HER2陽性乳腺癌ERBB3基因E928G點(diǎn)突變功能的初步研究

韋光楠，廖寧，陳博

(1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州 510006； 2.廣東省人民醫(yī)院 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院乳腺外科，廣州 510080)

根據(jù)全球流行病學(xué)調(diào)查顯示，乳腺癌在女性中的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。其中人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor,HER)2過表達(dá)型發(fā)病率為15%～20%，因易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差?？笻ER2靶向藥物治療的效果較好，但腫瘤耐藥的發(fā)生大大縮短了患者的生存期[2-3]。HER3/ERBB3作為HER家族中的一員，能與HER2形成異源二聚體，該二聚體在HER家族異源二聚體中活性最強(qiáng)。HER2/HER3異源二聚體的形成能激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化[4-5]。當(dāng)ERBB3形成異二聚體且被磷酸化后，胞內(nèi)暴露出的6個(gè)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)亞基結(jié)合位點(diǎn)能夠募集PI3K至調(diào)節(jié)亞基位點(diǎn)，進(jìn)而激活下游PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤耐藥的發(fā)生[6]。因此，ERBB3基因作為乳腺癌治療的另一個(gè)可行靶點(diǎn)越來越受到重視[7]。CLEOPATRA臨床研究發(fā)現(xiàn)，ERBB3過表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)，但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ERBB3并不能預(yù)測(cè)藥物治療對(duì)患者是否獲益[8-9]。在基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)ERBB3錯(cuò)義突變能增強(qiáng)ERBB2/ERBB3異源二聚體的活性，從而促進(jìn)腫瘤生長，導(dǎo)致抗HER2治療耐藥的發(fā)生[10]。目前對(duì)于ERBB3基因在乳腺癌中的研究結(jié)果尚不統(tǒng)一，對(duì)乳腺癌的治療效果仍不明確[11-12]。因此，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ERBB3基因突變可能對(duì)乳腺癌細(xì)胞造成的影響，為后續(xù)進(jìn)一步研究ERBB3基因在乳腺癌細(xì)胞中的作用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2017年6月至2019年5月就診于廣東省人民醫(yī)院經(jīng)病理確診為乳腺癌的患者384例。免疫組織化學(xué)雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體任一項(xiàng)陽性定義為激素受體(hormone receptor,HR)陽性，其中HR-/HER2-患者50例，HR-/HER2+患者43例，HR+/HER2-患者227例，HR+/HER2+患者64例。本研究獲得廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑 Nextseq500測(cè)序平臺(tái)(美國Illumina公司)，高速離心機(jī)Z230MR(德國HERMLE公司)，Bio-Rad T100聚合酶鏈反應(yīng)儀、中型垂直電泳系統(tǒng)、B107蛋白印跡成像分析系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司，細(xì)胞培養(yǎng)二氧化碳孵育箱和超凈工作臺(tái)(美國Thermo公司)，DKZ-1恒溫水浴箱(上海一恒科技有限公司)，JY96-IIN超聲裂解細(xì)胞儀(上海滬析公司)。核酸提取及純化試劑盒、基因測(cè)序用文庫試劑盒均購自美國Agilent公司，杜爾貝科改良伊格爾高糖培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：P0010S)、3-磷酸甘油醛脫氫酶內(nèi)參抗體(批號(hào)：AF1186)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配置試劑盒(批號(hào)：P0012A)均購自上海碧云天公司，磷酸化ERBB3(Tyr1289)抗體(美國Affinity公司生產(chǎn)，批號(hào)：DF7597)，磷酸化Akt(Ser473)抗體(批號(hào)：4060T)、Akt抗體(批號(hào)：4691S)均購自美國Cell Signaling Technology公司，ECL熒光檢測(cè)試劑(北京索萊寶公司生產(chǎn)，批號(hào)：PE0010)。人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞株BT474-V1、SKBR3-V1，ERBB3基因正常表達(dá)的人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞株BT474-C1、SKBR3-C1，ERBB3基因E928G突變的人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞株BT474-M1、SKBR3-M1均由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.2基因組DNA提取 石蠟包埋組織樣本在提取核酸前進(jìn)行組織脫蠟，新鮮組織樣本無需進(jìn)行此步驟。新鮮組織標(biāo)本研磨成小顆粒，石蠟包埋組織標(biāo)本脫蠟后研磨，加入細(xì)胞裂解液，充分混勻后加入蛋白酶K，水浴加熱至完全溶解，加入核糖核酸酶A，水浴1 h迅速降溫，加入蛋白沉淀液離心，取上清液加入異丙醇，離心，棄上清液，加入70%乙醇沖洗DNA沉淀，離心棄去上清液，加入DNA溶解液水浴溶解DNA。樣本質(zhì)量要求核酸總量>50 ng為合格品，DNA純度A260/A280為1.7～2.1。

