河南許昌地區(qū)規(guī)模化肉雞場滑液囊支原體的分離鑒定及耐藥性檢測

李水德

(許昌市建安區(qū)職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校 ， 河南 許昌 461143)

支原體主要感染禽類及哺乳動(dòng)物的呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，還可引發(fā)關(guān)節(jié)炎、乳腺炎和眼炎等[1]。國內(nèi)相關(guān)研究顯示，危害禽類的支原體有28種，臨床以雞毒支原體、雞滑液囊支原體和火雞支原體3種較為常見，尤其是雞滑液囊支原體和雞毒支原體感染最為嚴(yán)重，其對種雞感染率可達(dá)50%以上，支原體感染先后在加拿大、英國、挪威、德國、法國、南非等國家報(bào)道，呈世界性分布，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。國外研究表明，雞滑液囊支原體和雞毒支原體對肉種雞危害較嚴(yán)重，尤其雞滑液囊支原體感染率可達(dá)20%以上，主要防控措施以凈化為主[4]。雞滑液囊支原體病以關(guān)節(jié)腫大、滑液囊、肌腱炎及實(shí)質(zhì)器官的腫大為主要特征，病雞和隱性感染雞群是主要傳染源，該病一旦在雞群中感染可引發(fā)一系列疾病，導(dǎo)致雛雞生長遲緩，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)量下降，且易與其他病原體混合感染，很難根除，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。臨床中支原體主要通過抗生素防控，隨著抗生素的使用，其耐藥性越來越嚴(yán)重，耐藥菌株逐漸增多，嚴(yán)重影響其治療效果[7]。本試驗(yàn)主要對許昌地區(qū)規(guī)?；怆u場滑液囊支原體感染情況進(jìn)行檢測，并分析其耐藥性，為該地區(qū)的肉雞場雞滑液囊支原體臨床合理用藥及防控提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2018—2019年，采集許昌地區(qū)規(guī)?；怆u場疑似滑液囊支原體感染的病料組織179份。

1.2 主要試劑 PPLO液體培養(yǎng)基、改良Frey液體培養(yǎng)基、改良Frey固體培養(yǎng)，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；抗支原體類抗菌藥的藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司；DL 2 000 Marker、2×TaqMaster Mix，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離與培養(yǎng) 取疑似雞滑液囊支原體感染的關(guān)節(jié)液病料組織，經(jīng)過處理后接種于Frey液體培養(yǎng)基內(nèi)密封，37 ℃恒溫培養(yǎng)36～44 h，每日觀察2～3次，待顏色變黃后過濾，傳代4次后，將其接種于改良Frey固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d，肉眼觀察直到出現(xiàn)中央凸起呈荷包蛋樣的典型支原體菌落，姬姆薩染色觀察其形態(tài)學(xué)。

1.3.2 菌株DNA基因組提取 取中央凸起呈荷包蛋樣的典型支原體菌落的菌株，按照DNA提取試劑盒說明書提取其菌株的DNA基因組，-20 ℃保存。

1.3.3 菌株P(guān)CR鑒定 參考文獻(xiàn)[8]報(bào)道的雞滑液囊支原體鑒定引物，根據(jù)GenBank中登錄的雞滑液囊支原體基因全序列，設(shè)計(jì)vlhA基因鑒定引物：5′-CACCGCCATTGCTCCTGTTATA-3′，5′-GGGTAGT-CCACTCGCACCTCTCGCATT-3′，目的片段大小為773 bp，引物由華大基因科技研究公司合成。以提取的菌株DNA基因組為模板，進(jìn)行PCR鑒定，挑取鑒定陽性菌株用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，送華大基因進(jìn)行測序，其測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站下載參考株的基因序列用BLAST軟件進(jìn)行同源性比對。

1.3.4 藥敏試驗(yàn) 將分離菌株接種于PPLO液體培養(yǎng)基中，均勻涂布在PPLO固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基貼6種抗菌藥紙片，每種抗菌藥3個(gè)重復(fù)，取平均值。參照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷，分析其耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng) 疑似雞滑液囊支原體在改良Frey固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d時(shí)，出現(xiàn)光滑、透明、圓形、似露珠狀的菌落，呈現(xiàn)典型的“煎蛋樣”菌落(圖1)；通過吉姆薩染色油鏡下可見卵圓形、彎曲的絲狀、螺旋狀等多形態(tài)菌株(圖2)，與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中支原體培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)基本一致。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)87株菌株初步鑒定為支原體。

