茶樹菇菌絲多糖發(fā)酵工藝優(yōu)化

郭漢忠，譚才鄧，張淑玲，王家騰

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300；2.廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州 510303）

茶樹菇（Agrocybe aegerita）又稱茶薪菇、楊樹菇，屬蘑菇菌目，糞傘科，田頭菇屬，是一種具有較高營養(yǎng)價值的野生蕈菌[1-3]。我國是食用菌產(chǎn)業(yè)大國，總產(chǎn)量從2014年的3 270萬t增加至2020年的超4 000萬t，其中除平菇、金針菇、香菇等常規(guī)品種外，茶樹菇也占很大的比重，且呈上升趨勢[4]。茶樹菇是目前市場上極受歡迎的食用菌之一，其生長于亞熱帶地區(qū)，在我國的主要產(chǎn)地為福建、江西等地[5-6]，隨著茶樹菇的食藥用價值被不斷挖掘，其進(jìn)入快速發(fā)展階段，產(chǎn)量急劇上升。茶樹菇不僅具有補腎滋陰、健脾胃、提高人體免疫力、增強人體防病能力等功效，而且富含抗癌多糖[7-9]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，其提取物針對小白鼠肉瘤180和艾氏腹水癌有高達(dá)80%～90%的抑制率，故人們也把它稱為“抗癌尖兵”[10-11]。茶樹菇是世界衛(wèi)生組織推薦的健康食品之一，近年來國內(nèi)對茶樹菇多糖及其復(fù)合物的研究己成為熱點，大量研究表明，糖類是重要的信息分子，參與許多生理和病理過程。

茶樹菇多糖的提取原料一般可以是子實體[12-14]和菌絲體[15-17]兩種，茶樹菇子實體的生長周期較長，一般一個周期需要60 d左右；茶樹菇菌絲體的發(fā)酵周期較短，一般為7～10 d，可大大縮短加工周期。目前，關(guān)于茶樹菇多糖深加工產(chǎn)品及其提取在國際上未見報道，國內(nèi)的茶樹菇多糖深加工產(chǎn)品中，提取多糖的原料大部分由子實體中進(jìn)行提取，如魏華等[18]通過以茶樹菇子實體為原料，采用熱水浸提法提取所得多糖的得率為4.81%。但以茶樹菇菌絲為原料提取多糖及優(yōu)化菌絲液態(tài)發(fā)酵工藝的研究鮮見報道，茶樹菇菌絲相較于子實體而言，具有生長周期短、易培養(yǎng)等特點，且用茶樹菇子實體或菌絲體提取所得的多糖具有相同的功能性[19]。因此利用茶樹菇菌絲體為原料提取茶樹菇多糖，可獲得較大的效益，本研究以茶樹菇菌絲體為原料提取菌絲多糖用于深加工產(chǎn)品，通過優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[20-21]，對影響深層發(fā)酵的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳的發(fā)酵培養(yǎng)工藝，以期提高菌絲多糖含量[22-24]，為茶樹菇液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)茶樹菇多糖的產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

茶樹菇：由廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院菌種室提供。

1.1.2 試劑

麥芽糖（分析純）：上海伯奧生物科技有限公司；酵母提取粉（生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；硫酸鎂（分析純）：天津市百世化工有限公司；磷酸二氫鉀、硫酸錳（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；苯酚（分析純）：天津市諾克科技發(fā)展有限公司；硫酸鐵（分析純）：廣東汕頭市西隴化工廠；濃硫酸（分析純）：廣東廣試試劑科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）改良培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，氯霉素100 mg/L，瓊脂粉20 g/L，pH6.0。

液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基[25]：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO41.5 g/L，pH6.0。

以上培養(yǎng)基均于121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

YX-280型手提壓力蒸汽滅菌鍋：廣州越特科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：廣州佰倫凈化設(shè)備制造有限公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；WN-250B全溫型恒溫培養(yǎng)搖床：天津市歐諾儀器儀表有限公司；FA224電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；SC-3614高容量低速離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；V-5100可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

茶樹菇母種接種至新鮮配制的PDA平板，于26 ℃避光培養(yǎng)3～4 d，挑取菌落邊緣生長旺盛的菌絲轉(zhuǎn)接至PDA平板中，26 ℃避光培養(yǎng)3～4 d。

1.3.2 種子液的制備

將活化的茶樹菇菌種置于裝有適量無菌水的勻漿杯中進(jìn)行勻漿操作，吸取5 mL菌絲勻漿液接種至100 mL新鮮配制的液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻靜置過夜，于26 ℃搖床中130 r/min振蕩培養(yǎng)6 d。

