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      解郁祛痰化濁方干預(yù)高脂飲食大鼠腸道菌群多樣性的探討*

      2022-04-21 09:07:30李娜吳陽陽段錦龍鄭旭彤姚魁武
      天津中醫(yī)藥 2022年3期
      關(guān)鍵詞:血脂康解郁菌群

      李娜 ,吳陽陽 ,段錦龍 ,鄭旭彤 ,姚魁武

      (1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;2.洛陽市中醫(yī)院心血管科二病區(qū),洛陽 471000;3.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 100053)

      高脂血癥在中醫(yī)學(xué)上一般將其歸屬于“胸痹”“眩暈”“痰濕”等范疇。多以脾失健運、腎精不足、肝失疏泄為本,痰濁、內(nèi)濕、瘀血為標,是一種本虛標實證?!鹅`樞·本輸》云:“大腸、小腸皆屬于胃?!敝嗅t(yī)脾胃包含大腸、小腸在內(nèi)的整個消化系統(tǒng)。同時腸道菌群是人體的第二基因組,中藥湯劑經(jīng)口服進入消化道,勢必影響腸道菌群的結(jié)構(gòu),從而影響腸道微生物群而發(fā)揮作用[1-2]。國醫(yī)大師薛伯壽認為肝氣郁結(jié),阻礙氣機,脾失健運,水濕內(nèi)停,導(dǎo)致高脂血癥的發(fā)生。姚魁武教授在傳承薛教授學(xué)術(shù)思想基礎(chǔ)上,以二陳湯合越鞠丸加減組成解郁祛痰化濁方,臨床治療氣郁痰阻型高脂血癥效果良好。但解郁祛痰化濁方發(fā)揮臨床作用的機制未明。本研究旨在探討解郁祛痰化濁方干預(yù)高脂飲食大鼠腸道菌群的多樣性及對相關(guān)血清學(xué)指標的影響。

      1 材料

      1.1 動物 雄性SPF級別Wistar大鼠70只,體質(zhì)量(200±20)g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2016-0006,所有動物飼養(yǎng)在中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動物房清潔級環(huán)境內(nèi),室溫控制在21~24℃,相對濕度維持在40%~50%,光照12 h(白日光照12 h,夜間黑暗12 h),自由取食動物飲用水,大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,稱重,剔除異常大鼠。

      1.2 實驗藥品 解郁祛痰化濁方組成:香附10 g,陳皮 8 g,法半夏 9 g,茯苓 10 g,蒼術(shù) 10 g,砂仁 5 g,神曲15 g,焦山楂15 g,炒梔子10 g,川芎9 g。由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院藥劑科提取,濃縮制成顆粒劑。立普妥片(輝瑞制藥有限公司,批號:AL6069);血脂康膠囊(北京北大維信生物科技有限公司,批號:20180204)。解郁祛痰化濁方的臨床用量參照《藥理實驗方法學(xué)》[3],故所對應(yīng)的中劑量顆粒劑為0.8 g/kg。低劑量組為0.4 g/kg,高劑量組為1.6 g/kg。立普妥組為2 mg/kg。血脂康組為0.1 g/kg。

      1.3 試劑 水合氯醛(國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司);10%中性福爾馬林、無水乙醇(致遠化學(xué)科技有限公司);TIANGEN糞便基因組 DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司);KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase(美國 KAPA Biosystems公司);Midori Green Advance DNA Stain(德國 Midori Greeng公司);AMPure XP(德國Beackman公司)。

      1.4 儀器 DW-25L92超低溫保存箱(海爾生物醫(yī)療);VORTEX-5渦旋振蕩儀(美國Scientific Industries公司);Centrifuge 581015810R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);2720熱循環(huán)PCR儀(中國賽默飛世爾科技有限公司);Alpha凝膠成像系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司);Hiseq2500/1500測序儀(美國Illumina公司)。

      2 方法

      2.1 高脂血癥大鼠模型的制備及給藥 70只SPF大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,采用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、血脂康組、立普妥組、解郁祛痰化濁方低、中、高劑量組,每組 10只。正常組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)飼料由斯貝爾(北京)生物技術(shù)有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2015-0015,其余組 給予高脂飼料。飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2019-0008。喂養(yǎng)期間自由攝食、飲水12周,建立高脂血癥動物模型。在飼喂12周后,解郁祛痰化濁方劑量低、中、高劑量分別灌胃給予0.8、0.4、1.6 g/kg,立普妥組予立普妥2 mg/kg,血脂康組予血脂康0.1 g/kg,正常組和模型組大鼠灌胃同等量蒸餾水,8周后取材。

      2.2 大鼠血液生化指標的測定 在藥物干預(yù)8周后,大鼠腹主動脈采血4~6 mL檢測血清中測膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)的含量。

