高通量測序法對糖尿病患者及健康人群糞便微生物的群落分析

王夢姣 楊國鵬 鄭天驕 李青山

【摘要】 目的 通過尋找出2型糖尿病患者的糞便指示微生物，為后續(xù)進一步開發(fā)潛在糖尿病患者試劑盒做準備，并探討母系親緣關(guān)系與人群糞便微生物多樣性的相關(guān)性。

方法 從糞便微生物入手，利用高通量測序法對健康人群及糖尿病患者進行糞便微生物群落的分析和比較。同時，從多樣性方面對具有母系遺傳關(guān)系的四代人類糞便微生物進行比較。

結(jié)果 與健康人群相比，糖尿病人群糞便微生物多樣性顯著弱于健康人群;厚壁菌門（Firmicutes）、梭菌綱（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales），Ruminococcaceae_UCG-013和糞桿菌屬（Faecalibacterium）是2型糖尿病患者糞便指示微生物。三相圖結(jié)果表明，只有布勞特氏菌屬（Blautia）連續(xù)出現(xiàn)在四代人類糞便微生物群落中;PCoA及LEfSe的差異分析結(jié)果表明，四代人糞便微生物群落相似性較差。

結(jié)論 厚壁菌門、梭狀芽孢桿菌綱、梭狀芽孢桿菌目、Ruminococcaceae_UCG-013和糞桿菌屬可作為篩選潛在糖尿病人群的糞便指示微生物。糞便微生物群落與母系遺傳關(guān)系相關(guān)性不強。

【關(guān)鍵詞】 糞便微生物;2型糖尿病;指示微生物;母系親緣關(guān)系;相關(guān)性

中圖分類號：R587.1?? 文獻標志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.03.002

Analysis of fecal microbial community of diabetic patients and healthy people by high-throughput sequencing

WANG Mengjiao， YANG Guopeng， ZHENG Tianjiao， LI Qingshan

（School of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong 723000， Shaanxi， China）

【Abstract】 Objective To prepare for further development of potential diabetic kits through finding out fecal indicator microorganisms of T2DM patients， and to explore the correlation of maternal relationship and fecal microbial diversity.

Methods Starting with fecal microorganism， high-throughput sequencing was used to analyze and compare fecal microbial communities in healthy people and T2DM patients. At the same time， four generations of human fecal microorganisms with maternal genetic relationship were compared in terms of diversity.

Results Compared with healthy population， the diversity of fecal microorganism in T2DM patients was significantly weaker than that in healthy population. Firmicutes， Clostridia， Clostridiales， Ruminococcaceae_UCG-013 and Faecalibacterium were indicators of fecal microorganisms in T2DM patients. The results of three-phase diagram showed that only Blautia appeared continuously in the four generations of the community of human fecal microorganisms. The difference analysis results of PCoA and LEfSe showed that the similarity of fecal microorganisms communities of the four generations was poor.

Conclusion Firmicutes， Clostridia， Clostridiales， Ruminococcaceae_UCG-013 and Faecalibacterium can be used as screening indicators for fecal microorganisms among potential T2DM patients， and correlation between fecal microorganisms community and maternal genetic relationship is not strong.

【Key words】 fecal microorganism; T2DM; indicator microorganism; matrilineal relationship; correlation

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，按發(fā)病機制分為1型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus， T1DM）和2型糖尿?。═2DM）;2型糖尿病約占糖尿病病例的90%，是一種由胰島素抵抗和細胞缺陷引起的胰島素敏感性受損導致的慢性代謝紊亂[1]。雖然目前我們已經(jīng)對T2DM發(fā)生、發(fā)展及相關(guān)的生理生化知識有了很多了解，也發(fā)展出較多的2型糖尿病治療方法。但是隨著近年來全球2型糖尿病患者數(shù)量的過快增長，除了現(xiàn)有的2型糖尿病防治措施以外，我們依然需要進一步了解和探索2型糖尿病的發(fā)病機理和相關(guān)生理生化指標，從中尋找能夠甄別潛在糖尿病患者的方法，將2型糖尿病從治療推向預防的階段。

當前許多研究結(jié)果都表明，2型糖尿病患者的腸道菌群與健康成年人顯著不同。有研究結(jié)果揭示，與健康人群腸道微生物相比，糖尿病患者的厚壁菌門（Firmicutes）和類梭狀芽孢桿菌綱（Clostridia）的比例顯著降低;厚壁菌門、擬桿菌門（Bacteroidetes）與受試者血糖呈顯著正相關(guān)關(guān)系。另一個研究小組利用宏基因組關(guān)聯(lián)技術(shù)對345名受試人員進行了腸道微生物測序，其研究結(jié)果表明2型糖尿病患者具有一定程度的腸道微生物生態(tài)失衡，丁酸鹽產(chǎn)生菌數(shù)量和種類大量下降，各種病原微生物種類和數(shù)量有所增加。以上研究結(jié)果均表明，2型糖尿病與人體腸道微生物菌群存在一定相關(guān)性。

