不同蛋白酶對香菇酶解液性質(zhì)的影響

劉麗娜，李順峰，魏書信，崔國梅，王安建，田廣瑞，周美如

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

香菇是我國第一大食用菌生產(chǎn)品種，不僅肉質(zhì)肥厚細(xì)嫩、滋味鮮美、香氣獨特，而且含有香菇多糖、有機(jī)堿、維生素、礦物質(zhì)等生物活性成分，具有很高的營養(yǎng)、藥用和保健價值，是一種食藥同源的食品[1]。由于香菇含有豐富的呈味物質(zhì)，具有獨特的鮮美滋味，深受大眾的喜愛，已成為天然調(diào)味料研發(fā)的熱點。生物酶解技術(shù)是天然調(diào)味基料生產(chǎn)的常用方法，具有反應(yīng)條件溫和、耗能低、污染少、反應(yīng)定向可控等諸多優(yōu)點。采用酶解法對香菇進(jìn)行加工，可以將原料蛋白質(zhì)充分水解，釋放更多的風(fēng)味前體物質(zhì)，使其特殊風(fēng)味得到一定的增強(qiáng)。國內(nèi)外關(guān)于菌類酶解的研究也有一些報道，如LI Q等[2]研究發(fā)現(xiàn)，蘑菇湯經(jīng)過酶解預(yù)處理后蛋白質(zhì)、氨基酸等成分顯著增加；王雨生等[3]優(yōu)化了超聲波協(xié)同酶法制備香菇酶解液及其鮮味物質(zhì)的工藝；沈文鳳等[4-5]利用相應(yīng)的酶解技術(shù)制備了香菇調(diào)味料，吳關(guān)威[6]研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶酶解法釋放香菇柄中各滋味成分效果好于熱水浸提法。這些研究主要集中于酶解工藝方面，對于不同蛋白酶酶解特性對比的研究較少。目前，常用的商業(yè)蛋白酶主要有中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶等，由于不同蛋白酶的作用位點不同，對酶解液的營養(yǎng)和風(fēng)味有重要影響[3]，因此蛋白酶的選擇對酶解液的性質(zhì)至關(guān)重要。本研究采用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶對香菇粉進(jìn)行單酶酶解，研究不同蛋白酶對香菇酶解液的水解度、營養(yǎng)成分、感官評價和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，為香菇調(diào)味料的開發(fā)利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇：購于西峽縣孫氏菌業(yè)專業(yè)合作社，50 ℃烘干粉碎過80目篩，取篩下物密封保存?zhèn)溆茫恢行缘鞍酌福富盍?.8 AU/g）、堿性蛋白酶（酶活力2.4 AU/g）、風(fēng)味蛋白酶（酶活力600 MG/g）：諾維信投資有限公司；甲醛、磷酸、乙醇、重蒸酚、濃硫酸、氫氧化鈉、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、酚酞等（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP30002電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；FA2004C分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；HN-1000Y超聲波細(xì)胞破碎儀：上海汗諾軒儀器有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HC-3018高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中加科學(xué)儀器有限公司；Advanced-I艾柯超純水機(jī)：臺灣艾柯成都康寧實驗專用純水設(shè)備廠；UV-1800型紫外可見分光光度計：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XB-20B多功能粉碎機(jī)：上海兆申科技有限公司；FE20 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Supelco固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）手柄、50 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司；Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）：美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香菇蛋白酶解液的制備

取適量香菇粉，按料液比1∶15（g∶mL）加入去離子水混合均勻，細(xì)胞破碎儀作用10min（超聲功率800W、頻率20kHz），分別添加一定量的蛋白酶，在一定條件下，酶解不同時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）后，沸水浴滅酶10 min后，4 000 r/min離心20 min，取上清液即為酶解液。通過預(yù)實驗確定各蛋白酶作用條件分別為中性蛋白酶添加量0.7%、溫度50 ℃、起始pH值自然，堿性蛋白酶添加量0.5%、溫度50 ℃、pH 8.5，風(fēng)味蛋白酶添加量0.7%、溫度50 ℃、起始pH值自然。

1.3.2 測定方法

（1）水解度的測定[7]

采用甲醛滴定法對酶解液水解度進(jìn)行測定，將酶解液4 000 r/min離心20 min，取上清液10 mL，蒸餾水60 mL于錐形瓶中，混勻，采用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液滴至pH=8.2，記下標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的體積，加入10 mL甲醛，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至pH=9.2，讀取0.1 mol/L氫氧化鈉溶液用量。同時，以蒸餾水代替待測樣品做試劑空白實驗。水解度計算公式如下：

