚(yú)(瑪麗魚(yú))，結(jié)果表明在枯草芽孢桿菌飼養(yǎng)鹵蟲(chóng)濃度為1×105CFU/mL條件下可以改善腸道菌群和對(duì)嗜水氣單胞菌的抗性[28]。展勝[29]通過(guò)對(duì)鯽魚(yú)飼喂含有B.velezensisC-11和S-22的魚(yú)糧2周，空腹1 d后進(jìn)行維氏氣單胞菌攻毒試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)照腸道絨毛發(fā)現(xiàn)飼喂枯草芽孢桿菌的腸道絨毛基本完好無(wú)損，同時(shí)其可刺激鯽魚(yú)機(jī)體免疫，提高鯽魚(yú)的抗病力。大量的試驗(yàn)都證明了枯草芽孢桿菌在漁業(yè)發(fā)展中的諸多益處，如改善水體生態(tài)環(huán)境，提高魚(yú)體免疫力，對(duì)致病菌的拮抗作用等，其能很大程度的提高魚(yú)類存活率，提升魚(yú)類生長(zhǎng)效率，增加經(jīng)濟(jì)效益。

3 展望

枯草芽孢桿菌具有改善水質(zhì)、增加宿主的生長(zhǎng)、改善腸道菌群、對(duì)病原菌的拮抗等優(yōu)良特性，使其作為益生菌在眾多農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者選擇了枯草芽孢桿菌作為生物制劑，但是對(duì)于枯草芽孢桿菌的研究還需要進(jìn)行更加細(xì)致和深入的研究，包括對(duì)病原菌拮抗作用的機(jī)制，枯草芽孢桿菌在魚(yú)腸道的定植機(jī)理，是否與其他益生菌或藥物產(chǎn)生拮抗作用進(jìn)而對(duì)腸道菌群有消極的影響，對(duì)于不同生長(zhǎng)階段魚(yú)類的作用效率以及枯草芽孢桿菌的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及應(yīng)用問(wèn)題等，同時(shí)對(duì)于枯草芽孢桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究也具有巨大的潛力。