1.2.3上機(jī)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 引物設(shè)置為寡核苷酸，模板為文庫片段進(jìn)行DNA的復(fù)制，復(fù)制完成后將文庫片段洗脫，采用邊合成邊測(cè)序，在Read1完成后，解鏈并洗掉測(cè)序中合成的部分，加入Index引物，繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制，讀出接頭中Index序列，從而得出每個(gè)位點(diǎn)的DNA所屬文庫。本研究測(cè)序范圍覆蓋520個(gè)癌癥相關(guān)基因的基因組進(jìn)行分析，對(duì)于目的基因ERBB3的檢測(cè)包括拷貝數(shù)變異、基因融合、單核苷酸變異、插入或缺失等。

1.2.4Western blot檢測(cè)磷酸化Akt水平 采用胰酶分別消化細(xì)胞株BT474-V1、SKBR3-V1、BT474-C1、SKBR3-C1、BT474-M1、SKBR3-M1，在培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)基，移液槍吹打成細(xì)胞懸液后轉(zhuǎn)移至EP管中，2 500 r/min離心5 min，棄去上清液。磷酸鹽緩沖溶液吹打洗滌細(xì)胞，繼續(xù)離心，再重復(fù)磷酸鹽緩沖溶液洗滌1次。在每管細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液置于冰上裂解5 min，再將每管置于超聲裂解細(xì)胞儀繼續(xù)裂解。取上清液分裝于0.5 ml離心管。本實(shí)驗(yàn)采用BCA法測(cè)蛋白濃度，具體操作流程嚴(yán)格按照試劑盒流程執(zhí)行并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)蛋白濃度。采用凝膠試劑盒操作說明進(jìn)行凝膠的配置。待測(cè)樣品中加入Loading buffer混勻后，金屬浴100 ℃ 5 min。每孔上樣量12 μl后連接電源正負(fù)極進(jìn)行電泳，初始先將電流設(shè)置為80 V電泳20 min后，增大電壓至120 V繼續(xù)電泳，總時(shí)長為2.5 h。電泳結(jié)束后開始電轉(zhuǎn)膜，調(diào)整電流至250 mA，電壓100～120 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為4 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，加入封閉液室溫封閉1 h。一抗按照說明書稀釋后，搖床上4 ℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后，在室溫下Tris-Hcl緩沖液洗膜3次，再加入與一抗相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h。孵育結(jié)束后，繼續(xù)用Tris-Hcl緩沖液洗膜3次。ECL工作液處理后，置于蛋白印跡ECL-過氧化物酶成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用PROVEAN、SIFT及Poly-Phen-2 HumVar生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)點(diǎn)突變對(duì)蛋白質(zhì)改變產(chǎn)生的危害性。PROVEAN軟件評(píng)分為-14～-2.5定義為有害突變，-2.5～14定義為良性改變；SIFT軟件評(píng)分>0.05定義為中性，<0.05定義為有害突變；Poly-Phen-2 HumVar軟件評(píng)分為0～0.446定義為中性，0.910～1.00定義為可能有害[13-14]。

2 結(jié) 果

2.1HER家族變異分布情況 384例患者中133例檢出HER家族變異(包括表皮生長因子受體1、ERBB2、ERBB3、ERBB4)。表皮生長因子受體1變異頻率為1.3%(5/384)；ERBB2變異頻率最高，為28.9%(111/384)，其中ERBB2擴(kuò)增103例，ERBB2突變14例，同一患者的ERBB2基因可同時(shí)存在多種變異類型；ERBB3變異頻率為3.4%(13/384)；ERBB4變異頻率為1.0%(4/384)。

2.2ERBB3基因變異患者的一般情況 13例ERBB3基因患者年齡22～80歲，中位年齡54歲，年齡≥50歲8例，年齡<50歲5例；月經(jīng)狀態(tài)：絕經(jīng)前6例，絕經(jīng)后7例；病理類型：浸潤性導(dǎo)管癌11例，浸潤性小葉癌1例，浸潤性混合型癌1例；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)2例，Ⅱ級(jí)5例，Ⅲ級(jí)6例；腫瘤大?。篢17例，T25例，T31例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)：N010例，N11例，N21例，N31例；臨床分期： Ⅰ A 5例， Ⅱ A 6例，ⅢA 1例，ⅢC 1例；ER狀態(tài)：ER+10例，ER-3例；HER2狀態(tài)：HER2+3例，HER2-10例；HR/HER2狀態(tài)：HR+/HER2-7例，HR+/HER2+3例，HR-/HER2-3例，無HR-/HER2+患者。