式中：C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V1為樣液加入甲醛后滴定至終點所消耗氫氧化鈉的體積，mL；V2為空白組加入甲醛后滴定至終點所消耗氫氧化鈉的體積，mL；M為樣品的質(zhì)量，g；V為酶解上清液的體積，mL；8為每克蛋白質(zhì)所含的肽鍵的毫摩爾數(shù)，mmol/g。

（2）可溶性蛋白質(zhì)含量測定[8]

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法對可溶性蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定。

（3）多糖含量的測定[8]

采用苯酚-硫酸法對多糖進(jìn)行測定。

（4）感官評價

采用9分制對香菇酶解液從鮮味、苦味、香菇特征風(fēng)味三個方面進(jìn)行感官評定，隨機(jī)編號，由5名有感官評定經(jīng)驗的評定人員按感官標(biāo)準(zhǔn)評分，最后評分取平均值，滿分為27分，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 酶解液感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of hydrolysate

（5）揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析[9]

SPME條件：取10 mL樣液放入40 mL萃取瓶中，蓋上瓶蓋在60 ℃水浴攪拌中平衡20 min后，用萃取頭吸附30 min，然后將萃取頭插入氣質(zhì)聯(lián)用儀的進(jìn)樣器中解吸5 min。

GC-MS條件：采用HP-5MS毛細(xì)色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（He），流速1 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度230 ℃；程序升溫起始溫度35 ℃保持5 min，5 ℃/min升溫至150 ℃，再以10 ℃/min的速率升至220 ℃保持2 min，檢測器溫度：280℃。電離方式為電子電離（electronicionization，EI）源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)譜接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～550 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶處理對香菇酶解液的水解度的影響

不同的蛋白酶水解效果不同，與酶本身的性質(zhì)和底物的特點均有關(guān)系[10]。由圖1可知，經(jīng)過三種蛋白酶酶解處理后，香菇酶解液的水解度整體變化趨勢大致相同，酶解過程中隨酶解時間的延長水解度先升高后降低，這可能是底物濃度不斷下降和終產(chǎn)物對酶的抑制持續(xù)加強(qiáng)的緣故[11]。風(fēng)味蛋白酶包含有內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶等多種蛋白酶，作用位點廣泛，堿性蛋白酶和中性蛋白酶都是一種內(nèi)切蛋白酶，其選擇性相對風(fēng)味蛋白酶低[12]，因此相同酶解時間條件下，風(fēng)味蛋白酶大部分酶解過程中水解程度最高。堿性蛋白酶在3 h時率先達(dá)到最大水解度23.332%，之后趨于平穩(wěn)，整體水解程度明顯偏低；風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶在整個酶解過程中均保持相對較快的增加趨勢，分別在4 h、5 h達(dá)到最大水解度26.031%、25.709%，二者相差不大，均能達(dá)到較好的水解效果。

圖1 不同蛋白酶處理對香菇酶解液水解度的影響Fig.1 Effect of different proteases on hydrolysis degree of Lentinus edodes enzymatic hydrolysate

2.2 不同酶處理對香菇酶解液可溶性蛋白質(zhì)含量、多糖含量的影響

由圖2可知，隨著酶解時間的延長，不同酶處理的香菇酶解液可溶性蛋白質(zhì)和多糖含量變化趨勢基本相同，均是先不斷增加再緩慢減少。香菇蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶酶解處理后，生成小分子肽和氨基酸，可溶性蛋白質(zhì)含量增加[13]；同時，香菇多糖在結(jié)構(gòu)上易與蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白質(zhì)多糖，經(jīng)蛋白酶水解后，蛋白質(zhì)多糖被拆散，多糖被釋放出來，從而增加了多糖的含量[14]；因此，香菇酶解液可溶性蛋白質(zhì)和多糖含量的變化與圖1中水解度的變化趨勢一致。且堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶的酶解液同樣在酶解3 h、4 h、5 h的含量達(dá)到最大，其中風(fēng)味蛋白酶4 h酶解液可溶性蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到1.146 g/100 g；堿性蛋白酶3 h酶解液多糖含量最高，達(dá)到11.993 g/100 g。之后隨著酶解時間的繼續(xù)延長，可溶性蛋白質(zhì)含量略有減少，這可能是因為長時間的加熱，使得酶解液中的蛋白質(zhì)變性的緣故[15]。在酶解相同時間時，風(fēng)味蛋白酶大部分酶解過程中可溶性蛋白質(zhì)含量高于中性蛋白酶和堿性蛋白酶，這與圖1中水解度的變化相對應(yīng)；而堿性蛋白酶在整個酶解過程中多糖含量始終保持最高，這可能與香菇多糖中部分堿溶性多糖在堿性反應(yīng)條件下逐漸溶解出來有關(guān)[4]。

