柚皮素對急性肺損傷小鼠保護(hù)作用的機(jī)制研究

陳倩倩 王榮麗

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是一種危及生命的臨床綜合征，其特征是肺泡上皮損傷和肺水腫液大量聚集引起的呼吸衰竭和頑固性低氧血癥[1]。有效清除肺水腫液可以改善氧合功能并縮短機(jī)械通氣時(shí)間[2]。血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶1(SGK1)參與Na+主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)及肺水腫液的清除[3]。Na+通過鈉通道(ENaC)進(jìn)入肺泡上皮細(xì)胞，進(jìn)而被鈉鉀泵(Na+-K+-ATPase)泵出，由此產(chǎn)生的滲透壓驅(qū)動(dòng)水的重吸收[4]。其中，α-ENaC和Na+-K+-ATPase α1具有重要作用[5-6]。柚皮素廣泛存在于柑橘等水果中，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用[7]。研究表明柚皮素能減輕ALI小鼠肺部炎癥[8-9]。然而，柚皮素能否通過SGK1通路保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的ALI仍有待研究。本研究用脂多糖構(gòu)建ALI小鼠模型，以柚皮素預(yù)處理，探討對ALI小鼠的治療作用及可能的作用機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑、儀器

4～6周齡雌性BALB/c小鼠15只，體質(zhì)量約20g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號：SCXK(鄂)2020-0018，飼養(yǎng)條件：室溫20℃，空氣濕度50%～55%，晝夜12h，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)。柚皮素、脂多糖購自上海阿拉丁公司；TNF-α、IL-1β 酶聯(lián)免疫測定試劑盒購自武漢ELK公司；磷酸化SGK1抗體(p-SGK1 Ser422)購自美國Sigma公司；α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1、GAPDH 抗體購自美國Abcam公司；RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自武漢ASPEN公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自Diatek公司；全自動(dòng)血液分析儀構(gòu)自瑞士羅氏公司。

二、動(dòng)物分組及造模

15只BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，隨機(jī)分成Control組、LPS組、LPS+Nar組，n=5。模型制備[7-8]：LPS+Nar組予以柚皮素(100mg/kg)灌胃預(yù)處理，連續(xù)4天，每天1次，Control組和LPS組予以等量生理鹽水灌胃。末次灌胃2h后腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，固定于操作臺上，LPS+Nar組和LPS組氣管內(nèi)一次性滴入脂多糖(5mg/kg)建立小鼠ALI模型，Control組氣管內(nèi)滴入等量生理鹽水，各組小鼠于造模成功后24h取腹主動(dòng)脈血、雙肺組織待檢。

三、肺組織病理學(xué)觀察

收集各組小鼠右肺上葉組織，洗凈后放于4%多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋、5μm厚切片，HE 染色觀察肺組織病理改變。

四、動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)及氧合指數(shù)(OI)檢測

小鼠處死前，用肝素注射器經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血0.5 mL進(jìn)行血?dú)夥治?，測定PaO2，并計(jì)算氧合指數(shù)(Oxygenation index，OI=PaO2/FiO2，F(xiàn)iO2取21%)。

五、肺組織濕/干比值(W/D)測定

取右肺下葉組織精確稱重，記為濕重(W)，然后放置于75℃烤箱中烘烤36h至恒定重量后稱重，記為干重(D)，計(jì)算肺組織W/D值。

六、ELISA 法檢測肺組織中TNF-α、IL-1β表達(dá)水平

取少許左肺上葉組織用勻漿器充分勻漿，離心后收集上清液，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，在450 nm波長處測定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肺組織中TNF-α、IL-1β含量。

七、Western blot法檢測肺組織中p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達(dá)

我國現(xiàn)存最早的私家藏書樓是天一閣。始建于明朝嘉靖四十年（公元1561年），位于位于浙江寧波的天一閣，由范欽主持建造，所藏各類書籍達(dá)七萬余卷。是中國現(xiàn)存最早的私家藏書樓，也是世界最早的三大私家圖書館之一。