2.3乳腺癌ERBB3基因變異類型 本研究中檢測(cè)到ERBB3常見的突變類型為錯(cuò)義突變，此外還有擴(kuò)增、內(nèi)含子突變。突變的熱點(diǎn)主要集中在胞外結(jié)構(gòu)域Ⅱ以及激酶區(qū)，突變的熱點(diǎn)為V104L、E928G，見圖1。13例患者中有12例為ERBB3基因錯(cuò)義突變(其中1例患者ERBB3基因發(fā)生G284A、E928G兩個(gè)位點(diǎn)的錯(cuò)義突變)，1例患者檢測(cè)到ERBB3基因擴(kuò)增。在12例基因錯(cuò)義突變患者中，有1例患者檢測(cè)到ERBB3基因內(nèi)含子突變。本研究檢測(cè)到的新突變位點(diǎn)為N522S、S300F、R678W、M760R、Q1301*。

注：Mutations為突變，ERBB3為人表皮生長因子受體3

2.4ERBB3基因突變蛋白功能損傷預(yù)測(cè) PROVEAN、SIFT及Poly-Phen-2生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)點(diǎn)突變對(duì)蛋白質(zhì)改變產(chǎn)生的危害性，結(jié)果顯示，D297Y、T355I、E928G、E1261A、L431F、P583S、R667L、D297H、R678W位點(diǎn)的改變均可能對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能造成有害影響，見表1。

2.5Western blot檢測(cè)磷酸化ERBB3、Akt水平 人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞BT474-V1、SKBR3-V1均不表達(dá)ERBB3蛋白。BT474-C1、SKBR3-C1均為重新構(gòu)建的能夠表達(dá)ERBB3蛋白的人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞。BT474-M1、SKBR-3-M1是慢病毒感染后構(gòu)建的ERBB3基因E928G突變的人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞。6組細(xì)胞中磷酸化ERBB3水平未見明顯改變，在BT474-M1、SKBR-3-M1兩組細(xì)胞中磷酸化Akt水平明顯升高，見圖2。

表1 ERBB3突變位點(diǎn)PROVEAN、SIFT、Poly-Phen-2 HumVar軟件評(píng)分

注：pERBB3為磷酸化人表皮生長因子受體3，pAkt為磷酸化蛋白激酶B,GADPH為3-磷酸甘油醛脫氫酶

3 討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)，ERBB3基因擴(kuò)增可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長分化，最終導(dǎo)致對(duì)藥物治療的敏感性降低[15]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，ERBB3擴(kuò)增改變或ERBB3與其他HER家族成員形成異二聚化后，不易被降解，下游通路異常激活導(dǎo)致細(xì)胞增殖[16-17]，但對(duì)于ERBB3基因突變對(duì)腫瘤影響的研究較少。Yang等[18]發(fā)現(xiàn)ERBB3基因不同位點(diǎn)突變的胃腸道腫瘤對(duì)酪氨酸激酶抑制劑的敏感性不同，通過構(gòu)建不同位點(diǎn)突變的腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)E928G位點(diǎn)突變對(duì)耐藥的影響最大，影響藥物療效的機(jī)制可能與下游PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活相關(guān)[7]。ERBB3基因在乳腺癌方面的研究主要是基因擴(kuò)增對(duì)腫瘤的影響，涉及基因突變的研究較少[19-20]，故本研究旨在探索ERBB3突變對(duì)乳腺癌治療的影響。

與以往研究不同，本研究從臨床患者樣本的數(shù)據(jù)出發(fā)，尋找ERBB3基因常見突變類型及突變熱點(diǎn)，主要研究潛在的有害突變位點(diǎn)對(duì)乳腺癌細(xì)胞功能的影響。本研究結(jié)果顯示，本中心與TCGA數(shù)據(jù)庫中均存在共同的突變熱點(diǎn)E928G及V104L，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)檢測(cè)到的突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，因此能更快地篩選出潛在的有害突變位點(diǎn)。經(jīng)過3個(gè)軟件分析顯示，E928G位點(diǎn)突變危害性更大，與以往文獻(xiàn)報(bào)道相同[18]。通過對(duì)突變細(xì)胞磷酸化Akt水平的檢測(cè)，驗(yàn)證了ERBB3突變的HER2陽性乳腺癌細(xì)胞中磷酸化Akt水平升高，該結(jié)果可能與ERBB3基因構(gòu)象改變相關(guān)。E928位點(diǎn)位于激酶區(qū)，該區(qū)域存在PI3K調(diào)節(jié)亞基位點(diǎn)，與PI3K相結(jié)合后激活下游通路，當(dāng)E928位點(diǎn)發(fā)生改變，募集到更多的PI3K結(jié)合亞基位點(diǎn)，下游PI3K/Akt信號(hào)通路活化水平提高，可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥[21-22]。

綜上所述，ERBB3基因E928G突變可引起細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt水平升高，可能使下游PI3K/Akt信號(hào)通路過度激活，導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。本研究為HER2陽性乳腺癌患者抗HER2治療耐藥的機(jī)制研究提供了新方向，同時(shí)也為多靶點(diǎn)聯(lián)合治療提供了新思路。但本研究存在的不足主要是未進(jìn)行臨床標(biāo)本的驗(yàn)證，有待后續(xù)的藥物相關(guān)性研究進(jìn)行補(bǔ)充。