正常和腹瀉水貂腸道微生物16S rRNA測(cè)序差異性分析

任建煒 ， 徐 航 ， 莊桂玉 ， 溫建新

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109 ； 2.青島西海岸新區(qū)農(nóng)村農(nóng)業(yè)局 ， 山東 青島 266400)

引起水貂腹瀉的因素有很多，常存在混合感染致病的情況，主要分為病原性腹瀉和非病原性腹瀉，其中病原性腹瀉包括病毒性腹瀉、細(xì)菌性腹瀉和寄生蟲(chóng)性腹瀉等[1]。腹瀉的發(fā)生沒(méi)有明顯的季節(jié)性，溫度、飲食、用藥及免疫等很多方面都能引起水貂腹瀉，養(yǎng)殖戶在確診前的用藥對(duì)疾病的控制有重要影響[2]，如不清楚病因時(shí)盲目用藥，可能會(huì)加重病情，因此需要對(duì)腹瀉的原因進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定和診斷[3]，如采用腸桿菌基因間重復(fù)共有序列PCR(Enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR,ERIC-PCR)技術(shù)可以分析出毛皮動(dòng)物腸道內(nèi)的益生菌和有害菌菌種[4]。在各種因素的作用下，不同個(gè)體腸道內(nèi)正常菌群的種類、數(shù)量和分布是不固定的、變化的[5]。因抗藥、耐藥性的細(xì)菌不斷產(chǎn)生，以及超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，使毛皮動(dòng)物腸道疾病多發(fā)，且多出現(xiàn)混合感染的情況[6]。本試驗(yàn)將對(duì)青島西海岸某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)中的腹瀉水貂和正常水貂的糞便進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，并通過(guò)分類操作單元(Operational taxonomic units,OTU)分析對(duì)正常水貂和腹瀉水貂糞便中菌群的物種分布和物種豐度聚類進(jìn)行分析，從而得出腹瀉水貂與正常水貂腸道微生物的物種分布、結(jié)構(gòu)以及物種豐度聚類的差異,可以準(zhǔn)確得出腹瀉水貂腸道內(nèi)菌群的分布、種類和豐度，對(duì)腹瀉進(jìn)行進(jìn)一步診斷，并采取措施使機(jī)體體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境恢復(fù)正常狀態(tài)，達(dá)到治療腹瀉的目的。

1 材料與方法

1.1 材料 于青島西海岸新區(qū)某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)隨機(jī)采集同一養(yǎng)殖場(chǎng)、同一時(shí)間正常水貂和腹瀉水貂糞便。

1.2 方法 將隨機(jī)采集的糞便進(jìn)行樣本合并后稀釋并進(jìn)行分組，每組3個(gè)重復(fù)，分別為正常組(NM-1、NM-3、NM-5)和腹瀉組(DM-1、DM-3、DM-4)。所有樣品送至安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 物種分布

2.1.1 門(mén)水平分布 6個(gè)樣品共得到2個(gè)門(mén)，分別為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)，見(jiàn)表1。腹瀉組中厚壁菌門(mén)分別占比83.00%、58.00%和88.00%，高于正常組，差異顯著(P<0.05)；腹瀉組中變形菌門(mén)分別占比17.00%、42.00%和12.00%，低于正常組，差異顯著(P<0.05)。與正常組腸道菌群相比，腹瀉組的優(yōu)勢(shì)菌群是厚壁菌門(mén)，正常組中的優(yōu)勢(shì)菌群是變形菌門(mén)。

2.1.2 綱水平分布 6個(gè)樣品共得到3個(gè)綱，分別為芽孢桿菌綱(Bacilli)、梭菌綱 (Clostridia)和丙型變形菌綱(Gamma proteobacteria)，見(jiàn)表1。腹瀉組中芽孢桿菌綱分別占比12.00%、1.50%和13.20%，與正常組相比差異不顯著(P>0.05)；梭菌綱僅在腹瀉組中檢測(cè)出，分別占比 60.00%、58.50%和74.80%，明顯高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中丙型變形菌綱分別占比28.00%、40.00%和12.00%，低于正常組，差異顯著(P<0.05)。與正常組腸道菌群相比，腹瀉組優(yōu)勢(shì)菌群是梭菌綱，正常組優(yōu)勢(shì)菌群是丙型變形菌綱。

表1 細(xì)菌門(mén)水平和綱水平分布分析Table 1 Analysis of the distribution of bacterial phylum and class level (%)