1.3.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

培養(yǎng)基碳源對茶樹菇菌絲多糖發(fā)酵的影響：分別以不同碳源替代液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，考察蔗糖、麥芽糖、玉米淀粉（添加量20 g/L）對茶樹菇菌絲生物量、菌絲多糖含量的影響；確定最優(yōu)碳源種類后，分別考察碳源添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L）對茶樹菇菌絲生物量、菌絲多糖含量的影響。

培養(yǎng)基氮源對茶樹菇菌絲多糖發(fā)酵的影響：分別以不同氮源替代液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，考察尿素、硫酸銨、酵母提取粉（添加量10 g/L）對茶樹菇菌絲生物量、菌絲多糖含量的影響；確定最優(yōu)氮源種類后，分別考察氮源添加量（10 g/L、15 g/L、20g/L、25 g/L、30 g/L）對茶樹菇菌絲生物量、菌絲多糖含量的影響。

培養(yǎng)基促生長因子對茶樹菇菌絲多糖發(fā)酵的影響：在液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同促生長因子，分別考察MnSO4、FeSO4、維生素B1（vitamin B1，VB1）、維生素C（vitamin C，VC）（添加量2 g/L）對茶樹菇菌絲生物量、菌絲多糖含量的影響；確定最優(yōu)促生長因子種類后，分別考察促生長因子添加量（1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L）對茶樹菇菌絲生物量、菌絲多糖含量的影響。

培養(yǎng)時間對茶樹菇菌絲多糖發(fā)酵的影響：分別考察不同培養(yǎng)時間（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d）對茶樹菇菌絲生物量、菌絲多糖含量的影響。

搖床轉(zhuǎn)速對茶樹菇菌絲多糖發(fā)酵的影響：分別考察不同搖床轉(zhuǎn)速（110 r/min、120 r/min、130 r/min、140 r/min、150 r/min）對茶樹菇菌絲生物量、菌絲多糖含量的影響。

1.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以茶樹菇菌絲多糖含量（Y）為考察指標(biāo)，以麥芽糖添加量（A）、酵母提取粉添加量（B）、MnSO4添加量（C）、培養(yǎng)時間（D）為考察因素，利用Box-Behnken試驗設(shè)計[26-27]，通過Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面試驗優(yōu)化茶樹菇菌絲多糖發(fā)酵條件，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 茶樹菇菌絲多糖發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for optimization of fermentation conditions of mycelia polysaccharides from Agrocybe aegerita

1.3.5 測定方法

菌絲生物量的測量方法：采用直接干燥法[28]，其計算公式如下：

式中：X為樣品中的菌絲生物量，g/L；x1為干燥后的總質(zhì)量，g；x0為稱量瓶的質(zhì)量，g；x為過濾后所稱取的樣品質(zhì)量，g；V為所稱量的樣品過濾前總體積，L。

菌絲多糖含量采用苯酚-硫酸法[29-30]測定，其計算公式如下[31]：

式中：m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定液中含糖量，μg；V1為樣品定容體積，mL；V2為比色測定時所移取樣品測定液的體積，mL；m2為樣品質(zhì)量，g；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016對單因素試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及繪圖，Design-Expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出三維圖并對其結(jié)果趨勢進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹菇菌絲多糖發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 培養(yǎng)基碳源對茶樹菇菌絲生物量及菌絲多糖含量的影響

由圖1可知，麥芽糖對菌絲生物量及生產(chǎn)茶樹菇多糖的效果最好，以其為培養(yǎng)基碳源時獲得的茶樹菇菌絲生物量（菌絲干質(zhì)量）及菌絲多糖含量分別為6.53 g/L、2.68%，而作為速效碳源的葡萄糖對菌絲多糖的產(chǎn)率卻最低，有可能是被吸收后作為能量的形式被利用，從而轉(zhuǎn)化率較低。因此，選擇麥芽糖為液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)茶樹菇菌絲多糖的最佳培養(yǎng)基碳源。

圖1 碳源種類對茶樹菇菌絲生物量及多糖含量的影響Fig.1 Effect of carbon sources types on biomass and polysaccharide contents of mycelial from Agrocybe aegerita

由圖2可知，茶樹菇菌絲干質(zhì)量、菌絲多糖含量均隨麥芽糖添加量的增加而增加，麥芽糖添加量為30 g/L時，茶樹菇菌絲干質(zhì)量及多糖含量達(dá)到最高，分別為6.95 g/L、2.84%；當(dāng)麥芽糖添加量低于或高于30 g/L時，茶樹菇菌絲干質(zhì)量及多糖含量均呈下降趨勢。因此，選擇麥芽糖添加量30 g/L為茶樹菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源最佳添加量。

圖2 不同麥芽糖添加量對茶樹菇菌絲生物量及多糖含量的影響Fig.2 Effect of different maltose addition on biomass and polysaccharide contents of mycelial from Agrocybe aegerita

