肺泡灌洗液宏基因組二代測(cè)序?qū)σ伤品谓Y(jié)核的診斷價(jià)值

趙素娥 高欣 劉勝崗 龍靜 周麗華

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的呼吸系統(tǒng)傳染病，我國(guó)肺結(jié)核發(fā)病率及死亡率位居所有傳染病首位，為全球第2位[1]。控制結(jié)核病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是控制傳染源，因此肺結(jié)核患者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷顯得尤為重要。傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)方法周期長(zhǎng)，陽(yáng)性率低，不能滿足臨床快速診斷的需要。近年來(lái)，宏基因組二代測(cè)序技術(shù)(metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS)發(fā)展迅速，它能對(duì)微生物的DNA或RNA進(jìn)行快速測(cè)序的技術(shù)，對(duì)感染性疾病的診斷具有一定的價(jià)值[2-4]。本研究對(duì)同期進(jìn)行MTB痰涂片和培養(yǎng)，肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)涂片和培養(yǎng)、熒光定量PCR、Xpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱Xpert)及BALF mNGS檢測(cè)的患者進(jìn)行回顧性分析，旨在探討B(tài)ALF mNGS檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核早期診斷的價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2020 年5月22日至2021年2月20日長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院收治、同步行痰液及BALF抗酸染色涂片法、MTB培養(yǎng)法，BALF TB-DNA或Xpert檢測(cè)及BALF mNGS的疑似肺結(jié)核患者，且尚未使用抗癆藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡在18歲以下、近期有抗結(jié)核治療史、臨床資料不完整、未同時(shí)進(jìn)行抗酸染色涂片法、MTB培養(yǎng)法及mNGS檢測(cè)、診斷不明確者。最終納入155例，男106例，女49例，年齡(59.05±16.45)歲。根據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，最后診斷為肺結(jié)核95例(肺結(jié)核組)，男72例，女23例，年齡(59.30±16.46)歲；診斷為非肺結(jié)核60例(非結(jié)核組)，其中感染性疾病54例，嗜血細(xì)胞綜合征1例，惡性腫瘤5例，男34例，女26例，年齡(58.66±16.58)歲。本研究通過(guò)長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：2021-S0197)。

肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《肺結(jié)核診斷》(WS 288-2017)[5]，臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為：(1)結(jié)合影像特征和結(jié)核免疫學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性，排除其他疾病，且抗結(jié)核藥物治療經(jīng)評(píng)估有效。確診標(biāo)準(zhǔn)：(2)具有病原學(xué)或者病理診斷依據(jù)，或采用現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)手段(PCR法、基因檢測(cè)等)結(jié)合臨床資料等進(jìn)行綜合分析的確診患者。

二、標(biāo)本采集

采用日本產(chǎn)Olympus BF-260型電子支氣管鏡灌洗病變肺段，重復(fù)灌洗肺部2～3次，收集肺泡灌洗液。

三、檢測(cè)方法

1 常規(guī)MTB檢查方法 涂片按照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》中的 標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，采用美國(guó)BACTEC MGIT 960全自動(dòng)快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀，具體操作方法參照儀器說(shuō)明書。

2 熒光定量PCR檢測(cè) 運(yùn)用博奧生物有限公司核酸提取儀提取肺泡灌洗液的結(jié)核分枝桿菌DNA(TB-DNA)，然后運(yùn)用美國(guó)ABI-7500基因擴(kuò)增儀檢測(cè)，具體操作參考試劑說(shuō)明書。

3 Xpert MTB/RIF檢測(cè) Xpert MTB/RIF按照美國(guó)Cepheid公司生產(chǎn)的利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)檢測(cè)系統(tǒng)儀器使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。

4 宏基因組二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè) 取肺泡灌洗液5 mL以上，送至湖南圣維爾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心檢測(cè)，進(jìn)行核酸提取及建庫(kù)和上機(jī)測(cè)序，最后進(jìn)行生信分析及報(bào)告，分析流程為：①過(guò)濾原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量序列及接頭序列，②初步質(zhì)控后數(shù)據(jù)，③去人源及常見(jiàn)背景微生物序列，④比對(duì)微生物數(shù)據(jù)庫(kù)(來(lái)源：NCBI-RefSeq&Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)(12800+種)，細(xì)菌6600種，真菌980種，病毒5000種，寄生蟲(chóng)222種，分支桿菌171種，支原體/衣原體97種)，⑤依據(jù)比對(duì)情況進(jìn)行二次過(guò)濾，對(duì)種屬信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(NCBI-nt數(shù)據(jù)庫(kù)二次比對(duì)，與陰性control集進(jìn)行比較去除假陽(yáng)性物種)，⑥最終結(jié)果列表。