2.1.3 目水平分布 6個(gè)樣品共得到5個(gè)目，其中比例較高的4個(gè)目分別為乳桿菌目(Lactobacillales)、梭菌目(Clostridiales)、巴氏桿菌目(Pasteurellales)和腸桿菌目(Enterobacteriales)，見(jiàn)表2。梭菌目和巴氏桿菌目?jī)H在腹瀉組中檢測(cè)出，梭菌目占比60.00%、58.50%和74.80%，巴氏桿菌目占比3.55%、35.50%和4.87%，2個(gè)菌目均明顯高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中乳桿菌目分別占比12.50%、2.00%和10.18%，與正常組相比差異不顯著(P>0.05)；腹瀉組中腸桿菌目分別占比23.95%、4.00%和10.15%，明顯低于正常組，差異極顯著(P<0.01)。與正常組腸道菌群相比，腹瀉組優(yōu)勢(shì)菌群是梭菌目和巴氏桿菌目，正常組優(yōu)勢(shì)菌群是腸桿菌目。

表2 細(xì)菌目水平分布分析Table 2 Analysis of the distribution of bacterial order level (%)

2.1.4 科水平分布 6個(gè)樣品共得到6個(gè)科，其中比例較高的5個(gè)科分別為腸球菌科(Enterococcaceae)、巴氏桿菌科(Pasteurllaceae)、鏈球菌科(Stretococcaceae)、梭菌科(Clostridlaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，見(jiàn)表3。巴氏桿菌科、鏈球菌科和梭菌科僅在腹瀉組中檢測(cè)出，巴氏桿菌科占比 3.55%、35.50%和4.87%，鏈球菌科占比12.50%、2.00%和10.18%，梭菌科占比60.00%、58.50%和74.80%，3個(gè)菌科均明顯高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中腸球菌科占比為0，腸桿菌科分別占比23.95%、4.00%和10.15%，2個(gè)菌科均明顯低于正常組，差異極顯著(P<0.01)。與正常組腸道菌群相比，腹瀉組優(yōu)勢(shì)菌群是梭菌科、鏈球菌科、巴氏桿菌科，正常組優(yōu)勢(shì)菌群是腸球菌科、腸桿菌科。

表3 細(xì)菌科水平分布分析Table 3 Analysis of the distribution of bacterial family level (%)

2.1.5 屬水平分布 6個(gè)樣品共得到7個(gè)屬，其中比例較高的6個(gè)屬分別為巴氏桿菌屬(Pasteurella)、腸球菌屬(Enterococcus)、放線桿菌屬(Actinobacllus)、沙雷菌屬(Serratia)、鏈球菌屬(StrePtococcus)和梭菌屬(Clostridllus)，見(jiàn)表4。巴氏桿菌屬、放線桿菌屬、鏈球菌屬和梭菌屬僅在腹瀉組中檢測(cè)出，巴氏桿菌屬分別占比3.00%、0和0，放線桿菌屬分別占比0、32.00%和0，鏈球菌屬分別占比12.28%、2.00%和12.00%，梭菌屬分別占比60.00%、58.50%和74.80%，4個(gè)菌屬均明顯高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中腸球菌屬占比為0，明顯低于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中沙雷菌屬占比為0，明顯低于正常組，差異極顯著(P<0.01)。與正常組腸道菌群相比，腹瀉組優(yōu)勢(shì)菌群是巴氏桿菌屬、放線桿菌屬、鏈球菌屬、梭菌屬，正常組優(yōu)勢(shì)菌群是腸球菌屬、沙雷菌屬。

表4 細(xì)菌屬水平分布分析Table 4 Analysis of the distribution of bacterial genus level (%)

2.2 物種豐度聚類

2.2.1 目水平物種豐度聚類 經(jīng)過(guò)測(cè)序，選取主要豐度的菌目和其在每個(gè)樣品中的豐度信息，并進(jìn)行聚類，見(jiàn)表5。腹瀉組DM-3巴氏桿菌目豐度Z值為2，遠(yuǎn)高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組梭菌目豐度Z值分別為0.5、0.5和1.5，遠(yuǎn)高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中腸桿菌目的豐度Z值均低于腹瀉組，差異極顯著(P<0.01)；乳桿菌目豐度在2個(gè)組之間差異不顯著(P>0.05)。與正常組相比，腹瀉組中梭菌目和巴氏桿菌目豐度相對(duì)增加，腸桿菌目在腹瀉組豐度相對(duì)減少，乳桿菌目豐度并未產(chǎn)生明顯差異變化。

表5 細(xì)菌目水平豐度分析Table 5 Abundance analysis of bacterial order level (Z)

