恩格列凈對血糖波動糖尿病小鼠腎損傷的影響及其機(jī)制研究*

史麗，胡婷婷，李紅，張三明，劉智慧，左惠玲，胡利梅，任衛(wèi)東

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北張家口075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院國際醫(yī)療部，河北張家口075000；3.張家口市衛(wèi)生健康項(xiàng)目管理中心，河北張家口075000；4.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河北張家口075000）

糖尿病是一種糖脂代謝紊亂性疾病。不按時吃藥、患者心態(tài)較差、不合理飲食等都可引起糖尿病患者血糖波動。近年來越來越多研究證實(shí)，血糖波動越大的患者發(fā)生糖尿病并發(fā)癥，如糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）、糖尿病視網(wǎng)膜病變等風(fēng)險越高[1-2]。DN 是2 型糖尿病主要并發(fā)癥之一，是一種全身性微血管病變，能夠引起漸進(jìn)性腎功能損害，甚至引起嚴(yán)重腎衰竭，而血糖波動能夠加重DN 腎損傷[3]。目前血糖波動對DN 腎損傷的影響機(jī)制尚未闡明，臨床也仍缺乏治療DN 的特效藥。因此探究血糖波動加速腎損傷的作用機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和靶向治療藥物仍是臨床研究熱點(diǎn)。蒲閱麗等[4]研究顯示，恩格列凈可能通過抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD 細(xì)胞焦亡通路，改善糖尿病小鼠腎損傷。但目前有關(guān)恩格列凈對血糖波動糖尿病小鼠腎損傷的影響報道較少，因此本研究探究恩格列凈通過Caspase-1 介導(dǎo)的焦亡通路對血糖波動糖尿病小鼠腎損傷的影響，為臨床尋找有效治療靶點(diǎn)和靶向治療藥物提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

30 只4 周齡SPF 級SD 雄性小鼠，體重20～30 g，平均（25±5）g，購自北京北生研生物制品有限公司。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0012，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（京）2021-0262。

1.2 主要材料與儀器

鏈脲佐菌霉素（Streptozotocin,STZ）購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司， 蘇木精- 伊紅（Hematoxylin-eosin,HE）染色試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒購自北京伊塔生物科技有限公司，尿微量蛋白試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，兔抗鼠NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N、β-actin 抗體及山羊抗兔HRP 二抗均購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司。

ACCU-CHEK Advantage Ⅱ型血糖儀購自北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，7150 型生化自動分析儀購自日本Esco 公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的復(fù)制DM 模型的復(fù)制[5]：隨機(jī)選擇20 只小鼠禁食不禁水12 h，一次性尾靜脈注射STZ 溶液（40 mg/kg，以pH 4.5 的0.01 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液現(xiàn)用現(xiàn)配），72 h 后經(jīng)尾靜脈檢測小鼠空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L 為DM模型復(fù)制成功。剩余10 只小鼠作為對照組，一次性尾靜脈注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。

血糖波動性DM 模型的復(fù)制：小鼠DM 模型復(fù)制成功后1 周，于每天9：00、13：00、17：00 時間點(diǎn)腹腔注射葡萄糖溶液（250 g/L，0.4 mL），持續(xù)8 周，復(fù)制血糖波動性DM 模型。對照組小鼠同時間腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組將20 只血糖波動性DM 模型小鼠隨機(jī)分為血糖波動組、恩格列凈組，每組10 只。恩格列凈組小鼠于血糖波動性DM 模型復(fù)制結(jié)束后予以恩格列凈10 mg/（kg·d）灌胃，1 次/d，連續(xù)4 周[6]。對照組、血糖波動組小鼠同時間灌胃等量生理鹽水。

1.3.3 腎功能指標(biāo)檢測于末次給藥前，收集并記錄24 h 尿量，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液，用全自動生化分析儀檢測24 h 尿蛋白。末次給藥結(jié)束后，用4%水合氯醛麻醉小鼠并處死，眼球取血，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液，于-80℃冰箱冷凍保存，用全自動生化分析儀測量血肌酐、血尿素氮水平。