mNGS報(bào)告的解讀依據(jù)《宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》簡(jiǎn)稱《中國(guó)專家共識(shí)》[6]，符合下列標(biāo)準(zhǔn)：①若二代測(cè)序結(jié)果符合患者的臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室檢查，推薦根據(jù)二代測(cè)序結(jié)果指導(dǎo)臨床決策。②若二代測(cè)序結(jié)果陽(yáng)性且符合臨床表現(xiàn)，但缺乏除二代測(cè)序結(jié)果外的其他實(shí)驗(yàn)室支持證據(jù)，應(yīng)進(jìn)行PCR驗(yàn)證(在具有合適引物的條件下)，并建議臨床進(jìn)一步完善可獲得的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查加以驗(yàn)證。③若二代測(cè)序結(jié)果陽(yáng)性，但臨床表現(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室檢查結(jié)果不支持該結(jié)果，則不能僅根據(jù)二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行診斷，而應(yīng)以傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果為首要臨床參考依據(jù)。MTB為胞內(nèi)致病菌，豐度較低，污染可能性小，當(dāng)至少1個(gè)讀數(shù)被映射到種或?qū)偎綍r(shí)，MTB被認(rèn)為是陽(yáng)性的[7]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用“例”和“率(%)”表示；最終臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算常規(guī)檢測(cè)方法與BALF mNGS在肺結(jié)核中的敏感度，特異度，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，陰性預(yù)測(cè)值；組間比較采用 χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

95例肺結(jié)核組中，BALF mNGS檢出MTB陽(yáng)性55例。肺結(jié)核組中，24例(25.26%)合并真菌感染(包括5例耶氏肺孢子菌)，以白色念珠菌居多，40例(42.11%)合并細(xì)菌感染(見(jiàn)表1)。非肺結(jié)核患者60例，以肺部感染和支氣管擴(kuò)張合并感染多見(jiàn)(見(jiàn)表2)。

表1 肺結(jié)核組病原菌種類及占比

表2 非肺結(jié)核組病種及占比

二、mNGS MTB檢測(cè)陽(yáng)性者最終均診斷為肺結(jié)核，無(wú)假陽(yáng)性；真菌或細(xì)菌檢測(cè)陽(yáng)性者

根據(jù)臨床、實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)和痰液/肺泡灌洗液培養(yǎng)結(jié)果綜合判斷后進(jìn)行臨床干預(yù)。肺結(jié)核組中，mNGS及傳統(tǒng)方法(痰及BLAF)共診斷24例合并真菌感染(包括5例耶氏肺孢子菌感染)，均合并2種及以上病原菌感染，且均入住結(jié)核ICU，并進(jìn)行了針對(duì)性的抗真菌治療。肺結(jié)核組中，mNGS及傳統(tǒng)方法(痰及BLAF)共診斷40例合并細(xì)菌感染，其中mNGS及傳統(tǒng)方法一致者11例，mNGS檢出病原體而傳統(tǒng)方法未檢出者19例，傳統(tǒng)方法檢測(cè)出而mNGS未檢出者10例。38例進(jìn)行了針對(duì)性的抗感染治療，2例僅使用抗癆藥物。

非結(jié)核組60例，5例惡性腫瘤患者進(jìn)行了化療或靶向治療及參考病原學(xué)進(jìn)行抗感染治療。嗜血細(xì)胞綜合征1例轉(zhuǎn)血液科繼續(xù)治療。5例非結(jié)核分枝桿菌肺病，3例進(jìn)行抗NTM治療，2例要求轉(zhuǎn)上級(jí)醫(yī)院治療。其他合并細(xì)菌或真菌感染者參考mNGS結(jié)果進(jìn)行了治療。

三、mNGS診斷肺結(jié)核的陽(yáng)性率與常規(guī)檢測(cè)方法的比較

以最終臨床結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，mNGS診斷肺結(jié)核的陽(yáng)性率為57.89%(55/95)，高于痰抗酸染色涂片法(27.37%，26/95)和痰快培法(30.53%，29/95)，也明顯高于BALF抗酸染色涂片法(15.79%，15/95)和BALF快培法(20.00%，19/95)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；但與BALF Xpert(58.33%，21/36)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.00)；略高于BALF TB-DNA(50%，31/62)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.09)(見(jiàn)表3)。