      2.3 糞便取樣與檢測 藥物干預(yù)8周后取材,收集大鼠糞便將其放入-80℃冰箱中保存,進行大鼠糞便總DNA提取建庫及質(zhì)檢,擴增16S V3-4區(qū)等16S rRNA基因測序檢測。

      2.4 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析計算,結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示。數(shù)據(jù)若符合正態(tài)分布及方差齊,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間多重比較采用LSD-t檢驗;若不符合正態(tài)分布或方差齊,組間比較采用秩和檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      3 結(jié)果

      3.1 大鼠體質(zhì)量的測定 稱取給藥8周后大鼠的體質(zhì)量,觀察每組大鼠的體質(zhì)量的變化。如表1,與正常組比較,模型組大鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.01)。藥物干預(yù)8周后,與模型組比較,血脂康組、解郁祛痰化濁方低、高劑量組大鼠體質(zhì)量明顯下降(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

      表1 各組大鼠體質(zhì)量變化(±s)Tab.1 Changes in body weight of rats in each group(±s)g

      表1 各組大鼠體質(zhì)量變化(±s)Tab.1 Changes in body weight of rats in each group(±s)g

      注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05。

      組別 動物數(shù) 體質(zhì)量正常組 10 506.50±33.87模 型 組 10 618.50±54.19*血脂康組 10 568.86±46.01#立普妥組 10 578.50±31.62解郁祛痰化濁方低劑量組 10 568.42±38.99#解郁祛痰化濁方中劑量組 10 590.13±41.29解郁祛痰化濁方高劑量組 10 569.00±20.14#

      3.2 血脂4項結(jié)果 如表2,同正常組比較,模型組大鼠血脂4項TC、TG、LDL-C均見明顯升高,HDL-C降低(P<0.01)。同模型組比較,血脂康組TC、TG顯著性下降(P<0.01),HDL-C升高(P<0.05)、立普妥組 TC、TG明顯降低(P<0.01);中藥低劑量組TC、TG顯著降低(P<0.01);解郁祛痰化濁方中劑量組 TC、TG、LDL-C 顯著降低(P<0.01),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;解郁祛痰化濁方高劑量組 TC、TG顯著降低(P<0.01),HDL-C 升高(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

      表2 大鼠血脂4項結(jié)果(±s)Tab.2 Results of four items of blood lipid in rats(±s)mmol/L

      表2 大鼠血脂4項結(jié)果(±s)Tab.2 Results of four items of blood lipid in rats(±s)mmol/L

      注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

      組別 動物數(shù) TC TG HDL-C LDL-C正常組 10 2.26±0.38 0.90±0.25 1.33±0.19 0.57±0.92模 型 組 10 3.22±0.75* 1.69±0.28* 0.89±0.10* 1.02±0.39*血脂康組 10 2.52±0.30## 1.14±0.34## 1.17±0.41# 1.00±0.13立普妥組 10 2.20±0.18## 1.16±0.19## 0.99±0.23 0.90±0.16解郁祛痰化濁方低劑量 10 2.51±0.29## 1.03±0.21## 1.02±0.16 1.25±0.25解郁祛痰化濁方中藥中劑量 10 2.12±0.27## 1.01±0.29## 1.09±0.24 0.77±0.16##解郁祛痰化濁方中藥高劑量 10 2.46±0.15## 1.08±0.24## 1.24±0.22## 1.06±0.23

      3.3 物種結(jié)構(gòu)分析 基于豐度前15的物種進行樣本間的物種組成差異分析,從門層次結(jié)構(gòu)分類上看,大鼠腸道菌群相對豐度中前5位的主要的菌種為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門。從綱層次結(jié)構(gòu)分類上看,主要的菌群主要有梭菌綱、芽孢桿菌綱、擬桿菌綱、丹毒絲菌綱、變形菌綱。從目層次結(jié)構(gòu)分類上看,主要的菌群包括梭菌、乳桿菌、擬桿菌、丹毒絲菌、脫硫弧菌。從科層次結(jié)構(gòu)分類上看,前五位的菌群是毛螺菌科、瘤胃球菌科、乳桿菌科、韋榮球菌科、擬桿菌S24-7。從屬層次菌落結(jié)構(gòu)圖上看主要為:布勞特氏菌屬、乳桿菌屬、瘤胃菌UCG-005等。見圖1。

      圖1 物種在門、綱、目、科、屬各層次上的分類結(jié)果Fig.1 Classification results of species at the levels of phylum,class,order,family,and genus