1.3.4 標(biāo)本采集及IL-1β水平檢測取血完畢后取雙腎組織[7]。①將左腎組織分為兩部分，一部分用4%多聚甲醛固定，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續(xù)切片（6 μm 厚），脫蠟、水化，進(jìn)行HE 染色，以中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化；另一部分制備組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液，采用ELISA 檢測IL-1β 水平，以上操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。②取右腎組織，保存于-80℃冰箱用于蛋白檢測。

1.3.5 Western blotting 檢測腎組織中焦亡通路相關(guān)蛋白分別取各組小鼠右腎組織制備組織勻漿，提取總蛋白并檢測濃度及純度，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后分別加入一抗NLRP3、Caspase-1、GSDMD、內(nèi)參β-actin（1∶1 000），次日加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，顯色，顯影，定影，根據(jù)蛋白條帶灰度值計算目的蛋白相對表達(dá)量[8]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腎組織病理學(xué)變化

對照組小鼠腎組織毛細(xì)血管腔內(nèi)未見擴(kuò)張，腎小管排列規(guī)則而緊密，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常，腎小球未見萎縮或肥大，基底膜和腸系膜無增厚。與對照組比較，血糖波動組小鼠腎小球體積增大，毛細(xì)血管基底膜明顯增厚，系膜基質(zhì)增生，腎小管上皮細(xì)胞可見空泡化。與血糖波動組比較，恩格列凈組小鼠上述病理變化有所改善。見圖1。

圖1 各組小鼠腎組織病理學(xué)變化（×400）

2.2 各組小鼠腎功能指標(biāo)比較

對照組、血糖波動組、恩格列凈組小鼠24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對照組比較，血糖波動組、恩格列凈組小鼠24 h 尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平升高（P<0.05）；但恩格列凈組小鼠24 h 尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平低于血糖波動組（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠腎功能指標(biāo)比較（n=10，±s）

表1 各組小鼠腎功能指標(biāo)比較（n=10，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與血糖波動組比較，P<0.05。

組別對照組血糖波動組恩格列凈組F 值P 值血肌酐/（μmol/L）40.15±6.06 83.29±12.52①50.38±7.58①②661.531 0.000 24 h尿蛋白/（mg/d）0.26±0.08 4.98±0.76①1.39±0.22①②617.061 0.000血尿素氮/（μmol/L）8.99±1.36 22.78±3.43①12.56±1.87①②659.379 0.000

2.3 各組小鼠腎組織IL-1β水平比較

對照組、血糖波動組、恩格列凈組小鼠腎組織IL-1β 分別為（15.09±2.27）pg/mL、（55.83±8.36）pg/mL 和（30.93±4.65）pg/mL，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=665.569，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對照組比較，血糖波動組、恩格列凈組小鼠腎組織IL-1β 水平升高（P<0.05），但恩格列凈組小鼠腎組織IL-1β 水平低于血糖波動組（P<0.05）。

2.4 各組小鼠腎組織NLRP3/Caspase-1/GSDMD細(xì)胞焦亡通路蛋白相對表達(dá)量比較

對照組、血糖波動組、恩格列凈組小鼠腎組織NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對照組相比，血糖波動組、恩格列凈組小鼠腎組織NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N 蛋白相對表達(dá)量升高（P<0.05），但恩格列凈組小鼠腎組織NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N 蛋白相對表達(dá)量低于血糖波動組（P<0.05）。見表2 和圖2。

圖2 各組小鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD-N細(xì)胞焦亡通路蛋白的表達(dá)

表2 各組小鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD-N細(xì)胞焦亡通路蛋白相對表達(dá)量比較（n=10，±s）

表2 各組小鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD-N細(xì)胞焦亡通路蛋白相對表達(dá)量比較（n=10，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與血糖波動組比較，P<0.05。

