哮喘易感基因多態(tài)性與毛細(xì)支氣管炎預(yù)后的相關(guān)性分析

錢(qián)前 張玉紅 王宜芬 李偉 劉麗 于艷艷

毛細(xì)支氣管炎是嬰幼兒時(shí)期常見(jiàn)的喘息性疾病，也是導(dǎo)致嬰幼兒住院的重要病因，其臨床表現(xiàn)輕重不一，以陣發(fā)性憋咳、喘息及氣促為臨床表現(xiàn)，在世界范圍內(nèi)廣泛流行[1]。哮喘是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的慢性氣道疾病，喘息反復(fù)發(fā)作影響患兒身心健康，也給家庭及社會(huì)造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。有研究報(bào)道因毛細(xì)支氣管炎住院的患兒中約22%～48%發(fā)展為兒童哮喘[3]，由此可見(jiàn)部分毛細(xì)支氣管炎很可能是兒童哮喘的早期階段，如何從毛細(xì)支氣管炎患兒中甄別出哮喘高危兒以早期管理及干預(yù)，是減少哮喘發(fā)病率的重要舉措。哮喘作為一種異質(zhì)性疾病，其發(fā)生、發(fā)展與遺傳背景密切相關(guān)，研究表明哮喘易感基因SNPs IL13 A2044G、IL4-590C>T、ADRβ2 R16G 和 FcεR1β E237G與漢族兒童哮喘發(fā)生密切相關(guān)[4]，本文旨在探討上述位點(diǎn)與毛細(xì)支氣管炎后喘息情況的相關(guān)性，為甄別毛細(xì)支氣管炎中的哮喘高危兒提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

納入2018年12月—2020年01月在連云港市婦幼保健院兒童呼吸科住院的毛細(xì)支氣管炎患兒132例，其中男95人，女37人。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡1～24月，性別不限；(2)符合第八版《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》中毛細(xì)支氣管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)所有患兒入組前均未使用吸入性及全身性糖皮質(zhì)激素，未使用抗組胺藥物；(4)無(wú)繼發(fā)細(xì)菌感染；(5)排除支氣管異物、先天性心血管疾病、免疫缺陷病、胃食管反流、先天性氣道發(fā)育異常等疾病。所有研究均得到患兒家長(zhǎng)同意且簽署知情同意書(shū)，同時(shí)獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.分組方式 納入對(duì)象以既往是否有醫(yī)師診斷的特異性皮炎病史作為依據(jù)，分為特應(yīng)性體質(zhì)組(atopic group，簡(jiǎn)稱(chēng)A組)63人、非特應(yīng)性體質(zhì)組(non-atopic group，簡(jiǎn)稱(chēng)N組)69人。

2.哮喘易感基因檢測(cè)

(1)基因組DNA提?。簝山M患兒采集口腔黏膜拭子后，口腔拭子基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取 DNA。

(2)引物設(shè)計(jì)：參照 GenBank 中人 DNA 基因序列，在NCBI網(wǎng)站上查詢(xún)包含相應(yīng)位點(diǎn)的基因序列，確定相應(yīng)的突變位點(diǎn)，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì) PCR引物，引物序列見(jiàn)(表1)。

表1 基因擴(kuò)增引物序列

(3)Massarray SNP 分型技術(shù)對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型：多重 PCR 反應(yīng)：模板 DNA 2 μL，熱啟動(dòng) Taq DNA 聚合酶0.2μL，擴(kuò)增引物各為 0.5 μL，25mM/L dNTPs 0.1 μL，25mM/L MgCl20.4 μL，PCR緩沖液0.5 μL，水0.8μL，反應(yīng)體積為5 μL；反應(yīng)條件為 95℃ 2 min，(95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min)×45 cycles，72℃ 5 min；4℃保存。

蝦堿性磷酸酶(SAP)反應(yīng)：PCR 產(chǎn)物 5 μL，SAP 緩沖液0.17 μL，SAP酶0.30 μL，水1.53 μL。反應(yīng)條件為：37℃ 40 min，85℃ 5 min，4℃保存。

延伸反應(yīng)：SAP處理后 PCR 產(chǎn)物 7 μL，iPLEX緩沖液0.2 μL，iPLEX混合物0.2 μL，iPLEX 酶為0.04 μL，延伸引物混合物0.94μL，水0.62 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 30 s，[94℃ 5 s，(52℃ 5 s，80℃ 5 s)×5 cycles]×40 cycles，72℃ 3 min，4℃保存。

芯片點(diǎn)樣：將所得產(chǎn)物脫鹽處理，用 MassARRAYTMRS 1000 點(diǎn)樣儀將樣本點(diǎn)到對(duì)應(yīng)的 SpectroCHIP(芯片)上，使用 MALDI-TOF(基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間)質(zhì)譜儀獲得數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因分型并輸出結(jié)果。

