淺析外泌體參與針刺調(diào)節(jié)作用的特點(diǎn)分析*

王美娟 ，李檸岑 ，陳波 ，2，3，陳勇 ，楊克儉 ，張靖宇 ，單凱 ，陳澤林 ，2，3，郭義 ，3，4

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)研究中心，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，天津 301617；3.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381；4.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 301617）

針灸是中醫(yī)的重要組成部分，也是世界衛(wèi)生組織（WHO）認(rèn)可的安全高效療法，目前已在世界近200個(gè)國家和地區(qū)使用，可治療百余種病種[1]。不同于西藥單一靶向的耦合反應(yīng)，針灸療法可從整體層面和宏觀角度來調(diào)節(jié)機(jī)體狀態(tài)，產(chǎn)生廣泛而長遠(yuǎn)的療效。針灸作為一種良性應(yīng)激源刺激，具有不同于藥物的特點(diǎn)，它不是“點(diǎn)-點(diǎn)”直接針對病原體及患病的組織器官，而是通過啟動(dòng)內(nèi)源性自穩(wěn)調(diào)控系統(tǒng)“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)”（NEI network）對機(jī)體發(fā)揮多水平、多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用。

過往針灸基礎(chǔ)研究多關(guān)注于“干預(yù)-效應(yīng)”兩點(diǎn)之間的線性關(guān)系，忽略針灸作為復(fù)雜干預(yù)產(chǎn)生的整體網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用，嚴(yán)重制約了針灸學(xué)科的發(fā)展，使得基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用脫節(jié)，針灸科研成果轉(zhuǎn)化不足。

外泌體是一種由細(xì)胞釋放的直徑約30～200 nm的膜性囊泡，作為機(jī)體網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系的重要載體與運(yùn)輸方式，可以參與機(jī)體多種生理病理過程[2-3]。前期通過實(shí)驗(yàn)研究[4]發(fā)現(xiàn)，針刺可調(diào)節(jié)外泌體釋放，且外泌體與針效之間存在密切關(guān)系，外泌體作為神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫細(xì)胞間相互通訊的重要載體，可能在針刺網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。對外泌體的特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)分析，發(fā)現(xiàn)外泌體來源分布廣、運(yùn)載物質(zhì)多、產(chǎn)生效應(yīng)多，并可靶向與細(xì)胞結(jié)合，運(yùn)載與疾病相關(guān)的靶標(biāo)物質(zhì)，臨床應(yīng)用安全穩(wěn)定，可能與針刺作用密切相關(guān)[5]。它獨(dú)特的生理學(xué)結(jié)構(gòu)與功能，在針刺信息傳遞中具有很多優(yōu)勢，為實(shí)現(xiàn)針刺信息在體液途徑遠(yuǎn)距離、精準(zhǔn)靶向傳遞提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。因此筆者從外泌體入手，探究其生物學(xué)功能，整理分析外泌體與針刺作用特點(diǎn)的相關(guān)性，以期更好地揭示針灸作用機(jī)制和促進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化。

1 外泌體可能是針刺整體及網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的重要載體

外泌體于1987年由Johnstone首次在成熟的哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[6]。幾乎所有活細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，如間充質(zhì)干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、人羊膜上皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等不同類型的細(xì)胞[7]。其主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷而形成的多囊泡體，在多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中，且外泌體在體液中的分布十分廣泛，研究發(fā)現(xiàn)[8-10]唾液、心包積液、乳汁、尿液、腹水、羊水、腦脊髓液和血液等多種體液中都存在著外泌體。外泌體運(yùn)載物質(zhì)種類豐富，包含有蛋白質(zhì)如細(xì)胞骨架蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白、代謝酶類、抗原結(jié)合提呈相關(guān)蛋白等共9 769種，核酸組分mRNA、miRNA、IncRNA、mtRNA、circRNA 等6246種，脂質(zhì)組分如鞘磷脂、磷脂類、神經(jīng)酰胺和三酰甘油等共1 116種[11]。以肥大細(xì)胞為例，僅肥大細(xì)胞來源的外泌體就可以運(yùn)載高達(dá)1 988種蛋白質(zhì)，397個(gè)lncRNA和272個(gè)miRNA[12]。