圖2 不同蛋白酶處理對香菇酶解液可溶性蛋白質(zhì)（A）及多糖（B）含量的影響Fig.2 Effect of different proteases on the contents of soluble protein (A)and polysaccharide (B) of Lentinus edodes enzymatic hydrolysate

2.3 香菇酶解液的感官評價

由表2可知，三種香菇蛋白酶解液的鮮味和香菇特征風(fēng)味都隨著酶解時間的延長得到了加強(qiáng)，堿性蛋白酶酶解3 h后、風(fēng)味蛋白酶酶解4 h后、中性蛋白酶酶解5 h后酶解液的鮮味和香菇特征風(fēng)味均出現(xiàn)不同程度的下降，這與酶解液水解度的變化趨勢類似，可能是因為不同的蛋白酶在酶解過程中產(chǎn)生不同分子質(zhì)量的多肽，呈現(xiàn)出不同的感官風(fēng)味；后期感官評分降低可能與酶解產(chǎn)生的富含疏水性氨基酸的低分子質(zhì)量肽有關(guān)[16]。其中香菇特征風(fēng)味感官評分方面風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶最大值優(yōu)于中性蛋白酶，鮮味感官評分方面風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶最大值優(yōu)于堿性蛋白酶。三種香菇蛋白酶解液中，風(fēng)味蛋白酶苦味整體最弱；堿性蛋白酶的苦味最明顯，且隨著酶解時間的延長苦味加重，這表明酶解不僅能產(chǎn)生較多的呈味物質(zhì)，也會生成一些苦味物質(zhì)，這與沈文鳳等[17]的研究結(jié)果相一致。綜合來看，風(fēng)味蛋白酶酶解4 h時的酶解液感官評分最高，為22.80分；其次是中性蛋白酶酶解5 h的酶解液和堿性蛋白酶酶解3 h的酶解液，分別為22.10分、21.20分。

表2 不同蛋白酶處理的香菇酶解液感官評分結(jié)果Table 2 Sensory scoring results of Lentinus edodes enzymatic hydrolysate with different proteases

2.4 香菇酶解液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

由于整個酶解過程中堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶的酶解液分別在3 h、4 h、5 h具有較高的水解度和感官評價，因此，進(jìn)一步對其進(jìn)行GC-MS分析，分離鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成及相對含量見表3。

表3 不同蛋白酶處理的香菇酶解液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析Table 3 Volatile flavor substances in Lentinus edodes enzymatic hydrolysate with different proteases by GC-MS

續(xù)表

由表3可知，香菇堿性蛋白酶解液共檢測出22種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類1種（0.60%）、含硫化合物5種（91.37%）、醛類10種（4.81%）、其他化合物（酮類、呋喃、酯類等）6種（3.22%）；香菇風(fēng)味蛋白酶解液共檢測出25種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類3種（0.75%）、含硫化合物6種（91.25%）、醛類11種（5.64%）、其他化合物（酮類、烴類、呋喃等）5種（2.36%）；香菇中性蛋白酶解液共檢測出24種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類1種（0.53%）、含硫化合物6種（91.33%）、醛類10種（5.02%）、其他化合物（酮類、烴類、酯類等）7種（3.12%）。很明顯，其中含硫化合物含量最高，醛類物質(zhì)種類最多。