3.呼出氣一氧化氮檢測(cè) 采用無(wú)錫尚沃醫(yī)療電子SV-O2納庫(kù)侖一氧化氮分析儀測(cè)定患兒FeNO 水平。檢測(cè)時(shí)患兒處于自然睡眠或水合氯醛鎮(zhèn)靜睡眠狀態(tài)，用采氣面罩連接采氣袋后，緊扣被檢查者的口鼻處，防止漏氣，在平靜呼吸狀態(tài)下取樣品氣，對(duì)樣品氣體進(jìn)行離線(xiàn)檢測(cè)[5]。

4.血常規(guī)檢測(cè) 入院24小時(shí)內(nèi)常規(guī)采集靜脈血檢測(cè)外周血嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophil，EOS)比例。

三、隨訪(fǎng)指標(biāo)

對(duì)入選所有毛細(xì)支氣管炎患兒在出院后3月、6月、9月、12月時(shí)進(jìn)行隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)指標(biāo)：喘息情況、喘息次數(shù)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、研究對(duì)象一般情況

共納入132例漢族毛細(xì)支氣管炎患兒，其中A組63人，男48人(76.2%)，女15人(23.8%)，平均年齡(12.10±6.57)月，N組69人，男47人(68.1%)，女22人(31.9%)，平均年齡(11.35±6.58)月，兩組間性別，年齡均無(wú)顯著差異(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 兩組毛細(xì)支氣管炎患兒人口統(tǒng)計(jì)學(xué)比較

二、毛細(xì)支氣管炎臨床數(shù)據(jù)分析

132例毛細(xì)支氣管炎患兒，出院后一年內(nèi)有喘息發(fā)作人數(shù)92人(69.7%)，其中A組毛細(xì)支氣管炎患兒外周血嗜酸性粒細(xì)胞比例、出院1年內(nèi)發(fā)生喘息再發(fā)人數(shù)、喘息再發(fā)次數(shù)均顯著高于N組(P<0.05)。A組呼出氣一氧化氮(FENO)水平較N組升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 兩組毛細(xì)支氣管炎患兒臨床數(shù)據(jù)比較

三、兩組間哮喘易感基因基因型比較

A組哮喘易感基因SNPs ADβ2 R16G以 AA型頻率最高，其次是AG型，GG型頻率最低，N組以AG型頻率最高，AA型頻率次之，GG型頻率最低，組間比較具有顯著性差異(P<0.05)。IL13 A2044G、IL4-590C>T、FcεR1β E237G位點(diǎn)基因型分布在兩組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 兩組間哮喘易感基因單核苷酸多態(tài)性基因型分布[n(%)]

討 論

毛細(xì)支氣管炎是2歲以下患兒所特有的下呼吸道感染，以氣道阻塞所致的氣促和喘鳴為特征，肺部聽(tīng)診可聞及哮鳴音、濕啰音，其流行范圍廣，6月齡以下毛細(xì)支氣管炎患兒常需住院治療。近年來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)毛細(xì)支氣管炎與日后反復(fù)喘息乃至哮喘發(fā)生密切相關(guān)，特應(yīng)性體質(zhì)和早期重癥毛細(xì)支氣管炎可能是日后發(fā)展為哮喘的高危因素[1]。鑒于不斷攀升的的哮喘發(fā)病率以及哮喘對(duì)患兒生理、心理發(fā)育的影響乃至對(duì)家庭和社會(huì)造成的負(fù)擔(dān)，需早期甄別哮喘高危兒，納入管理、及時(shí)防治，以降低兒童哮喘發(fā)病率。

5歲以下兒童哮喘診斷缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且引起嬰幼兒喘息發(fā)作的因素復(fù)雜，故難以精準(zhǔn)做出哮喘診斷。2000年提出的哮喘預(yù)測(cè)指數(shù)(asthma predictive index，API)，目前廣泛用于評(píng)估5歲以?xún)?nèi)喘息嬰幼兒日后發(fā)展為哮喘的風(fēng)險(xiǎn)，然而API雖具有較高的特異度，但靈敏度不足，限制了在中等風(fēng)險(xiǎn)以及喘息次數(shù)小于4次的患兒中使用[6]。因此在更早期甚至在嬰兒喘息臨床表型尚未顯現(xiàn)的毛細(xì)支氣管炎階段，探討可以識(shí)別的哮喘高危風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)十分必要。

哮喘是一種異質(zhì)性疾病，哮喘易感基因在哮喘發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可以用于預(yù)測(cè)哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，毛細(xì)支氣管炎是嬰幼兒生命早期喘息的獨(dú)有形式，特應(yīng)性體質(zhì)、毛細(xì)支氣管炎后反復(fù)喘息是毛細(xì)支氣管炎向哮喘發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素[7]，本研究擬探討哮喘易感基因與不同體質(zhì)毛細(xì)支氣管炎及毛細(xì)支氣管炎后喘息的相關(guān)性，以指導(dǎo)哮喘高危風(fēng)險(xiǎn)患兒納入管理，實(shí)現(xiàn)哮喘的二級(jí)預(yù)防。

