酸棗仁皂苷A對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響

陳 霖 ， 陳泉瑛 ， 杜 園 ， 晉坤龍 ， 易小偉 ， 李 妍

(1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院 ， 吉林 吉林 132013 ； 2. 吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 ， 吉林 吉林 132013)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Glioma)簡(jiǎn)稱膠質(zhì)瘤，是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有高侵襲性、易復(fù)發(fā)、高死亡率等特點(diǎn)[1]。臨床上膠質(zhì)瘤以手術(shù)治療為主，并輔以放療、化療及免疫治療。膠質(zhì)瘤手術(shù)全切率低，腫瘤易復(fù)發(fā)，且預(yù)后性差，故成為嚴(yán)重影響人類健康的腫瘤之一[2]。由于化療藥物毒副作用較多，且易產(chǎn)生耐藥性，因此天然藥物活性成分對(duì)抗膠質(zhì)瘤的作用研究成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[3-5]。

酸棗仁皂苷A(Jujuboside A，JuA)是酸棗仁的主要活性成分。近年來(lái)，多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，JuA具有廣泛的藥理作用。除傳統(tǒng)的寧心安神、鎮(zhèn)靜催眠作用外，JuA還具有抗氧化、保護(hù)心肌細(xì)胞、抗缺氧和抗腫瘤等多種藥理作用[6-7]。在以往的試驗(yàn)中，本課題組發(fā)現(xiàn)一定濃度的JuA對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴效應(yīng)。本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了JuA抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 儀器與試劑 MCO-18AIC細(xì)胞培養(yǎng)箱(北京東方安若生化科技有限公司產(chǎn)品)；DL-CJ-IN超凈臺(tái)(蘇州凈化儀器廠生產(chǎn))；MuseTM細(xì)胞分析儀(德國(guó)默克-密理博生物科技有限公司產(chǎn)品)；IX-70型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司產(chǎn)品)。JuA(≥98%，北京索萊寶科技有限公司)；胎牛血清(元亨生物科技有限公司)；1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；AO/EB染料、胰蛋白酶(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) U251細(xì)胞于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100U/mL 鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 JuA的藥物配制 準(zhǔn)確稱取JuA粉末溶于DMSO，配置成33.33 mmol/L的JuA儲(chǔ)存液，濾器過(guò)濾除菌后-20 ℃保存。JuA儲(chǔ)存液與1640培養(yǎng)基稀釋成終濃度分別為10、30 μmol/L和50 μmol/L的JuA工作液。

1.5 MuseTM細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，用胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，以終濃度為0(空白對(duì)照組)、10、30 μmol/L和50 μmol/L的JuA干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。0.25%的胰蛋白酶消化，1.5 mL EP管中每管加入100 μL細(xì)胞及100 μL Annexin V 試劑，輕微震蕩混勻。室溫避光孵育20 min，使用MuseTM細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 Hochest 33258染色觀察U251細(xì)胞核改變 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，接種于24孔板中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度分別為0(空白對(duì)照組)、10、30 μmol/L和50 μmol/L的JuA干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗2遍。各組細(xì)胞滴加Hoechst 33258染色液避光染色5 min，PBS清洗2遍，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 AO/EB染色觀察U251細(xì)胞凋亡 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，接種于無(wú)菌24孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，加入終濃度分別為0(空白對(duì)照組)、10、30 μmol/L和50 μmol/L的JuA進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定10 min。各組加入AO/EB染色液避光染色5 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 MuseTM細(xì)胞分析儀檢測(cè) 如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)10、30 μmol/L和50 μmol/L JuA干預(yù)24 h，U251細(xì)胞凋亡數(shù)目增多，且隨著JuA干預(yù)濃度的增加，凋亡細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞晚期凋亡數(shù)目變化更為明顯。細(xì)胞凋亡趨勢(shì)具有劑量相關(guān)性，隨著藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞總數(shù)逐漸增加(P<0.01)，見圖2。

圖1 MuseTM細(xì)胞分析儀檢測(cè)JuA 對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of JuA on apoptosis of U251 cells as detected by MuseTM cell analyzer A：空白對(duì)照組； B：10 μmol/L JuA組； C：30 μmol/L JuA組； D：50 μmol/L JuA組A：Blank control group; B：10 μmol/L JuA group; C：30 μmol/L JuA group; D：50 μmol/L JuA group

圖2 不同濃度的JuA對(duì)U251細(xì)胞晚期細(xì)胞凋亡率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of JuA on the late apoptosis rate of U251 cells **：與空白對(duì)照組相比，P<0.01；下同**：Compared with the blank control group,P<0.01. The same as below

