吉林省牛瑟氏泰勒蟲病分子流行病學(xué)調(diào)查

閔鵬飛 ， 宋建臣 ， 許應(yīng)天 ， 王 浩 ， 楊冰祎 ， 千慧燕 ， 張 爽 ， 賈立軍

(1.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心 延邊大學(xué) ， 吉林 延吉 133002 ； 2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ， 吉林 延吉 133002)

牛瑟氏泰勒蟲病是由瑟氏泰勒蟲(Theileriasergenti，T.sergenti)引起的一種通過蜱作為中間宿主傳播的血液原蟲病。其主要在牛體內(nèi)的紅細(xì)胞中寄生?？潞帐紫仍诜侵捱_(dá)累斯薩拉姆的牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)泰勒蟲[1]；隨后泰勒也發(fā)現(xiàn)了這種蟲體，并將其歸類為一種小梨形蟲[2]；貝坦科爾特等根據(jù)形態(tài)學(xué)上的差別，建議將泰勒蟲分為梨形蟲屬和泰勒屬2個屬[3]。牛瑟氏泰勒蟲病首次于俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)被發(fā)現(xiàn)[4]。自泰勒蟲發(fā)現(xiàn)以來，世界各地便陸續(xù)報道該病。近年來，東亞、南亞、歐洲、北美洲等地均有關(guān)于泰勒蟲感染的報道[5-7]。我國于1983年報道在貴州首次發(fā)現(xiàn)瑟氏泰勒蟲[8]。瑟氏泰勒蟲病的流行與蜱的活動區(qū)域、流行狀況密切相關(guān)。該病呈明顯的季節(jié)性與地區(qū)性流行，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失與潛在威脅。

牛瑟氏泰勒蟲病對牛的危害極其巨大，通過系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查，及時掌握瑟氏泰勒蟲在動物中的流行現(xiàn)狀，對瑟氏泰勒蟲病的有效防控具有重要意義。本調(diào)查應(yīng)用PCR方法對吉林省琿春、通化、安圖、舒蘭、龍井、遼源、白山共7個地區(qū)的247份?？鼓M(jìn)行檢測，旨在為防控牛瑟氏泰勒蟲病提供有效的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 247份血液樣本采自吉林省琿春、通化、安圖、舒蘭、龍井、遼源、白山共7個地區(qū)的養(yǎng)牛場，均為無菌采集抗凝血。

1.2 試劑 FastPure Blood DNA Isolation Mini Kit 試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；dNTP Mix、TaqDNA Polymerase、10×TaqBuffer、DL 2 000 DNA Marker等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物的合成 根據(jù)牛瑟氏泰勒蟲18S rRNA基因序列，參照Cao等[9]方法設(shè)計PCR引物，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成(表1)。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table1 PCR amplification primer

1.4 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 血液基因組DNA按照血液基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。應(yīng)用牛瑟氏泰勒蟲18S rRNA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及條件按照胡詩悅等[10]的方法進(jìn)行。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳完畢后將膠塊置于凝膠成像儀中進(jìn)行觀察。

1.5 克隆載體的構(gòu)建及測序 利用OMEGA凝膠回收試劑盒對目的基因片段進(jìn)行膠回收，將膠回收產(chǎn)物連接于pMD18-T載體，連接體系：膠回收產(chǎn)物4 μL，Solution 15 μL，pMD18-T載體1 μL。低溫恒溫水浴鍋設(shè)定溫度16 ℃，將混合物放置水浴鍋中12～14 h后得到連接產(chǎn)物。將連接后的產(chǎn)物于Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于AMP抗性平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。用挑菌環(huán)挑取生長良好的單個菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定結(jié)果為陽性的菌落放入AMP培養(yǎng)液中搖菌擴(kuò)增。使用OMEGA的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，提取完畢的質(zhì)粒分成2份，1份放入-20 ℃冰箱保存以備后續(xù)使用，1份送往長春生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.6 統(tǒng)計分析 測序結(jié)果利用NCBI BLAST進(jìn)行比對，采用MegAlign軟件進(jìn)行基因同源性分析。并對檢測的247份樣本進(jìn)行不同地區(qū)、不同飼養(yǎng)模式、不同性別及不同年齡之間的比較，以及感染牛瑟氏泰勒蟲情況進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 牛瑟氏泰勒蟲18S rRNA基因PCR檢測 牛血液基因組樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得435 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。PCR共檢測出陽性樣本98份。將擴(kuò)增得到的目的基因經(jīng)轉(zhuǎn)化克隆后送往公司測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI BLAST同源性比對，98份測序樣本均與瑟氏泰勒蟲18S rRNA基因相符(GenBank登錄號：MH208641.1)。

圖1 部分牛血液樣本PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products from some bovine blood samplesM:DL 2 000 DNA 標(biāo)準(zhǔn); 1～9:牛血液樣本; 10:陽性對照; 11:陰性對照M:DL 2 000 DNA marker; 1-9:Bovine blood samples; 10:Positive control; 11:Negative control

2.2 擴(kuò)增基因進(jìn)化分析 采用MegAlign對擴(kuò)增泰勒蟲18S rRNA基因進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(圖2、3)。擴(kuò)增蟲株18S rRNA-Theileria-cow與BDH3擴(kuò)增蟲株(GenBank登錄號：MF576178.1)處于同一分支，同源性為100%。與中國湖北擴(kuò)增蟲株、西班牙擴(kuò)增蟲株、印度擴(kuò)增蟲株的同源性為99.80%，說明擴(kuò)增蟲株與目前流行的蟲株具有普遍同源性。

圖2 不同蟲株間18S rRNA基因同源性比對Fig.2 Homology of 18S rRNA gene among different insect strains▲：本次試驗(yàn)所得分離株▲：The isolates obtained in this test