      3.4 厚壁菌門、擬桿菌門的表達 LEfSe采用線性判別分析(LDA)來估算每個組分(物種)豐度對差異效果影響的大小,在組與組之間尋找組間差異顯著的物種。結(jié)果在菌門中得出差異:正常組厚壁菌門較模型組低(P<0.01),擬桿菌門較模型組高(P<0.01)。擬桿菌門解郁祛痰化濁方中劑量組較模型組增高(P<0.05)。F/B模型組顯著高于正常組(P<0.01),解郁祛痰化濁方中劑量組低于模型組(P<0.01),見圖2。

      圖2 厚壁菌門,擬桿菌門及F/B箱型圖Fig.2 Firmicutes,Bacteroidetes and F/B box plots

      4 討論

      國醫(yī)大師薛伯壽認為氣郁痰阻為血脂異常當下的主要病理因素,嗜食肥甘厚味者,膏脂積存胃中,脾臟轉(zhuǎn)輸不及,變?yōu)樘禎岱e存胃中,影響氣血生化。肝膽脾胃同居中焦,肝膽疏泄有度,脾胃才能運化正常,今脾胃痰濁雍滯,升降失常,肝膽疏泄之氣受到影響,亦會出現(xiàn)雍滯,從而病變涉及肝膽,出現(xiàn)土壅木郁之狀況。在此認識的基礎(chǔ)上,姚魁武教授依據(jù)薛教授經(jīng)驗,創(chuàng)立解郁祛痰化濁方在臨床中治療血脂異常,效果顯著。該方由越鞠丸加二陳丸化裁而成,越鞠丸疏解六郁,二陳湯祛痰理氣,兩者合用共奏解郁祛痰,化濁調(diào)氣之效。研究表明[4]腸道菌群生物物種豐度度降低與血脂異常相關(guān)。根據(jù)本實驗物種結(jié)構(gòu)分析中,發(fā)現(xiàn)正常組與模型組大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯差異,高脂飲食誘使大鼠腸道菌群的物種多樣性及豐度顯著下降,經(jīng)各藥物組干預(yù)后物種的多樣性較模型組均增高。

      短鏈脂肪酸其受體在激活后能促進脂肪細胞的分化,影響脂質(zhì)沉積和體質(zhì)量情況[5]。模型組大鼠的血脂4項TC、TG、LDL-C均見明顯升高,HDL-C降低,說明高脂血癥大鼠造模成功。同模型組比較,在藥物干預(yù)8周后,發(fā)現(xiàn)各用藥組可明顯調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血脂水平,TC、TG均可見顯著降低,另外解郁祛痰化濁方中劑量組顯著降低LDL-C水平,解郁祛痰化濁方高劑量組以及血脂康組可提高HDL-C水平。牟菲等[6]發(fā)現(xiàn)高脂血癥組與非高脂血癥組患者腸道菌群有30個差異菌群,而擬桿菌屬為高脂血癥與非高脂血癥間的關(guān)鍵菌群。據(jù)研究,F(xiàn)/B值的升高與肥胖密切相關(guān),F(xiàn)/B比值越高,產(chǎn)生的氧化三甲胺(TMAO)越多,而TMAO可以促進肝臟脂肪變性、膽固醇代謝失衡等的發(fā)生[7-8]。另有文獻指出,從心論治方可以調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠的血脂水平,在腸道菌群中提高擬桿菌門[9]。小檗堿可通過調(diào)節(jié)腸道微生物降低厚壁門的比例,從而降低血脂水平、減低體質(zhì)量[10]。由此可見擬桿菌門與厚壁菌門在調(diào)脂方面的重要性。本實驗發(fā)現(xiàn)血脂康組,解郁祛痰化濁方低劑量組、高劑量組大鼠體質(zhì)量均下降。統(tǒng)計所有樣本在門類上的分類結(jié)果,從門層次結(jié)構(gòu)分類上看,大鼠腸道菌群相對豐度中前5位的主要的菌種為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門。LDA組間差異分析發(fā)現(xiàn)中藥組的F/B值與模型組相比顯著降低,且解郁祛痰化濁方中劑量組的比值最接近于正常組,同時模型組厚壁菌門多于擬桿菌門,這與上述研究結(jié)果相一致,解郁祛痰化濁方可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群F/B的豐度從而改善血脂水平,降低體質(zhì)量。

      脂質(zhì)代謝異常作為心血管疾病的重要接觸點,本實驗結(jié)果分析了高脂飲食大鼠腸道菌群的物種結(jié)構(gòu),統(tǒng)計樣本在門、綱、目、科、屬各層次上的分類結(jié)果。同時證實了解郁祛痰化濁方以氣郁痰阻為病機立方,可以調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠血脂,降低體質(zhì)量,調(diào)節(jié)F/B的比值及其他菌群多樣性。

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