2.2.2 科水平物種豐度聚類 經(jīng)過(guò)對(duì)6個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序，科水平豐度見(jiàn)表6。腹瀉組中巴氏桿菌科豐度Z值分別為0.0、2.0和-0.5，梭菌科豐度Z值分別為0.5、0.5和1.0，鏈球菌科豐度Z值分別為1.5、-0.5和1.0，3個(gè)菌科豐度均遠(yuǎn)高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中腸桿菌科豐度Z值分別為-0.5、-1.0和-1.0，腸球菌科豐度Z值為-0.5、2.0和0.0，2個(gè)菌科豐度均低于正常組，且差異極顯著(P<0.01)。與正常組相比，腹瀉組中梭菌科、巴氏桿菌科、鏈球菌科豐度相對(duì)增加，腸桿菌科、腸球菌科豐度相對(duì)減少。

表6 細(xì)菌科水平豐度分析Table 6 Abundance analysis of bacterial family level (Z)

2.2.3 屬水平物種豐度聚類分析 屬水平豐度分析見(jiàn)表7。腹瀉組中巴氏桿菌屬豐度Z值分別為2.0、-0.5和-0.5，梭菌屬豐度Z值分別為2.0、0.0和-0.5，鏈球菌屬豐度Z值分別為1.5、-0.5和1.0，放線桿菌屬豐度Z值分別為-0.5、-0.5和2.0，4個(gè)菌屬豐度均遠(yuǎn)高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中腸球菌屬豐度Z值均為-0.5，沙雷氏菌屬豐度Z值均為-0.5，2個(gè)菌屬豐度均低于正常組，差異極顯著(P<0.01)。與正常組相比，腹瀉組中梭菌屬、巴氏桿菌屬、鏈球菌屬和放線桿菌屬豐度相對(duì)增加，腸球菌屬、沙雷菌屬豐度相對(duì)減少。

表7 細(xì)菌屬水平豐度分析Table 7 Abundance analysis of bacterial genus level (Z)

3 討論

腸道內(nèi)的致病菌增多是導(dǎo)致水貂腹瀉的主要原因之一。目前，大多數(shù)研究表明，腸道內(nèi)的單一致病菌感染或多種致病菌混合感染均可導(dǎo)致水貂腹瀉，于杰等[7]從死亡水貂中分離鑒定出綠色氣球菌(Greenballoonfungus)、大腸埃希菌、副傷寒沙門(mén)菌(Salmonellaparatyphi)和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)等細(xì)菌均可導(dǎo)致水貂細(xì)菌性疾病。葛俊偉等[8]首次報(bào)道了對(duì)水貂源致病性糞腸球菌的分離和鑒定。腸球菌是人和動(dòng)物體內(nèi)正常菌群之一，也是機(jī)會(huì)致病菌，可引起尿路感染、化膿性腹部感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎和腹瀉、發(fā)燒等多種疾病[9]。鄒積振等[10]從腹瀉水貂的臨床病例中分離出的魏氏梭菌、志賀氏菌(Shigella)[11]、沙門(mén)菌[12]、巴氏桿菌[13]也是引起水貂腹瀉的病原。王貴升[14]在對(duì)水貂腹瀉病的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致水貂腹瀉病的細(xì)菌病中大腸埃希菌感染的發(fā)病率最高。

根據(jù)已報(bào)道的研究并結(jié)合本試驗(yàn)的結(jié)果分析，腹瀉水貂腸道微生物在綱水平上梭菌綱占比顯著增加；在目水平上梭菌目、巴氏桿菌目占比及相對(duì)豐度均顯著增加，并且乳桿菌目和腸桿菌目占比及相對(duì)豐度相對(duì)減少；在科水平上梭菌科、巴氏桿菌科、鏈球菌科占比及相對(duì)豐度顯著增加，腸球菌科、腸桿菌科占比及相對(duì)豐度相對(duì)減少；在屬水平上梭菌屬、巴氏桿菌屬、鏈球菌屬、放線桿菌屬占比及相對(duì)豐度顯著增加，腸球菌屬、沙雷菌屬占比及相對(duì)豐度相對(duì)減少。因此，可以對(duì)本試驗(yàn)的水貂腹瀉做出初步診斷，根據(jù)在屬水平所檢測(cè)出的菌群及其占比和相對(duì)豐度情況，可以得出導(dǎo)致水貂腹瀉的原因之一為梭菌屬、巴氏桿菌屬、鏈球菌屬、放線桿菌屬等多種致病菌群增多而引起混合的感染。

目前已知的水貂腸道細(xì)菌性疾病原因比較復(fù)雜，在預(yù)防和治療的過(guò)程中困難重重[15]。因此，在了解腹瀉水貂腸道內(nèi)菌種的分布和結(jié)構(gòu)后，對(duì)腸道疾病的診斷有很大幫助。微生態(tài)制劑在養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用可以有效調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體腸道微生態(tài)和微生物的分布、數(shù)量及種類，以維持腸道內(nèi)菌群的動(dòng)態(tài)平衡，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的效果。