2.2 Hochest 33258染色觀察 如圖3所示，空白對(duì)照組細(xì)胞核熒光染色均勻，呈淡藍(lán)色熒光，細(xì)胞核較大。與空白對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度的JuA干預(yù)后，Hoechst 33258 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均增加，細(xì)胞核致密濃染，呈亮藍(lán)色熒光，且細(xì)胞核變小濃集，細(xì)胞染色質(zhì)固縮、凝集。細(xì)胞核碎片化和邊緣化等典型凋亡細(xì)胞形態(tài)隨藥物濃度增加而變化顯著。

圖3 Hoechst 33258染色檢測(cè)JuA對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響(200×)Fig.3 Effect of JuA induced apoptosis in U251 cells as revealed by hoechst 33258 staining (200×)A：空白對(duì)照組； B：10 μmol/L JuA組； C：30 μmol/L JuA組； D：50 μmol/L JuA組A：Blank control group; B：10 μmol/L JuA group; C：30 μmol/L JuA group; D：50 μmol/L JuA group

2.3 AO/EB雙染觀察各組細(xì)胞凋亡水平 如圖4所示，空白對(duì)照組絕大多數(shù)細(xì)胞核呈現(xiàn)圓形或者橢圓形的亮綠色熒光。與空白對(duì)照組相比，不同濃度JuA干預(yù)后，橙紅色細(xì)胞核所占比例明顯增大。與空白對(duì)照組比較，JuA干預(yù)組細(xì)胞核形狀差異較大，橙紅色細(xì)胞核斑塊、碎片較多。且隨著藥物濃度的增加，上述改變?cè)郊用黠@(P<0.01)，見圖5。

圖4 AO/EB染色檢測(cè)JuA對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響(200×)Fig.4 Effect of JuA induced apoptosis in U251 cells as revealed by AO/EB staining (200×)A：空白對(duì)照組； B：10 μmol/L JuA組； C：30 μmol/L JuA組； D：50 μmol/L JuA組A：Blank control group; B：10 μmol/L JuA group; C：30 μmol/L JuA group; D：50 μmol/L JuA group

圖5 不同濃度的JuA對(duì)U251細(xì)胞凋亡率的影響Fig.5 Effects of different concentrations of JuA on apoptosis rate of U251 cells

3 討論

1978年，日本學(xué)者Otsuka 等從酸棗仁中分離得到JuA[8]，JuA屬于四環(huán)三萜類皂苷，是酸棗仁中含量最高的一種皂苷類成分[9]。近年來(lái)，對(duì)JuA藥理作用及相關(guān)機(jī)制的研究逐漸增多。研究表明，JuA可在體外引起肺癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，JuA能夠通過(guò)直接作用于細(xì)胞膜表面的Fat 4蛋白，進(jìn)而活化HIPPO通路，降低下游靶點(diǎn)蛋白YAP的表達(dá)，下調(diào)腫瘤增殖和抗凋亡基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。但JuA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤中的作用未見報(bào)道。本課題組前期試驗(yàn)證實(shí)，JuA可抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖，提示JuA可能在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中發(fā)揮潛在的作用。

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，是一種自然現(xiàn)象，存在于多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和死亡等過(guò)程中。細(xì)胞通過(guò)啟動(dòng)凋亡程序，能夠及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)的損傷或突變細(xì)胞，以維持組織器官和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[11]。細(xì)胞凋亡過(guò)程不可逆轉(zhuǎn)，凋亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變化主要表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)凝固、DNA斷裂、凋亡小體形成等，而分子水平則涉及諸多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變[12]。腫瘤細(xì)胞的特征之一是缺乏程序性的細(xì)胞死亡過(guò)程。Hickman等于1992年首次提出可以將誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作為腫瘤治療研究的主要目標(biāo)和手段[13]。隨后誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為腫瘤治療研究的新方向。

本試驗(yàn)首先通過(guò)MuseTM細(xì)胞分析儀檢測(cè)，確定了JuA預(yù)處理可引起U251膠質(zhì)瘤凋亡細(xì)胞數(shù)增加，并證實(shí)JuA引起的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡具有濃度依賴效應(yīng)，即JuA濃度越高，對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用越明顯；進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，JuA可引起U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；Hoechest 33258和AO/EB染色結(jié)果均顯示，JuA處理的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞核發(fā)生凝固、濃縮、邊集和碎片化等典型細(xì)胞凋亡改變。上述試驗(yàn)結(jié)果均提示，JuA抑制U251細(xì)胞增殖的機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的，但是，JuA引起U251細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。