整體性是中醫(yī)核心理論整體觀念的具體表現(xiàn)，針灸作用也具有整體性的特點(diǎn)，臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，針灸可以調(diào)整呼吸、消化、循環(huán)、泌尿、神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等各系統(tǒng)的異常功能，針灸對某一臟器的調(diào)整作用是通過對該臟器所屬系統(tǒng)甚至全身系統(tǒng)功能多層次、多水平的總體調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)的，從穴位至全身，由點(diǎn)及面，通過刺激體表腧穴達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體整體狀態(tài)的作用[13]。針灸作用于穴位后，首先激活針灸穴位微環(huán)境小網(wǎng)絡(luò)，使針灸信息在穴位局部啟動(dòng)并級聯(lián)放大，進(jìn)而調(diào)動(dòng)人體自身調(diào)節(jié)大網(wǎng)絡(luò)——NEI network，經(jīng)調(diào)控，針灸效應(yīng)信息輸出到靶器官，調(diào)整疾病網(wǎng)絡(luò)，產(chǎn)生針灸療效，三網(wǎng)聯(lián)動(dòng)，糾正疾病的失衡狀態(tài)，恢復(fù)機(jī)體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，達(dá)到“中和”狀態(tài)[14]，產(chǎn)生針灸的整體調(diào)節(jié)作用。以NEI network為基礎(chǔ)的經(jīng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)是人體維持自穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)基礎(chǔ)，是機(jī)體網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的核心環(huán)節(jié)。神經(jīng)系統(tǒng)是經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的核心部分，同時(shí)還涵蓋了包括血液、淋巴、內(nèi)分泌、免疫等等多系統(tǒng)的內(nèi)容，是由多系統(tǒng)構(gòu)成的一個(gè)多水平、多層次、多靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)體系。

著眼于臟腑功能的整體變化，而生命活動(dòng)的內(nèi)在本質(zhì)是細(xì)胞活動(dòng)，整體宏觀與微觀局部密不可分，微觀的動(dòng)態(tài)變化也往往反映整體的變化。外泌體產(chǎn)生異常的蛋白質(zhì)、分子等靶基因，提示人體內(nèi)部微環(huán)境發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而表現(xiàn)出不同的癥狀。外泌體無所不在、無處不去的普適性特點(diǎn)也可能為針刺穴位信息的廣泛性提供一定支撐，如外泌體可攜帶多種靶向物質(zhì)以血液、淋巴循環(huán)等方式到達(dá)肝臟、脾臟等多個(gè)臟器發(fā)揮相應(yīng)的治療作用。同時(shí)以電針足三里穴治療佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠為研究平臺[15]，重點(diǎn)關(guān)注血清外泌體及內(nèi)含物的變化，以神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)為切入點(diǎn)，以蛋白組學(xué)為重要手段，從總體上把握疾病狀態(tài)針刺前后血清外泌體及其內(nèi)含物的整體變化情況，抓兩頭看中間，結(jié)合海量的蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)以及復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析篩選出針刺后關(guān)鍵信號蛋白和重要通路，探討電針治療佐劑性關(guān)節(jié)炎鎮(zhèn)痛抗炎的作用規(guī)律[16]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)針刺血清外泌體運(yùn)載蛋白存在時(shí)效、量效差異變化，可能作為具有潛在的針灸廣譜性效應(yīng)物質(zhì)，產(chǎn)生小刺激、大反應(yīng)的效應(yīng)。外泌體及其內(nèi)含物質(zhì)作為神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等細(xì)胞間相互通訊的重要載體，可能在針刺信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，為針刺的整體、網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)提供生物學(xué)基礎(chǔ)。

2 外泌體的靶向運(yùn)輸為針刺的“氣至病所”提供生物學(xué)基礎(chǔ)