取適量左肺下葉組織，加入RIPA裂解液，收集上清液測定總蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，洗膜后加入α-ENaC 抗體(1∶1000)、p-SGK1抗體(1∶500)、Na+-K+-ATPase α1抗體(1∶500)，4 ℃搖床過夜，TBST 洗膜3次，每次5 min，加入對應(yīng)的辣根過氧化物標(biāo)記的二抗37 ℃孵育30min，TBST洗滌4次，每次5 min，ECL 顯色，使用圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行掃描，計(jì)算各蛋白的相對表達(dá)量。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、造模后各組小鼠一般情況

Control組精神較好、反應(yīng)靈活、呼吸平穩(wěn)、活動(dòng)及進(jìn)食正常；LPS組精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、嘴唇發(fā)紺、呼吸急促、尿少、活動(dòng)及進(jìn)食明顯減少；LPS+Nar組小鼠一般情況介于Control組和LPS組之間，精神尚可，活動(dòng)及進(jìn)食有所減少。

二、Nar對ALI小鼠肺組織病理變化的影響

圖1 各組小鼠肺組織病理改變(HE×200)

三、Nar對ALI小鼠PaO2、OI、W/D的影響

與Control組相比，LPS組腹主動(dòng)脈血PaO2、OI降低(均P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Nar組PaO2、OI升高(均P<0.05)。與Control組相比，LPS組肺組織W/D值增加(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Nar組W/D值降低(P<0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠動(dòng)脈血氧分壓、氧合指數(shù)及濕干重比

四、Nar對ALI小鼠肺組織TNF-α、IL-1β表達(dá)水平的影響

與Control組相比，LPS組肺組織TNF-α、IL-1β表達(dá)升高(均P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Nar組TNF-α、IL-1β表達(dá)降低(均P<0.05)(見表2)。

表2 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β表達(dá)水平

五、Nar對ALI小鼠肺組織p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達(dá)水平的影響

與Control組相比，LPS組肺組織p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Nar組p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達(dá)升高(均P<0.05)(見圖2、表3)。

圖2 各組小鼠肺組織p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達(dá)水平

表3 各組小鼠肺組織p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達(dá)水平

討 論

柚皮苷及其苷元柚皮素作為一種天然的植物化合物，前期的研究表明具有顯著的鎮(zhèn)咳、祛痰、抗肺部炎癥等作用，已被研制成國家一類新藥，在臨床中的應(yīng)用逐步增加[10]。Chen等[11]人表明柚皮素通過抑制氧化應(yīng)激和肺部炎癥對百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷和肺纖維化具有治療作用。Lin等[12]發(fā)現(xiàn)柚皮素通過抑制自噬，對肺炎支原體感染后的氣道重塑有改善。但柚皮素通過SGK1信號通路改善脂多糖誘導(dǎo)ALI的相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖氣管滴入構(gòu)建ALI小鼠模型，并運(yùn)用此模型探究柚皮素對ALI的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。HE染色結(jié)果顯示LPS組炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡上皮壞死脫落、肺泡壁塌陷、間隔增寬、肺泡腔內(nèi)可見紅細(xì)胞，W/D值及TNF-α、IL-1β升高，PaO2降低、OI小于300，說明脂多糖誘導(dǎo)ALI小鼠模型制備成功。

ALI是由于各種因素如細(xì)菌感染、敗血癥、嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致的肺部過度炎癥反應(yīng)，引起肺泡-毛細(xì)血管屏障受損和通透性增加[3]。炎癥在ALI期間起著核心作用，促炎因子與抗炎因子的比例失衡是ALI發(fā)生的重要一環(huán)。TNF-α、IL-1β是由炎癥細(xì)胞分泌的促炎因子，在啟動(dòng)早期炎癥反應(yīng)和維持炎癥方面起關(guān)鍵作用[13]，可調(diào)控炎癥的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間，促使中性粒細(xì)胞聚集、激活，通過“瀑布式反應(yīng)”導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部損害[14-15]。既往研究表明，柚皮素能改善脂多糖誘導(dǎo)的ALI小鼠肺部炎癥[16]。本研究結(jié)果顯示LPS組肺組織損傷嚴(yán)重，TNF-α、IL-1β表達(dá)水平較Control組增加。與LPS組相比，柚皮素預(yù)給藥能減輕肺組織損傷、下調(diào)TNF-α、IL-1β表達(dá)，說明柚皮素在一定程度上可減輕ALI小鼠肺部炎癥，與之前的研究結(jié)果相符合。