許多研究表明[18-19]，含硫化合物是香菇特征香氣成分的主要物質(zhì)，是影響香菇特征風(fēng)味的關(guān)鍵組分，尤其可作為干香菇的主導(dǎo)性香氣物質(zhì)。三種香菇蛋白酶解液中相同的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共有19種，且含硫化合物的總相對含量占絕對優(yōu)勢，說明三種酶解液主要呈香物質(zhì)種類含量差別不大，差別更多體現(xiàn)在調(diào)和風(fēng)味的醛、酮、酯等物質(zhì)的差異方面。本實驗中所用原料為干香菇，文獻(xiàn)中報道干香菇中含硫化合物達(dá)37.51%～62.09%[20-22]，而三種酶解液中含硫化合物含量均高達(dá)90%以上，對風(fēng)味的貢獻(xiàn)最大，說明香菇經(jīng)酶解后能釋放出更多的特征性風(fēng)味物質(zhì)。本實驗在香菇酶解液中檢測到的含硫化合物主要為1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷、1,2,4,5-四硫雜環(huán)己烷、1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷（香菇素），這類硫雜環(huán)類化合物香氣強(qiáng)度大、香味閾值低、能有效改進(jìn)和增強(qiáng)香味特征[23]。三種硫雜環(huán)類化合物總相對含量為堿性蛋白酶解液（86.58%）＞風(fēng)味蛋白酶解液（86.49%）＞中性蛋白酶解液（83.39%），這與前面得到的香菇特征風(fēng)味感官評分結(jié)果相一致。本實驗中二甲基二硫醚和二甲基三硫醚在三種酶解液中均未檢測出來，這可能與硫醚類物質(zhì)在聚合反應(yīng)中形成含硫雜環(huán)化合物（1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷、1,2,4,5-四硫雜環(huán)己烷）有關(guān)[24]。

八碳化合物也是香菇風(fēng)味成分的重要組成，代表性物質(zhì)如1-辛烯-3醇、3-辛醇、3-辛酮等[25]，本實驗僅檢測到1-辛烯-3醇，且含量不高，說明酶解處理使1-辛烯-3醇含量下降，可能是由于其熱穩(wěn)定性較差，產(chǎn)生氧化分解導(dǎo)致含量降低[26]，這與楊肖等[27]的研究結(jié)果相一致。三種酶解液中醇類物質(zhì)含量均不高，原因可能是醇類物質(zhì)在加熱時易揮發(fā)或易與酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)。本次檢測中醛類物質(zhì)含量僅次于含硫化合物，其中風(fēng)味蛋白酶相對含量最高，醛類物質(zhì)具有青草的風(fēng)味，主要包括己醛、苯甲醛、烯醛等，他們對氣味起著補(bǔ)充調(diào)和的作用[28]。此外，三種酶解液的風(fēng)味成分還有一部分來源于酯類、酮類、呋喃等化合物，本次實驗中均有檢測到，他們對整體香氣有協(xié)調(diào)和互補(bǔ)的作用。所有這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同構(gòu)成香菇酶解液的特征風(fēng)味。

3 結(jié)論

本實驗對不同蛋白酶的香菇酶解液的性質(zhì)進(jìn)行了比較分析，研究發(fā)現(xiàn)，三種酶解液的水解度隨著酶解時間的增加先升高后慢慢降低，整體變化趨勢大致相同，其中風(fēng)味蛋白酶酶解4 h的酶解液水解度最高，達(dá)到26.031%；酶解液的可溶性蛋白質(zhì)含量、多糖含量及鮮味和香菇特征風(fēng)味在酶解過程中的變化與水解度類似，其中風(fēng)味蛋白酶酶解液可溶性蛋白質(zhì)含量較高、苦味整體最弱，堿性蛋白酶酶解液多糖含量較高、苦味最明顯，風(fēng)味蛋白酶酶解4 h的酶解液感官評分最高為22.80分；其次是中性蛋白酶酶解5 h的酶解液（22.10分）和堿性蛋白酶酶解3 h的酶解液（21.20分）。

采用GC-MS對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，三種香菇酶解液中風(fēng)味蛋白酶解液共檢測出25種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，高于堿性蛋白酶和中性蛋白酶；三種酶解液中含硫化合物總相對含量占絕對優(yōu)勢，均高達(dá)90%以上，對風(fēng)味的貢獻(xiàn)最大，說明香菇經(jīng)酶解后能釋放出更多的特征性風(fēng)味物質(zhì)。1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷、1,2,4,5-四硫雜環(huán)己烷、1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷這三種硫雜環(huán)類化合物總相對含量堿性蛋白酶解液（86.58%）＞風(fēng)味蛋白酶解液（86.49%）＞中性蛋白酶解液（83.39%），與香菇特征風(fēng)味感官評分結(jié)果相一致。三種酶解液中醛類物質(zhì)種類最多，含量僅次于含硫化合物，其中風(fēng)味蛋白酶解液中醛類物質(zhì)相對含量最高。綜合來看，風(fēng)味蛋白酶香菇酶解液具有更高的水解度、可溶性蛋白質(zhì)含量、多糖含量和更好的整體風(fēng)味。