外泌體在生物體中的細(xì)胞間交流發(fā)揮重要作用，其所攜帶的大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸等生命信息需遵循生物體運(yùn)行的有序性，否則會導(dǎo)致信息傳遞的錯(cuò)亂，破壞生物體內(nèi)平衡，故外泌體在體內(nèi)的運(yùn)輸具有一定的靶向性[17]。研究表明，在外泌體表面有一種“郵政編碼”—整合素，可以使外泌體去特定器官進(jìn)行累積，改變其微環(huán)境進(jìn)一步在相應(yīng)部位發(fā)生轉(zhuǎn)移[18]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞分泌的外泌體擁有不同的整合素類型，從而在運(yùn)輸過程中靶向不同的器官，影響特定器官轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成，因此外泌體可能具有天然的靶向特定組織的特性，并且可以通過修改其生產(chǎn)細(xì)胞系重新改變其選擇性。如研究發(fā)現(xiàn)腫瘤可以向肝、肺等其他器官轉(zhuǎn)移，原因在于外泌體表面有不同的整合素，ITGα6β4及ITGα6β1這類整合素傾向于肺內(nèi)組織移動(dòng)，引起組織器官內(nèi)蛋白水平的變化，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，使成纖維細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分化，重塑細(xì)胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，引發(fā)血管生成，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[19]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，針刺可使腫瘤化療藥物導(dǎo)航聚焦，黃金昶團(tuán)隊(duì)[20]發(fā)現(xiàn)針刺療法聯(lián)合紫杉醇在干預(yù)后能夠調(diào)節(jié)腫瘤微血管和微環(huán)境，使小鼠后瘤體紫杉醇濃度顯著增加，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。有學(xué)者提出可以運(yùn)用針灸“靶向”思維輔助治療腫瘤或腫瘤相關(guān)癥狀，針刺穴位以引導(dǎo)化療藥物趨向靶病灶、調(diào)節(jié)預(yù)防和治療癌后的不良反應(yīng)等[21]。針刺還可“以針促藥”治療皮膚損傷，臺灣大學(xué)研究所發(fā)現(xiàn)在治療大鼠糖尿病的皮膚傷口時(shí)，在傷口上用一種水凝膠生物材料聯(lián)合在傷口周圍針刺可使其達(dá)到（90.34±2.30）%的傷口閉合率，針刺通過激活補(bǔ)體C3a和補(bǔ)體C5a，增加細(xì)胞因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的分泌，以及下調(diào)促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素（IL）-1β，改善局部微環(huán)境，提高藥物利用率，從而加速組織再生，促進(jìn)傷口愈合[22]。本團(tuán)隊(duì)前期[23]通過非標(biāo)定量法蛋白組學(xué)技術(shù)對針刺血清外泌體內(nèi)含蛋白的分泌細(xì)胞或組織來源進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要存在于血漿、炎細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑液、腦脊液、腺體組織和肌肉中，在病變部位表達(dá)含量的增加，可能與外泌體這一特性有關(guān)，推測外泌體可使關(guān)節(jié)局部微環(huán)境發(fā)生改變，以病變局部為需求，針刺有效成分靶向性移動(dòng)，而“氣至病所”。同時(shí)外泌體是具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的囊泡，其脂質(zhì)密封結(jié)構(gòu)可以保護(hù)相關(guān)信號分子在體內(nèi)傳遞過程中不被降解，為遠(yuǎn)距離靶向運(yùn)輸提供穩(wěn)定的生物學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時(shí)能保證外泌體在針刺信息傳遞過程中，將針灸刺激信號更加完整的傳導(dǎo)到網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中，使針灸作用充分被機(jī)體調(diào)整和利用，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離靶向運(yùn)輸[24]。

3 外泌體運(yùn)載的特異性分子為臟腑-經(jīng)穴相關(guān)提供研究思路

來源于不同的組織或細(xì)胞的外泌體有不同遺傳物質(zhì)，其膜蛋白也有一定特異性，在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間信息交流的同時(shí)，同時(shí)也可間接反映母體細(xì)胞所屬器官和系統(tǒng)的生理病理狀態(tài)。如Laulagnier等[25]在肥大細(xì)胞分泌的外泌體中首先發(fā)現(xiàn)了具有肥大細(xì)胞特征的脂質(zhì)。外泌體miR-301a在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者血清中表達(dá)升高，其升高程度與膠質(zhì)瘤的病理分級具有相關(guān)性，反映了膠質(zhì)瘤患者的腫瘤狀態(tài)和病理變化，提示血清外泌體miR-301a表達(dá)可作為膠質(zhì)瘤診斷的新新型生物標(biāo)志物，并作為晚期病變的預(yù)后因素[26]。另外結(jié)腸上皮細(xì)胞來源的外泌體膜表面多為A33蛋白，抗原提呈細(xì)胞來源-T細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體表面多為MHCI、MHC-Ⅱ、CD86蛋白[27]。