人體腸道微生物的建立及穩(wěn)固主要取決于個體出生方式、遺傳因素和居住環(huán)境（飲食習慣）三者的協(xié)同作用。人體腸道微生物最初是由其出生方式及母體的基因型決定;如果嬰兒出生方式是順產(chǎn)，其腸道微生物主要來源于母體生殖道及糞便微生物，如果嬰兒是剖腹產(chǎn)方式出生，其腸道微生物的多樣性更偏向于母體皮膚部位的微生物。待嬰兒成長至3歲以后，腸道微生物則逐漸趨于穩(wěn)定，此時腸道微生物構(gòu)成則主要取決于遺傳因素、環(huán)境因素及飲食習慣。

2型糖尿病作為一個非常復雜的代謝性疾病，很多研究指出其與遺傳因素具有較強的相關(guān)性。尼爾森的研究表明，環(huán)境因素和遺傳因素共同促成了2型糖尿病的發(fā)病機制。人體全基因組關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果也確定了大量在基因型上與2型糖尿病相關(guān)的變異情況;BARBITOFF和他的團隊已經(jīng)選定出部分單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點作為2型糖尿病的遺傳標記。

本研究從人體糞便微生物入手，利用高通量測序法，以健康人群為對照，對糖尿病患者糞便微生物進行了測序分析和比較，擬尋找出2型糖尿病患者的糞便指示微生物，為后續(xù)進一步開發(fā)潛在糖尿病患者試劑盒做準備;同時，本研究還從多樣性方面對具有母系遺傳關(guān)系的四代人類糞便微生物進行了比較，探討母系親緣關(guān)系是否與人群糞便微生物多樣性存在一定相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象和取樣方法

受試對象共18人，其中每3人分為一組，分別為A、B、C、D、C-N和D-N組，其中，A、B、C和D組具有母系遺傳親緣關(guān)系，C-N、D-N組與其他四組受試者沒有任何親緣關(guān)系，為對照組，均為健康人群。以上所有受試對象除糖尿病組以外，其余健康狀況良好，均無任何其他遺傳疾病。C組糖尿病治療方法為在早飯和晚飯前30分鐘，注射胰島素Gansulin R（通化東寶制藥有限公司，中國），D組糖尿病治療方法為在早飯和晚飯前30分鐘，注射胰島素Novolin R （諾和諾德公司，丹麥）。具體分組信息見表1。所有糞便樣本均由受試者自行收集后，并迅速凍存至-80℃條件下。

1.2 糞便DNA提取及測序

用DNA提取試劑盒（SPINeasy DNA Kit for Feces，MP生物試劑公司，圣安娜，CA，USA）進行糞便樣品基因組DNA提取。用引物806R和515F擴增細菌16S rRNA基因的V4區(qū)，PCR反應體系為50 μL，由25 μL 2x Premix Taq （Takara Biotechnology， 大連，中國）、1 μL濃度為10 mM的引物806R、1 μL濃度為10 mM的引物515F、3 μL of DNA（20 ng/μL）模板以及21 μL of dd H2O。擴增程序為94℃ 5 min，at for initialization，94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)，72℃10 min。

擴增結(jié)束之后，用1%瓊脂糖濃度的電泳來檢測擴增片段的長度及產(chǎn)物濃度。用NEBNext Ultra DNA建庫試劑盒將擴增長度在290～310 bp的DNA片段進行DNA擴增子文庫的構(gòu)建，待構(gòu)建好文庫后，用Illumina Hiseq2500平臺對構(gòu)建的擴增子文庫進行PE250測序（Guangdong Magigene Biotechnology Co.，Ltd. Guangzhou， China）。文庫OTU（operational taxonomic unit）數(shù)據(jù)的獲取及測序過程以及OTU序列注釋過程參考Schwiertz A的實驗方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗中所有數(shù)據(jù)結(jié)果均為三個平行樣品的平均值，并對結(jié)果進行了方差分析。分析不同樣品（組）之間共有、特有的OTU數(shù)，并利用R軟件繪制維恩圖。用Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)來進行樣品Alpha多樣性分析。使用QIIME（V1.9.1）軟件進行分析，用R（V2.15.3）軟件計算出結(jié)果。其中，用Chao1指數(shù)表征樣品群落豐富度，用香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)表征樣品群落多樣性。三個指數(shù)計算公式見下：