目前ALI暫無特異性治療藥物，肺保護(hù)性機(jī)械通氣仍是主流的治療方法，盡管能改善部分患者的預(yù)后，但病死率仍居高不下[17]。有研究報(bào)道減輕肺水腫是促進(jìn)患者預(yù)后和降低病死率的重要措施。ENaC被認(rèn)為是肺水腫液清除的中心環(huán)節(jié)，和位于基底外側(cè)的Na+-K+-ATPase協(xié)同將Na+從肺泡腔轉(zhuǎn)運(yùn)到間質(zhì)或毛細(xì)血管中，兩者共同維持著肺部微環(huán)境的穩(wěn)定[18]。ENaC是一種非電壓依賴性的離子通道，是上皮細(xì)胞主要的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)通道之一，屬于ENaC/退化蛋白家族，主要分布于人體肺部、腎臟、結(jié)腸、生殖道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)[19]。肺組織ENaC由位于肺泡上皮細(xì)胞頂端的三個(gè)亞單位(αβγ)組成，α亞基是ENaC的功能性亞單位[2]。有研究報(bào)道缺乏α-ENaC的大鼠在出生后死亡率增加了四倍[20]。由此推測α-ENaC可能是治療ALI的優(yōu)選靶點(diǎn)。Na+-K+-ATPase由α和β兩個(gè)亞單位組成，目前已發(fā)現(xiàn)四種Na+-K+-ATPase α單位亞型(α1-α4)[21]。在肺內(nèi)α1亞單位在肺泡I和Ⅱ型上皮細(xì)胞中均有表達(dá)[6]。亦有研究發(fā)現(xiàn)在急性缺氧條件下，α1亞單位磷酸化會觸發(fā)Na+-K+-ATPase內(nèi)吞作用使其活性降低[22]。α1可能是維持Na+-K+-ATPase活性的重要組成部分，本實(shí)驗(yàn)選擇Na+-K+-ATPase α1為檢測指標(biāo)。

SGK1最初是在乳腺腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，屬于Ser/Thr蛋白激酶，有SGK2和SGK3兩種同源體，參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、自噬和增殖等[23]。SGK1受磷酸化/去磷酸化調(diào)節(jié)，磷酸化的SGK1(p-SGK1)是其活性形式。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)基因4(Nedd-4)可使α-ENaC泛素化從而降低α-ENaC活性，SGK1通過阻斷Nedd-4對α-ENaC的泛素化作用，保留了α-ENaC的功能和活性，增強(qiáng)對Na+的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)能力[24]。SGK1還可直接磷酸化α-ENaC絲氨酸殘基從而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)運(yùn)Na+的能力和活性[25]。以上研究表明SGK1可能是促進(jìn)α-ENaC蛋白表達(dá)，減輕肺水腫的重要信號途徑之一。為了進(jìn)一步探究柚皮素是否能通過調(diào)控SGK1信號通路起到肺部保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)檢測了各組小鼠肺組織α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示LPS組肺組織α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達(dá)較Control組降低，經(jīng)柚皮素干預(yù)后，α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達(dá)較LPS組增加。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)LPS組肺組織p-SGK1蛋白表達(dá)較Control組降低，柚皮素處理后其表達(dá)水平較LPS組增加。以上結(jié)果提示柚皮素可能通過激活SGK1，促使α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而減輕肺組織水腫。

綜上所述，柚皮素通過抑制炎癥介質(zhì)的釋放及上調(diào)α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的ALI小鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活SGK1信號通路有關(guān)，但關(guān)于柚皮素激活SGK1的確切機(jī)制有待更深入的研究。