組別NLRP3蛋白對照組血糖波動組恩格列凈組F 值P 值GSDMD-N蛋白0.33±0.06 1.02±0.16①0.68±0.11①②500.811 0.000 0.15±0.03 0.47±0.08①0.31±0.05①②365.357 0.000 Cleaved caspase-1蛋白0.56±0.09 1.33±0.20①1.06±0.16①②582.680 0.000

3 討論

糖尿病是一種具有高致殘率、高病死率的慢性代謝紊亂性疾病，主要危害在于并發(fā)癥。DN 是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，是長期代謝紊亂導(dǎo)致的全身性微血管病變，具有較高發(fā)病率及病死率[9]。有研究顯示，糖尿病患者由于胰島素分泌不足或功能缺失，易出現(xiàn)餐后血糖快速大幅度上升然后緩慢回落的情況，形成波動血糖，而血糖波動使糖尿病患者更易并發(fā)DN，加重腎損傷，增加病死率[10]。

恩格列凈是新型口服降糖藥，能通過減少腎小管對葡萄糖的重吸收來增加腎臟葡萄糖的排出，進(jìn)而發(fā)揮降糖作用[11]。張瑜等[12]研究顯示，恩格列凈對2 型糖尿病伴慢性腎損傷患者的腎功能具有一定保護(hù)作用。何建芳等[13]研究顯示，恩格列凈對2 型糖尿病患者的血糖及腎功能有一定改善作用。血肌酐是人體肌肉代謝產(chǎn)物，其濃度變化主要由腎小球的濾過能力即腎小球?yàn)V過率來決定，濾過能力下降，則肌酐水平升高，反映腎臟受損。腎功能損傷的關(guān)鍵因素之一是分泌大量尿蛋白，其中24 h 尿蛋白是檢測尿蛋白的有效方式[14-15]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，血糖波動組小鼠腎小球體積增大，毛細(xì)血管基底膜明顯增厚，系膜基質(zhì)增生，腎小管上皮細(xì)胞可見空泡化，經(jīng)恩格列凈藥物干預(yù)后，小鼠上述病理變化有所改善；與對照組比較，血糖波動組小鼠24 h 尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平均升高，但經(jīng)恩格列凈藥物干預(yù)后，小鼠24 h 尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平均降低，說明恩格列凈可能對血糖波動性糖尿病小鼠腎損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

有研究表明，炎癥反應(yīng)在DN 發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。既往有研究顯示，抑制炎癥因子IL-1β 等能改善DN 小鼠微炎癥狀態(tài)，改善腎臟病理損傷[16]。細(xì)胞焦亡是一種致炎性細(xì)胞模式死亡，主要依賴Cleaved caspase-1 介導(dǎo)的經(jīng)典信號通路活化引起的一系列反應(yīng)，最終作用于細(xì)胞，觸發(fā)細(xì)胞焦亡。NLRP3 是一種糖尿病狀態(tài)下表達(dá)上調(diào)的多蛋白復(fù)合物，其炎性小體可剪切Cleaved caspase-1，促使其活化，并進(jìn)一步切割GSDMD 形成有活性的GSDMD-N，同時在腎小管細(xì)胞膜上聚合形成細(xì)胞膜微孔道，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡及炎癥因子如IL-1β 等釋放，導(dǎo)致腎損傷[17]。趙為陳等[18]研究表明，高糖可誘導(dǎo)GSDMD 依賴性細(xì)胞焦亡，促使糖尿病腎損傷發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，血糖波動組、恩格列凈組小鼠腎組織NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N 蛋白相對表達(dá)量升高，但經(jīng)恩格列凈干預(yù)后，小鼠腎組織NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N 蛋白相對表達(dá)量降低，說明恩格列凈對血糖波動性糖尿病小鼠腎損傷發(fā)揮保護(hù)作用，可能是通過抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路活化來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，恩格列凈可能通過抑制Caspase-1通路活化，對血糖波動性糖尿病小鼠腎損傷發(fā)揮保護(hù)作用。然而本研究并未能明確恩格列凈對NLRP3/Caspase-1/GSDMD 通路的具體調(diào)控作用，后期應(yīng)進(jìn)行深入闡述。