Chao1=Sobs+F21/2F2 （Chao， 1984） ;Shannon=-∑si=1pilog2pi（Colwell， and Coddington， 1994） ; Simpson= 1-∑p2? i （Adrain， 2000）。

選取總體相對豐度排在前50且有屬分類信息的OTU代表性序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建參考SAITOU等的文獻。分別選取A、B和C受試者糞便樣品中各分類級別中平均豐度排名前10位的優(yōu)勢門、優(yōu)勢綱、優(yōu)勢目、優(yōu)勢科及優(yōu)勢屬，利用R軟件繪制三元相圖。利用相同選擇方法，使用R軟件繪制受試者B、C和D受試者糞便樣品的三元相圖?；赪eighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離矩陣，使用qiime2和ggplot2軟件包進行Principal co-ordinates analysis（PCoA）分析并繪圖。使用LEfse軟件進行組間物種的差異顯著分析：首先使用non-parametric factorial Kruskal-Wallis（KW）sum-rank test（非參數(shù)因子克魯斯卡爾-沃利斯秩和檢驗）檢測不同分組間豐度差異顯著的物種，然后用成組的Wilcoxon秩和檢驗來進行兩兩組間差異性判斷，最后用線性判別分析（LDA）來實現(xiàn)降維和評估差異顯著物種的影響大?。礊長DA Score），默認設置LDA Score的篩選值為2，結(jié)果即為各組內(nèi)的biomarker。

2 結(jié)? 果

2.1 糖尿病患者與健康人群糞便微生物群落結(jié)構(gòu)分析

為分析健康人群與糖尿病患者糞便樣品的群落結(jié)構(gòu)，本研究首先通過分析不同樣品之間共有和特有的OTU數(shù)，繪制了C組、D組、C-N組和D-N組的維恩圖（圖1）。從圖1中可以看出，四組糞便樣品共檢出1126種微生物，其中D-N組樣品的特有微生物種類數(shù)量最多，為183種;C組樣品的特有微生物種類數(shù)量最少，為60種;有157種微生物出現(xiàn)在四組樣品中，為四組樣品的共有微生物。

為了明確健康人群與糖尿病人群在微生物分布多樣性方面的差異，本研究對以上四組的多樣性指數(shù)（Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)）進行了數(shù)據(jù)分析。從圖2中可以看出，樣品C-N組的微生物物種豐富度最高，D-N組豐富度最低（圖2A）;樣品C-N組的物種多樣性也最高（圖2B、C）。

為進一步從不同分類水平上對健康人群及糖尿病群體微生物群落的差異性進行分析，本研究分別從不同分類水平對四組樣品微生物群落進行了分類比較（圖3）。四組樣品中分離的微生物分布在31個門，其中厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）為優(yōu)勢菌門，占整個微生物分布的99%以上（圖3A）。和健康人群糞便微生物樣品（C-N、D-N）相比，C組樣品變形菌門微生物分布顯著增加，厚壁菌門微生物分布顯著下降;D組樣品疣微菌門微生物分布顯著增加，厚壁菌門微生物分布顯著下降（圖3A）。即在門的分布水平上，健康人群與糖尿病患者糞便微生物的差異主要集中在變形菌門、厚壁菌門及疣微菌門這三個門的分布上。放線菌綱（Actinobacteria）、紅蝽菌綱（Coriobacteriia）、梭菌綱（Clostridia）、桿菌綱（Bacilli）、δ變形菌綱（Deltaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和疣微菌綱（Verrucomicrobiae）是四組樣品從綱的水平上進行分類所獲得的優(yōu)勢菌綱（圖3B）。厚壁菌門下的梭菌綱在健康人群的糞便微生物中分布顯著多于糖尿病患者樣品，C組樣品中γ-變形菌綱顯著多于健康人群樣品，D組樣品則是疣微菌綱顯著多于健康人群樣品（圖3B）。從圖3C中可以看出，四組樣品中相對豐度大于1%微生物分布在11個目中，與健康人群糞便樣品相比，C組樣品的梭菌目（Clostridiales）的相對豐度顯著降低，腸桿菌目（Enterobacteriales）和假單胞菌目（Pseudomonadales）相對豐度則顯著升高;D組樣品的梭菌目（Clostridiales）的相對豐度相對于健康人群也顯著降低，假單胞菌目（Pseudomonadales）和疣微菌目（Verrucomicrobiales）相對豐度則有所上升（圖3C）。從圖3D中看出，與健康人群相比，糖尿病患者糞便微生物中鏈球菌科的相對分布略有下降，而理研菌科（Rikenellaceae）、韋榮氏菌科（Veillonellaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）以及疣微菌科（Akkermansiaceae）的相對豐度則有所上升。