“臟腑-經(jīng)穴相關(guān)”為內(nèi)臟器官生理或病理性的改變，可在體表有所反應(yīng)；外界環(huán)境改變或人為刺激體表某些部位或穴位，也能引起相關(guān)內(nèi)臟功能的改變，從而起到治療和調(diào)整作用。外泌體可攜帶特異性生物信息分子，全身廣泛分布，既能反映機(jī)體生理和病理的變化，又能作為治療疾病的靶點(diǎn)，與“臟腑-經(jīng)穴相關(guān)”相似。如馬榮麗等[28]認(rèn)為隨著腎功能的改變，由不同腎細(xì)胞分泌其外泌體，執(zhí)行不同的生物功能來調(diào)控骨組織。每種外泌體都帶有特定的區(qū)分標(biāo)志物，能靶向特定的位點(diǎn)，從多個(gè)方面分析“腎主骨”理論外泌體相關(guān)指標(biāo)，認(rèn)為這些指標(biāo)可能是“腎主骨”理論的物質(zhì)基礎(chǔ)，反映整個(gè)臟象功能。

4 針刺血清外泌體可為針刺基礎(chǔ)研究臨床轉(zhuǎn)化提供思路

外泌體自體分泌，免疫原性反應(yīng)低，是一種安全穩(wěn)定的藥物載體，同時(shí)還具有器官特異性分布的靶向特點(diǎn)，使得其向細(xì)胞的滲透能力提高，在提高藥物的利用度、延長藥物作用時(shí)間、實(shí)現(xiàn)藥物靶向定位以及降低藥物毒副作用等方面有一定潛在應(yīng)用價(jià)值。與基于脂質(zhì)體和基于聚合物的外源性藥物載體相比，外泌體由自體活細(xì)胞分泌，在生物相容性、免疫原性、穩(wěn)定性、藥代動(dòng)力學(xué)、生物分布和細(xì)胞攝取機(jī)制等方面顯示出許多優(yōu)勢，是天然的轉(zhuǎn)運(yùn)體，適于重復(fù)多次給藥，且不會造成治療性物質(zhì)在肝臟的累積。且外泌體能將攜帶的遺傳物質(zhì)直接傳遞進(jìn)入細(xì)胞，有效避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識別和清除，避免其在細(xì)胞外環(huán)境中被清除。目前，全球數(shù)十家公司正在研究開發(fā)改造外泌體的新技術(shù)，且已開始使用純凈的外泌體產(chǎn)品和工程化的外泌體產(chǎn)品進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

外泌體在臨床上應(yīng)用也逐漸廣泛，上海交大附屬醫(yī)院證實(shí)來自富血小板血漿的外泌體在糖尿病大鼠中通過激活YAP促進(jìn)慢性皮膚傷口的上皮再形成[29]；在BALB/c小鼠的全層皮膚缺損傷口上，經(jīng)血清外泌體處理后，小鼠傷口愈合可加快[30]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)對膿毒癥小鼠注入外泌體拮抗劑GW4869，抑制了電針治療膿毒癥小鼠的療效[31]，回輸正常小鼠電針后的血清外泌體，可產(chǎn)生“針刺樣”作用。腹腔回輸正常大鼠電針后的血清外泌體對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠也明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[32]，提示血清外泌體可作為一種生物制劑進(jìn)行開發(fā)研究。

5 小結(jié)

外泌體分布廣、來源廣、運(yùn)載物質(zhì)多、產(chǎn)生效應(yīng)多、靶向運(yùn)輸、組織來源特異性、臨床應(yīng)用安全穩(wěn)定等特點(diǎn)，可能與針灸整體網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)、“氣至病所”、臟腑-經(jīng)穴相關(guān)、針灸血清藥轉(zhuǎn)化應(yīng)用等特點(diǎn)密切相關(guān)。在針刺多水平、多途徑、多靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)過程中，外泌體及其運(yùn)載物質(zhì)可能是重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，充分利用高通量組學(xué)技術(shù)與方法進(jìn)行研究是打開針刺起效機(jī)制的重要途徑。但目前對于外泌體參與針刺調(diào)節(jié)的機(jī)制仍有待探索。針灸刺激會產(chǎn)生雙向良性調(diào)節(jié)，能對生理病理過程功能產(chǎn)生反向調(diào)節(jié)，所產(chǎn)生的效果取決于機(jī)體本身的表現(xiàn)，外泌體是否以及如何參與其中尚不清楚。以及網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)是針灸作用的最主要特點(diǎn)，雖然肯定了外泌體可能參與NEI network調(diào)節(jié)過程，但其作用機(jī)制是什么未來還需要進(jìn)一步研究。來源于針刺血清外泌體的新藥發(fā)現(xiàn)與開發(fā)策略，可能為探索出從實(shí)驗(yàn)室到臨床的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)模式，促進(jìn)臨床療效最大化，提高針灸應(yīng)用水平提供有力證據(jù)。