2.1.2 培養(yǎng)基氮源對茶樹菇菌絲生物量及菌絲多糖含量的影響

由圖3可知，酵母提取粉對菌絲生物量及生產(chǎn)茶樹菇多糖的效果最好，以其為培養(yǎng)基氮源時獲得的茶樹菇菌絲生物量（菌絲干質(zhì)量）及菌絲多糖含量分別為5.94 g/L、2.32%，而尿素（無機氮源）比有機氮源對菌絲多糖的產(chǎn)率最低，有可能在培養(yǎng)的過程中尿素中的能量并沒有被菌絲有效的利用，甚至是抑制其菌絲的生長，以致于菌絲沒有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)而引起生長遲緩。因此，選擇酵母提取粉為液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)茶樹菇菌絲多糖的最佳培養(yǎng)基氮源。

圖3 氮源種類對茶樹菇菌絲生物量及菌絲多糖含量的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources types on biomass and polysaccharide contents of mycelial from Agrocybe aegerita

由圖4可知，茶樹菇菌絲干質(zhì)量、菌絲多糖含量均隨酵母提取粉添加量的增加而增加，酵母提取粉添加量為20 g/L時，茶樹菇菌絲干質(zhì)量及多糖含量均達(dá)到最高，分別為5.36 g/L、2.33%；當(dāng)酵母提取粉添加量低于或高于20 g/L時，茶樹菇菌絲干質(zhì)量及多糖含量均呈下降趨勢。因此，選擇酵母提取粉添加量20 g/L為茶樹菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基氮源最佳添加量。

圖4 酵母提取粉添加量對茶樹菇菌絲生物量及多糖含量的影響Fig.4 Effect of yeast extract powder addition on biomass and polysaccharide contents of mycelial from Agrocybe aegerita

2.1.3 培養(yǎng)基促生長因子對茶樹菇菌絲生物量及菌絲多糖含量的影響

由圖5可知，MnSO4對菌絲生物量及生產(chǎn)茶樹菇多糖的效果最好，以其為培養(yǎng)基促生長因子時獲得的茶樹菇菌絲生物量（菌絲干質(zhì)量）及菌絲多糖含量分別為5.42 g/L、2.40%，而以維生素B1（有機小分子）為培養(yǎng)基促生長因子時菌絲多糖的產(chǎn)率最低，有可能是因為維生素B1在發(fā)酵培養(yǎng)中對于茶樹菇菌絲體內(nèi)酶的轉(zhuǎn)化效率較低，影響其新陳代謝，從而導(dǎo)致多糖產(chǎn)量下降。因此，選擇MnSO4為液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)茶樹菇菌絲多糖的最佳培養(yǎng)基促生長因子。

圖5 促生長因子種類對茶樹菇菌絲生物量及多糖含量的影響Fig.5 Effect of growth promoting factors on biomass and polysaccharide contents of mycelial from Agrocybe aegerita

由圖6可知，茶樹菇菌絲干質(zhì)量、菌絲多糖含量均隨促生長因子MnSO4用量的增加而增加，MnSO4添加量為2.0 g/L時，茶樹菇菌絲干質(zhì)量及多糖含量均達(dá)到最高，分別為5.95 g/L、2.42%；當(dāng)MnSO4添加量低于或高于2.0 g/L時，茶樹菇菌絲干質(zhì)量及多糖含量均呈下降趨勢。因此，選擇促生長因子MnSO4添加量2.0 g/L為茶樹菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基促生長因子最佳添加量。

圖6 MnSO4添加量對茶樹菇菌絲生物量及多糖含量的影響Fig.6 Effect of MnSO4 addition on biomass and polysaccharide contents of mycelial from Agrocybe aegerita

2.1.4 培養(yǎng)時間對茶樹菇菌絲生物量及菌絲多糖含量的影響

由圖7可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，茶樹菇菌絲生物量及菌絲多糖含量均呈上升趨勢，在培養(yǎng)6 d時達(dá)到最高值，分別是5.54 g/L、2.18%；之后均呈微下降趨勢，有可能是因為生長環(huán)境營養(yǎng)素含量不斷下降，而菌絲為維持生命活動而消耗自身組成成分，造成菌絲生物量及菌絲多糖含量下降。因此，選擇培養(yǎng)6 d是液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)茶樹菇菌絲生物量及多糖的最佳培養(yǎng)時間。

圖7 培養(yǎng)時間對茶樹菇菌絲生物量及多糖含量的影響Fig.7 Effect of culture time on biomass and polysaccharose contents of mycelial from Agrocybe aegerita