表3 mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較

四、mNGS診斷肺結(jié)核的效能與常規(guī)檢測(cè)方法的比較(見(jiàn)表4)。

表4 mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法效能比較

討 論

肺結(jié)核是嚴(yán)重危害人類健康的公共問(wèn)題，早期診斷并及時(shí)治療對(duì)控制肺結(jié)核的傳染性尤其重要。羅氏培養(yǎng)法為經(jīng)典的診斷肺結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但培養(yǎng)周期長(zhǎng)，約4～6周，陽(yáng)性率低。涂片抗酸染色法簡(jiǎn)便、快捷，但陽(yáng)性率亦低。對(duì)于無(wú)咳痰或痰液含菌量少的患者，支氣管肺泡灌洗液(BALF)抗酸染色涂片及快培成為輔助診斷肺結(jié)核的重要工具，但BALF抗酸染色檢測(cè)結(jié)核桿菌要求標(biāo)本濃度較高，研究顯示[8]，BALF抗酸染色涂片陽(yáng)性率為15%，診斷價(jià)值有限。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，PCR是近年新發(fā)展的分子與基因相結(jié)合的方法，具有較高的靈敏度和特異度，能快速、準(zhǔn)確地診斷肺結(jié)核[9]。TB-DNA檢測(cè)技術(shù)是通過(guò)對(duì)DNA片段進(jìn)行放大擴(kuò)增，并借助熒光標(biāo)記探針對(duì)結(jié)核桿菌DNA擴(kuò)增序列進(jìn)行定量檢測(cè)的一種檢測(cè)方法。2018年實(shí)施的結(jié)核病診斷“新標(biāo)準(zhǔn)”增加了TB-DNA檢測(cè)作為結(jié)核病診斷新指標(biāo)[5]。而Xpert檢測(cè)技術(shù)是半巢式實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)優(yōu)化，可通過(guò)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特有的序列rpoB基因與利福平耐藥相關(guān)的81 bp核心區(qū)間[10-11]，能準(zhǔn)確、有效檢出結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥的情況，且其檢測(cè)時(shí)間明顯縮短。TB-DNA和Xpert檢測(cè)肺結(jié)核有較高的診斷價(jià)值，但肺結(jié)核患者多為混合感染，尤其對(duì)于危重癥患者，二者不能檢測(cè)其他病原體。

mNGS不基于培養(yǎng)，直接從環(huán)境/臨床樣本中提取全部微生物的核酸，利用基因組學(xué)的方法研究環(huán)境/樣本中所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能，可廣泛分析臨床樣本中微生物組(細(xì)菌、真菌、病毒、結(jié)核等)的高通量測(cè)序方法。該技術(shù)可準(zhǔn)確檢測(cè)出標(biāo)本中的MTB[12-13]?；仡櫺匝芯匡@示其診斷肺結(jié)核的敏感度為59%，顯著高于培養(yǎng)法(26%)[8]。本研究結(jié)果顯示，BALF mNGS診斷肺結(jié)核的敏感度為57.89%，顯著高于痰涂片法、痰培養(yǎng)法及BALF涂片法及BALF培養(yǎng)法，特異度100%，這與研究一致。這里BALF涂片法及培養(yǎng)法診斷肺結(jié)核的敏感度低于痰涂片法、痰培養(yǎng)法，考慮可能與標(biāo)本濃度稀釋有關(guān)，提示我們，有自主咳痰能力的患者盡量多次送檢痰涂片或培養(yǎng)。既往研究顯示，對(duì)于呼吸道樣本，mNGS對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的檢出率并不優(yōu)于GeneXpert[14]。本研究顯示BALF mNGS診斷肺結(jié)核的陽(yáng)性率與BALF Xpert(58.33%，21/36)和BALF TB-DNA(50%，31/62)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原因考慮為結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁比較厚[15]，破壁困難，常規(guī)核酸提取方法難以保證核酸提取的質(zhì)量。

《中國(guó)專家共識(shí)》[6]指出，各種原因?qū)е禄颊呒蔽Ｖ匕Y表現(xiàn)，不除外感染所致，或考慮繼發(fā)或并發(fā)危及生命的嚴(yán)重感染，建議常規(guī)檢測(cè)的同時(shí)，開(kāi)展mNGS。95例肺結(jié)核患者，共35例入住結(jié)核重癥監(jiān)護(hù)室，13例行氣管插管，10例合并膿毒癥休克。mNGS檢測(cè)出2種及以上病原體者63例(66.32%)，24例(25.26%)合并真菌感染，17例僅抗癆治療，82.11%(78/95)為混合感染，根據(jù)病原學(xué)進(jìn)行了治療調(diào)整。提示在危重癥感染患者或考慮存在混合感染的病例中，mNGS可提供準(zhǔn)確的病原菌診斷信息，減少了臨床經(jīng)驗(yàn)性廣譜抗生素的使用，可以快速、準(zhǔn)確地指導(dǎo)治療。

綜上所述，BALF mNGS診斷肺結(jié)核的敏感度、特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值顯著高于涂片法及培養(yǎng)法，但與BALF TB-DNA及BALF Xpert的陽(yáng)性率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示我們，對(duì)于輕癥疑似肺結(jié)核患者，不建議行mNGS檢測(cè)；對(duì)于疑難危重疑似肺結(jié)核患者mNGS為一種快速、全面檢測(cè)病原體的診斷方法。