圖3 不同蟲株間18S rRNA基因序列進(jìn)化樹Fig.3 Evolutionary tree of 18S rRNA gene sequences among different insect strains▲：本次試驗(yàn)所得分離株▲：The isolates obtained in this test

2.3 不同地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲感染情況 對采自吉林省7個不同地區(qū)的共247份血液樣本進(jìn)行PCR檢測。各地牛瑟氏泰勒蟲感染情況見表2。結(jié)果顯示，吉林省7個地區(qū)的牛群均存在瑟氏泰勒蟲感染。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，除安圖和白山地區(qū)間差異不顯著(P>0.05)外，其他各地區(qū)間均差異顯著(P<0.05)。

表2 不同地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲感染情況Table 2 Theileria sergenti infection in different regions

2.4 不同養(yǎng)殖模式下牛瑟氏泰勒蟲感染情況 對PCR檢測的247份牛血液樣本，分析不同養(yǎng)殖模式對牛瑟氏泰勒蟲感染率的影響。結(jié)果顯示，規(guī)?；B(yǎng)殖和散養(yǎng)條件下均有瑟氏泰勒蟲感染(表3)，散養(yǎng)模式下的牛更易感染瑟氏泰勒蟲，統(tǒng)計學(xué)分析表明，不同養(yǎng)殖模式下牛瑟氏泰勒蟲感染率差異極顯著(P<0.01)。

表3 不同養(yǎng)殖模式牛瑟氏泰勒蟲感染情況Table 3 Theileria sergenti infection in different feeding patterns

2.5 不同性別間牛瑟氏泰勒蟲感染情況 對PCR檢測的247份牛血液樣本，分析牛瑟氏泰勒蟲在不同性別間的流行情況，結(jié)果顯示，不同性別牛均有瑟氏泰勒蟲感染(表4)，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同性別牛瑟氏泰勒蟲感染情況Table 4 Theileria sergenti infection in different sexes

2.6 不同年齡段間牛瑟氏泰勒蟲感染情況 對PCR檢測的247份牛血液樣本，分析不同年齡段牛瑟氏泰勒蟲的感染率。結(jié)果顯示，不同年齡段的牛均有瑟氏泰勒蟲感染(表5)，年齡越小的牛越容易感染，統(tǒng)計學(xué)分析表明，不同年齡段間牛瑟氏泰勒蟲感染率差異顯著(P<0.05)。

表5 不同年齡牛瑟氏泰勒蟲感染情況Table 5 Theileria sergenti infection in different ages

3 討論

泰勒蟲病雖不是人獸共患病，但其對我國牛、羊等反芻動物養(yǎng)殖業(yè)造成的影響嚴(yán)重。調(diào)查顯示，吉林延邊地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲PCR陽性率為39.10%[11]；山東牛瑟氏泰勒蟲血涂片陽性率為15.40%[12]；江西高安地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲PCR平均陽性率為28.30%[13]；甘肅牦牛瑟氏泰勒蟲血清平均陽性率為73.99%[14]。另據(jù)相關(guān)研究報道，由于攜帶寄生蟲的個體會在很長一段時間中處于低水平的寄生蟲血癥，這時很難用顯微鏡觀察到蟲體，所以利用分子生物學(xué)方法檢測泰勒蟲比血涂片法和血清學(xué)方法具有更高的特異性和靈敏性[15]。本調(diào)查利用PCR法對采自琿春、通化、安圖、舒蘭、龍井、遼源、白山共7個地區(qū)的247份牛血液進(jìn)行檢測，以期了解牛瑟氏泰勒蟲的流行現(xiàn)狀。PCR檢測結(jié)果顯示，247份血液樣本檢測出陽性98份，總體陽性率為39.68%。測序結(jié)果顯示，所有陽性樣本均為瑟氏泰勒蟲感染。不同地區(qū)間牛瑟氏泰勒蟲感染率差異顯著(P<0.05)，其中通化地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲陽性率最高為70.00%，最低為龍井地區(qū)20.00%，出現(xiàn)差異的原因可能與樣本采集地區(qū)的環(huán)境和采樣地附近的蜱蟲種類相關(guān)；不同性別間牛瑟氏泰勒蟲感染率差異不顯著(P>0.05)；不同養(yǎng)殖模式下牛瑟氏泰勒蟲感染率差異極顯著(P<0.01)，散養(yǎng)模式下的牛更易感染，可能與散養(yǎng)模式下管理松散，牛群更易接觸蜱蟲等因素有關(guān)；不同年齡段下牛瑟氏泰勒蟲感染率差異顯著(P<0.05)，1歲以內(nèi)陽性率(56.67%)明顯比3歲以上陽性率(26.80%)高，出現(xiàn)這種情況的原因可能與牛自身的抵抗力和養(yǎng)殖模式相關(guān)。

本調(diào)查與胡詩悅等[10]2013年調(diào)查的感染率(53.4%)有所降低，這與養(yǎng)殖場近年來對該病的重視程度和防控力度的加大有關(guān)。本調(diào)查證實(shí)吉林省境內(nèi)牛瑟氏泰勒蟲感染依然普遍存在，尤其是琿春、通化地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲病依然處于高發(fā)狀態(tài)。蜱蟲是泰勒蟲的主要傳播媒介，建議養(yǎng)殖企業(yè)要加強(qiáng)平時的飼養(yǎng)管理，尤其在蜱蟲流行的地區(qū)要實(shí)施科學(xué)防蜱、滅蜱，提高環(huán)境衛(wèi)生，從傳染源頭杜絕牛瑟氏泰勒蟲病的發(fā)生[16-17]。本調(diào)查為牛瑟氏泰勒蟲病的有效防控提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，對牛瑟氏泰勒蟲的研究具有積極意義。