一、臨床資料在兩組間的差異

本研究以隊(duì)列初期是否曾患特應(yīng)性皮炎進(jìn)行分組，進(jìn)行為期1年隨訪(fǎng)，對(duì)兩組間入院時(shí)外周血嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)水平、呼出氣一氧化氮(FENO)水平、發(fā)生喘息人數(shù)以及喘息次數(shù)進(jìn)行對(duì)比。研究發(fā)現(xiàn)A組嗜酸性粒細(xì)胞水平顯著高于N組，與張奕等報(bào)道一致[8]，提示A組患兒體內(nèi)存在嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥。通過(guò)趨化粘附募集在氣道黏膜的嗜酸性粒細(xì)胞可進(jìn)行脫顆粒釋放多種炎癥因子，如嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白等，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性以及肺組織損傷。有報(bào)道稱(chēng)毛細(xì)支氣管炎期間嗜酸性粒細(xì)胞水平降低與一過(guò)性喘息相關(guān)，而嗜酸性粒細(xì)胞水平顯著升高則預(yù)示著3歲以?xún)?nèi)反復(fù)喘息[9]。本研究經(jīng)隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)，A組無(wú)論是再次喘息人數(shù)占比還是個(gè)體喘息再次發(fā)生次數(shù)都顯著高于N組，與既往研究一致。T?rm?nen S等發(fā)現(xiàn)2歲以?xún)?nèi)因毛細(xì)支氣管炎住院的患兒在12～13歲時(shí)患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)高2.6～5倍，其風(fēng)險(xiǎn)因素為特應(yīng)性皮炎、反復(fù)喘息、外周血嗜酸性粒細(xì)胞增多[7]，本研究中特應(yīng)性毛細(xì)支氣管炎患兒嗜酸性粒細(xì)胞增多、易反復(fù)喘息，從一定層面證明了特應(yīng)性體質(zhì)毛細(xì)支氣管炎患兒哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更高。本研究還發(fā)現(xiàn)毛細(xì)支氣管炎患兒出院后1年內(nèi)再喘息的發(fā)生率高達(dá)69.7%，特應(yīng)性體質(zhì)組再喘息率更是高達(dá)88.9%，因此將毛細(xì)支氣管炎群體納入長(zhǎng)期隨訪(fǎng)管理或更有益于患兒喘息的規(guī)范診療。

呼出氣一氧化氮(FENO)檢測(cè)是檢測(cè)氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥水平的首選方法，其具備無(wú)創(chuàng)、操作便利、可重復(fù)性好等特點(diǎn)，被用于輔助診斷、管理兒童哮喘以及指導(dǎo)、評(píng)估吸入性糖皮質(zhì)激素的使用。由于嬰幼兒配合度不夠，干擾因素多，潮氣離線(xiàn)測(cè)定公認(rèn)度不夠，且缺乏不同年齡段嬰幼兒標(biāo)準(zhǔn)值參考，F(xiàn)ENO在毛細(xì)支氣管炎患兒中的診療價(jià)值存在爭(zhēng)議，研究結(jié)果也常不一致[10]。本研究發(fā)現(xiàn)A組FENO值高于N組，但是無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此FENO在毛細(xì)支氣管炎中評(píng)估氣道炎癥水平的意義有待進(jìn)一步探討。

二、哮喘易感基因在兩組間的差異性

近些年，隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展，對(duì)易感基因在哮喘發(fā)生、發(fā)展方面作用的探討不斷深入。易感基因多態(tài)性，即單堿基對(duì)變異是發(fā)生哮喘主要的風(fēng)險(xiǎn)因素。了解這些變異基因有助于研究哮喘發(fā)病機(jī)制、預(yù)測(cè)哮喘發(fā)生、加速抗哮喘藥物研發(fā)以及實(shí)現(xiàn)個(gè)體精準(zhǔn)靶向治療等[11]。有研究指出四個(gè)哮喘易感基因SNPs IL13 A2044G、IL4-590C>T、ADRβ2R16G 和 FcεR1β E237G，任何一個(gè)基因位點(diǎn)對(duì)哮喘的發(fā)展具有獨(dú)立影響，綜合四個(gè)基因在哮喘預(yù)測(cè)方面具有協(xié)同效果[4]。也有文獻(xiàn)報(bào)道上述四個(gè)位點(diǎn)與哮喘預(yù)測(cè)指數(shù)陽(yáng)性嬰幼兒具有相關(guān)性[12]，然而這些基因位點(diǎn)與毛細(xì)支氣管炎相關(guān)性探討目前鮮有報(bào)導(dǎo)。