圖1 菌株的“煎蛋樣”菌落Fig.1 “Fried egg like” colonies of the strain

圖2 顯微鏡下的菌株形態(tài)(1 000×)Fig.2 Microscopic morphology of the strain(1 000×)

2.2 PCR鑒定 對初步鑒定的87株支原體，用雞滑液囊支原體vlhA基因鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，87株支原體均擴(kuò)增出大小約為773 bp的目的條帶(圖3)，其測序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行同源性比對，分離的87株雞滑液囊支原體與GenBank中登錄的參考株同源性介于97.9%～99.7%。

圖3 雞滑液囊支原體分離株的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification results of Mycoplasma synovialis stainsM:DL-2 000 marker； 1～5:分離菌株； 6:空白對照M：DL-2 000 marker; 1-5:Isolated strains; 6:Blank control

2.3 耐藥性分析 用K-B藥敏紙片法對分離的87株雞滑液囊支原體進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，分析其耐藥性。結(jié)果如表1所示，分離的87株雞滑液囊支原體對臨床中不同的抗菌藥均產(chǎn)生耐藥性，對金霉素、土霉素、吉他霉素、替米考星、多西環(huán)素、泰樂菌素和林可霉素耐藥率分別為98.8%、94.3%、90.7%、78.2%、61.5%、58.8%和57.7%，對阿奇霉素、泰妙菌素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星5種抗菌藥耐藥率較低，耐藥率介于10.3%～17.9%。

表1 87株雞滑囊支原體的耐藥試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Drug resistance test results of 87 Mycoplasma synovialis strains

臨床中分離的87株雞滑液囊支原體呈現(xiàn)多重耐藥性，耐12種抗菌藥有2株、耐11、3種抗菌藥各有4株、耐10種抗菌藥有5株、耐9、4種抗菌藥各有7株、耐5種抗菌藥有12株，其中耐8、7、6種抗菌藥分離菌株最多，分別占分離菌株的16.1%、17.2%和19.5%(圖4)。

圖4 多重耐藥性檢測結(jié)果Fig.4 Results of multidrug resistance test

3 討論

雞滑液囊支原體可以引起不同階段的雞和火雞發(fā)生傳染性滑膜炎、呼吸系統(tǒng)、全身性疾病及自身免疫性疾病等一系列疾病，呈世界性流行[8-9]。雞滑液囊支原體發(fā)病無明顯的季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，以冬春季節(jié)易發(fā)，可以感染各種日齡雞，該病可以水平傳播也可以垂直傳播，尤其是種雞通過卵傳播給子代，在種雞感染初期經(jīng)卵傳播率較高，不同菌株具有不同的致病力，且在雞群中長期存在[10-11]。招麗嬋等[3]報(bào)道從廣東、廣西、江蘇、浙江、福建等10個(gè)不同地區(qū)養(yǎng)殖場中分離到96 株雞滑液囊支原體田間流行株。王昆等[7]從山東濰坊市某養(yǎng)雞場分離得到雞滑液囊支原體。說明該支原體在全國雞場廣泛流行。規(guī)?；B(yǎng)殖場中該支原體廣泛流行主要是由于防控措施不健全、生物安全的漏洞等，不注重該病原體的凈化，是導(dǎo)致其流行的主要原因之一。本試驗(yàn)從許昌地區(qū)規(guī)?；怆u場采集疑似雞滑液囊支原體感染的179份病料組織中分離得到87株雞滑液囊支原體，說明該地區(qū)雞滑液囊支原體感染嚴(yán)重，應(yīng)該注意其防控與凈化。

由于該病疫苗效果不太理想，臨床中主要用抗生素進(jìn)行防控，由于抗生素的不合理使用，導(dǎo)致其耐藥菌株出現(xiàn)，給該病的防治帶來了一定的困難[12]。當(dāng)發(fā)生雞滑液囊支原體感染時(shí)應(yīng)該進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇敏感藥物合理使用，提高治療效果，同時(shí)配合消毒。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的雞滑液囊支原體對臨床中常用抗菌藥均出現(xiàn)嚴(yán)重耐藥性，應(yīng)該引起重視。本試驗(yàn)結(jié)果與隋兆峰等[12]、石曉磊等[13]報(bào)道的雞滑液囊支原體耐藥性存在一定差異性，可能與地區(qū)及使用抗菌藥的種類有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果為許昌地區(qū)規(guī)?；怆u場滑液囊支原體的防控提供了參考依據(jù)。