在四組樣品中，所有微生物分布在584個屬種，其中有26個屬的相對豐度大于1%，這些屬分別是雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、另枝菌屬（Alistipes）、狄氏副擬桿菌屬（Parabacteroides）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、魏絲氏菌屬（Weissella）、鏈球菌屬（Streptococcus）、Agathobacter、布勞特氏菌屬（Blautia）、Fusicatenibacter、羅斯氏菌屬（Roseburia）、Intestinibacter、Romboutsia、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、Ruminococcaceae_UCG-013、Ruminococcus1、Ruminococcus2、Subdoligranulum、Coprostanoligenes_group、Erysipelotrichaceae_UCG-003、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、埃希氏桿菌屬（Escherichia/Shigella）、克雷白氏桿菌屬（Klebsiella）（圖3E）。與健康人群相比，糖尿病患者糞便樣品中鏈球菌屬、糞桿菌屬和Subdoligranulum的相對分布顯著降低，另枝菌屬、乳酸菌屬、Coprostanoligenes_group和埃希氏桿菌屬的相對豐度顯著上升（圖3F）。

2.2 母系遺傳關(guān)系與糞便微生物群落的相關(guān)性分析

本研究首先利用三相圖探討母系遺傳關(guān)系與糞便微生物群落的相關(guān)性;在三元相圖中，三個頂點糞便代表三個樣本，圓形圖案代表三元相圖中的物種，圓的大小與相對豐度成正比。通過分析圓形與三個頂點之間的距離可以分析出，不同樣本的相近核心微生物群落種類。從受試B、C和D組的糞便微生物的三元相圖中可以看出，在門的分類水平上，酸桿菌門（Acidobateria）位于三元相圖的中間，即該菌門在三組樣品中具有相似的豐度（圖4A）;在屬的分類水平上，布勞特氏菌屬在三組樣品中也具有相似的豐度（圖4E）。然而，在其他分類水平上，均沒有找到具有相似豐度的微生物菌種（圖4B、圖4C及圖4D）。

在受試A、B和C組的三元相圖中可以看出，厚壁菌門、放線菌門和綠彎菌門（Chloroflexi）在三組樣品中具有相似的豐度（圖5A）;放線菌綱和Chlostridia，Bifidobacterialesc和梭菌目，疣微菌科、毛螺菌科、雙岐菌科和Peptostreptococcacceae，雙歧桿菌屬和布勞特氏菌屬分別在綱、目、科和屬的水平上，在三組樣品中具有相似豐度（圖5B、C、D和E）。

3 討? 論

3.1 糖尿病患者與健康人群糞便微生物群落結(jié)構(gòu)分析

兩組糖尿病患者糞便樣品的共有OTU數(shù)為420，是其他任意兩組共有OTU數(shù)量最高的數(shù)值（圖1）;健康人群特異性OTU數(shù)分別為97和183（圖1）。以上結(jié)果均表明，糖尿病患者的腸道菌群OTU數(shù)量相似且保守性較高，其特異性要顯著低于健康人群。這一結(jié)果與前人在研究阿卡波糖對糖尿病早期患者腸道菌群影響中的部分結(jié)果一致。

在糞便微生物多樣性指數(shù)分析方面，樣品C-N組被檢出的微生物數(shù)量最多，從多樣性方面來看，健康人群糞便微生物多樣性指數(shù)略高于糖尿病患者糞便微生物多樣性指數(shù)（圖2）。以上結(jié)果說明，糖尿病患者糞便微生物多樣性相對較差。在前人研究糞便微生物分子特征的過程中，也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

通過在不同分類水平對健康人群與糖尿病人群糞便微生物群落差異性的分析發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門、梭狀芽孢桿菌綱、梭狀芽孢桿菌目、Ruminococcaceae_UCG-013以及糞桿菌屬在糖尿病患者糞便中相對豐度顯著低于健康人群糞便樣品（圖3），這一結(jié)論與ARUMUGAM及SATO等學者的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，受試者C組的糞便微生物中，變形菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌科、腸桿菌目、埃希氏腸桿菌屬的相對豐度要顯著高于其他所有受試組樣品（圖3）;疣微菌門、疣微菌綱、疣微菌目、Akkermansi則在受試者D組糞便微生物中呈現(xiàn)較高的相對豐度。以上這兩種微生物顯著變化的情況也出現(xiàn)在HARTSTRA關(guān)于瑞典絕經(jīng)后肥胖白人女性胰島素抵抗發(fā)展預測的研究及代謝綜合征患者的受供者糞便對胰島素敏感性的相關(guān)研究中。出現(xiàn)這種在不同糖尿病患者糞便樣品中不同微生物群落相對豐富顯著不同的情況，可能是由于其患糖尿病時間不一致，采取治療的藥物也不完全一致，其代謝系統(tǒng)的調(diào)節(jié)方式也不完全一致造成的。