位于染色體5q31上的β2腎上腺素能受體基因，其至少存在9個(gè)突變位點(diǎn)，其中一個(gè)重要突變位點(diǎn)即ADRβ2R16G，氨基酸位點(diǎn)16表達(dá)精氨酸還是甘氨酸由基因A或G決定，與β2腎上腺素能受體的敏感度下調(diào)有關(guān)[13-14]。本研究顯示A組AA基因型頻率顯著高于N組，而GG基因型頻率A組低于N組，兩組間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明ADRβ2R16G易感基因多態(tài)性與不同體質(zhì)的毛細(xì)支氣管炎存在關(guān)聯(lián)，其中AA基因型頻率在A組患兒中表達(dá)增高，而這部分患兒隨訪(fǎng)數(shù)據(jù)顯示，無(wú)論是喘息再次發(fā)作的次數(shù)和人數(shù)均明顯高于N組患兒，提示A組患兒具有明顯的哮喘傾向，由此推測(cè)ADRβ2R16G易感基因的AA基因型高頻率及GG基因型低頻率對(duì)預(yù)警毛細(xì)支氣管炎后喘息及哮喘發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)，具有一定價(jià)值。既往研究也表明AA純合子基因型與氣道高反應(yīng)性及哮喘嚴(yán)重程度相關(guān)，而純合子GG基因型對(duì)嚴(yán)重哮喘的發(fā)展具有保護(hù)作用[14]。與本研究的推論一致。

IL13基因位于染色體5q31-33，IL13 A2044G是IL13基因單核苷酸多態(tài)性突變位點(diǎn)之一。參與調(diào)節(jié)IgE合成，與過(guò)敏性哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。也有研究表明此基因多態(tài)性分布在哮喘組和對(duì)照組之間無(wú)顯著差異[13,15]。本研究顯示該位點(diǎn)AA、AG、GG基因型分布頻率在兩組間并無(wú)顯著差異。表明IL13 A2044G基因多態(tài)性分布在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

人類(lèi)IL4基因位于染色體5q31，目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)50個(gè)多態(tài)性突變等位基因位點(diǎn)，IL4-590C>T位點(diǎn)位于IL4基因啟動(dòng)子區(qū)域，可增強(qiáng)IL4活性以及修飾IL4基因轉(zhuǎn)錄，與血清IgE水平升高及哮喘發(fā)生相關(guān)[16]。本研究?jī)山M中此基因位點(diǎn)均以TT基因型分布頻率最高，CT基因型次之，CC基因型分布頻率最低，組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

FcεR1由三個(gè)亞基形成的異四聚體構(gòu)成，信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)亞基FcεR1β由 FcεR1β E237G編碼，此多態(tài)性位點(diǎn)堿基由A變成G，可使氨基酸殘基237由谷氨酸替代為甘氨酸，影響高親和力受體的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，與血清總IgE、特異性IgE水平及過(guò)敏性哮喘發(fā)生密切相關(guān)[13,17]。本研究結(jié)果顯示此多態(tài)性位點(diǎn)基因型在兩組間分布，均以AA基因型頻率最高，GG基因型頻率最低，組間無(wú)顯著差異。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究指出API陽(yáng)性喘息患兒AG基因型分布頻率明顯高于API陰性喘息患兒[13]，與本研究存在不一致性，考慮可能與病例對(duì)照分組方式不同以及地區(qū)差異性有關(guān)。

綜上，哮喘易感基因SNPs ADRβ2 R16G與特應(yīng)性體質(zhì)毛細(xì)支氣管炎密切相關(guān)，ADRβ2 R16G易感基因的AA基因型高頻率及GG基因型低頻率對(duì)預(yù)警毛細(xì)支氣管炎后喘息及哮喘發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)具有一定價(jià)值，可作為毛細(xì)支氣管炎后喘息乃至哮喘傾向的高危指標(biāo)，宜將此類(lèi)患兒納入哮喘高危人群管理以實(shí)現(xiàn)哮喘的二級(jí)預(yù)防。

本研究尚存在一些局限性，比如隨訪(fǎng)時(shí)間短，對(duì)病情輕重不同的毛細(xì)支氣管炎患兒沒(méi)有進(jìn)行分組隨訪(fǎng)等。下一步我們將擴(kuò)大樣本量，對(duì)病情輕重不同的毛細(xì)支氣管炎患兒進(jìn)行相關(guān)性分析，并延長(zhǎng)隨訪(fǎng)時(shí)間，以哮喘發(fā)生的節(jié)點(diǎn)分組探討哮喘易感基因在毛細(xì)支氣管炎中的預(yù)測(cè)價(jià)值，為阻止哮喘的發(fā)生發(fā)展提供更有價(jià)值的參考指標(biāo)。