2.1.5 搖床轉(zhuǎn)速對茶樹菇菌絲生物量及菌絲多糖含量的影響

由圖8可知，隨搖床轉(zhuǎn)速的升高，茶樹菇菌絲生物量及菌絲多糖含量均呈稍微上升的趨勢，在搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min時達(dá)到最高值，分別是5.22 g/L、2.21%；之后均呈稍微下降的趨勢，有可能是因為搖床轉(zhuǎn)速越高，發(fā)酵容器內(nèi)的氧氣也隨之增加，而菌絲在一定氧氣濃度下能夠促進(jìn)自身生長，氧氣濃度過低或過高，均會抑制菌絲的生長，從而造成菌絲生物量及菌絲多糖含量下降。因此，選擇搖床轉(zhuǎn)速130 r/min是液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)茶樹菇菌絲生物量及多糖的最佳轉(zhuǎn)速。

圖8 搖床轉(zhuǎn)速對茶樹菇菌絲生物量及多糖含量的影響Fig.8 Effect of shaking speed on biomass and polysaccharose contents of mycelial from Agrocybe aegerita

2.2 茶樹菇菌絲多糖發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 茶樹菇菌絲多糖發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests for optimization of fermentation conditions of mycelial polysaccharides from Agrocybe aegerita

由多元回歸方程擬合，可得出茶樹菇菌絲多糖含量與4個因素之間的二次多項回歸方程式：Y=1.94A+3.46B+42.98C+4.78D-0.18AB+0.85AC-0.03AD+1.90BC-0.03BD+1.00CD-0.23A2-0.76B2-136.07C2-0.40D2-21.96，決定系數(shù)R2=0.967 3。由此可知，該回歸方程有較好的擬合性，對該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，回歸模型P值＜0.000 1，說明該模型有極顯著性，而失擬項P=0.243 8＞0.05，不顯著。由P值可知，一次項A、B，二次項A2、B2、C2、D2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；一次項C、D，交互項AB對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，各因素對多糖含量的影響力大小依次為麥芽糖添加量（A）＞酵母提取粉添加量（B）＞培養(yǎng)時間（D）＞MnSO4添加量（C）。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface tests

因麥芽糖添加量和酵母提取粉添加量之間有交互作用，對其進(jìn)行響應(yīng)面分析，探究其具體的交互關(guān)系規(guī)律，其響應(yīng)曲面及等高線見圖9。

圖9 麥芽糖添加量和酵母提取粉添加量交互作用對茶樹菇菌絲多糖含量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.9 Response surface plots and counter lines of effects of interaction between maltose and yeast extract addition on contents of mycelial polysaccharide from Agrocybe aegerita

由圖9可知，麥芽糖添加量和酵母提取粉添加量在相應(yīng)的試驗范圍內(nèi)，其交互作用有響應(yīng)極值，呈現(xiàn)由立體中心點（極值）向四周下降的趨勢，且其交互作用結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。由Design-Expert 8.06軟件計算即可預(yù)測出4個因素間的最佳發(fā)酵條件為麥芽糖添加量33.7 g/L、酵母提取粉添加量20.5 g/L、MnSO4添加量2.1 g/L、培養(yǎng)時間6.06 d，此條件下茶樹菇菌絲多糖含量理論值為3.81%。為方便實際操作，修改發(fā)酵條件為麥芽糖添加量34 g/L、酵母提取粉添加量21 g/L、MnSO4添加量2.0 g/L、培養(yǎng)時間6 d，在此條件下，得到的茶樹菇菌絲生物量為7.65 g/L，菌絲多糖含量實際值為3.73%。由響應(yīng)面法優(yōu)化得到的茶樹菇菌絲多糖液態(tài)發(fā)酵最佳工藝條件的回歸模型是符合實際的，可為今后茶樹菇菌絲多糖發(fā)酵工藝條件的選擇提供參考。

3 結(jié)論

對茶樹菇菌絲液體培養(yǎng)基組分優(yōu)化試驗中，通過對碳源、氮源、促生長因子、培養(yǎng)時間及搖床轉(zhuǎn)速的單因素試驗，得到最佳的液體培養(yǎng)條件為麥芽糖添加量34 g/L、酵母提取粉添加量21 g/L、MnSO4添加量2.0 g/L、培養(yǎng)時間6 d，搖床轉(zhuǎn)速130 r/min，KH2PO42.5 g/L，MgSO41.5 g/L，pH 6.0，在此工藝條件下，得到的茶樹菇菌絲生物量為7.65 g/L，菌絲多糖含量為3.73%。通過該研究，不僅可以解決茶樹菇子實體生長周期長，其多糖產(chǎn)品深加工成本高，而且可以從液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)所得到的菌絲體中提取到更多的茶樹菇多糖，能制作更實惠的有利于人體健康的茶樹菇多糖產(chǎn)品，實現(xiàn)經(jīng)濟效益與社會效益并存的“雙贏”價值。