通過對以上結(jié)果的總結(jié)和分析，本研究認為，厚壁菌門、梭狀芽孢桿菌綱、梭狀芽孢桿菌目、Ruminococcaceae_UCG-013以及糞桿菌屬為糖尿病患者糞便微生物的指示微生物。值得注意的是，目前的研究還不清楚造成這些微生物顯著變化的原因是否與糖尿病患者腸胃蠕動變化相關(guān)，還是這些糞便微生物的變化直接引起血糖代謝問題。但是可以確定的是，這些發(fā)生群落相對豐度變化的微生物是可以用來作為診斷潛在糖尿病患者的重要微生物指標的。本研究的這一結(jié)果能夠從微生物角度加強潛在糖尿病患者的可預測性及其微生物群落致病性改變的可預測性。

3.2 母系遺傳關(guān)系與糞便微生物群落的相關(guān)性分析

本研究在探討糖尿病患者與健康人群糞便微生物群落結(jié)構(gòu)分析中就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，雖然受試者C組和受試者D組均患2型糖尿病、存在母系遺傳關(guān)系，但是其糞便微生物群落的相對豐度一致性不高，甚至還出現(xiàn)了不一致的情況。三元相圖的結(jié)果表明，酸桿菌門和布勞特氏菌屬在受試B、C和D組的糞便微生物中具有相似的豐度（圖4）;厚壁菌門、放線菌門、綠彎菌門，放線菌綱和Chlostridia，Bifidobacterialesc和梭菌目，疣微菌科、毛螺菌科、雙岐菌科和Peptostreptococcacceae，雙歧桿菌屬和布勞特氏菌屬分別在綱、目、科和屬的水平上，在受試A、B和C組三組樣品中具有相似豐度（圖5）。綜合以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有A、B、C和D受試組樣品中，只有布勞特氏菌屬在四代具有相似豐度。

為了進一步分析樣本之間的關(guān)系，本研究對糞便樣本中的細菌基因組DNA進行PCoA分析。PCoA分析主要是通過一系列典型值和特征向量的排序，從多維數(shù)據(jù)中提取最重要的元素和結(jié)構(gòu)。PCoA分析結(jié)果表明，同一組的不同樣本聚類在一起，但是不同組之間樣本距離相對較遠（圖6）。本研究還分別在門、綱、目、科和屬的水平上，通過計算樣本之間相對豐度差異程度的LEfSe得分來評估不同組糞便微生物組成的差異。LEfSe分析結(jié)果表明，四組樣本微生物相對豐度的標志性微生物的相對豐度及數(shù)量均差異顯著（圖7）。

以上結(jié)果均表明，受試者糞便微生物群落多樣性受遺傳關(guān)系的影響較小。這一結(jié)論否定與本研究初期分析母系遺傳關(guān)系和糞便微生物群落相關(guān)性分析的目標。這可能是由于人體腸道微生物群落受到遺傳、年齡、性別和飲食等因素綜合影響，單一利用糞便微生物群落分析，或單一利用高通量測序方法都不能直觀地表述出二者的相互關(guān)系。

綜上所述，本研究采用高通量測序法分析健康人群與糖尿病人群糞便微生物的差異性，并尋找母系遺傳關(guān)系與糖尿病患者糞便微生物的相關(guān)性。研究結(jié)果表明，厚壁菌門、梭狀芽孢桿菌綱、梭狀芽孢桿菌目、Ruminococcaceae_UCG-013和糞桿菌屬可作為篩選潛在糖尿病人群的糞便指示微生物。根據(jù)三元相圖、PCoA分析及LEfSe分析結(jié)果，糞便微生物群落與母系遺傳關(guān)系相關(guān)性不強。本研究結(jié)果對篩選潛在糖尿病患者及開發(fā)篩選潛在糖尿病患者試劑盒具有一定實驗支持作用。

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（收稿日期：2021-10-19 修回日期：2021-12-29）

（編輯：潘明志）