pH對紅色紅曲菌（Monascus ruber）M7生長及產(chǎn)孢的影響

董鈺鑫，陳 莎，高夢祥，李 利

（長江大學 生命科學學院，湖北 荊州 434025）

紅曲菌（Monascusspp.）又稱為紅曲霉，能產(chǎn)生紅曲色素、Monacolin K等有益次生代謝產(chǎn)物，以及淀粉酶、蛋白酶、酯化酶等多種酶類，是天然食用色素[1-2]、黃酒[3-4]、食醋[5-6]、降血脂藥物[7-8]等發(fā)酵生產(chǎn)中的重要工業(yè)絲狀真菌，在東亞有兩千多年的應用歷史[9]。據(jù)統(tǒng)計，在我國，僅色素用紅曲的年產(chǎn)量就超過2萬t[9]。近年來，隨著紅曲菌代謝產(chǎn)物的抗癌[10-12]、抗炎[13]、抗氧化[14-15]、降血壓[15-18]、預防肥胖[19-22]、抑菌[23]等生物活性的不斷證實，紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)品的市場前景越來越廣闊，需求量不斷增大。

產(chǎn)生孢子是大部分絲狀真菌進行繁殖的主要方式，一般在營養(yǎng)匱乏、高溫、干燥等對菌體生長不利的逆境條件下大量產(chǎn)生[24-25]，是絲狀真菌對逆境的一種應答方式。在絲狀真菌的發(fā)酵生產(chǎn)及實驗室研究過程中，通常需要培養(yǎng)與收集大量的高濃度孢子，用于菌種保藏、發(fā)酵接種、誘變育種和基因工程菌株構(gòu)建等過程[26]。同時，孢子的抗逆性較營養(yǎng)細胞強，存活時間長，是制作直投式發(fā)酵劑的良好原料。因此，提高孢子產(chǎn)量，對工業(yè)絲狀真菌具有重要意義。研究表明，碳源、氮源、碳氮比、溫度、光照、含水量、pH等培養(yǎng)條件均能影響絲狀真菌產(chǎn)孢，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，可以提高孢子產(chǎn)量[24，27]。

紅曲菌具有無性繁殖和有性繁殖兩種繁殖方式。其無性繁殖時可在菌絲頂端產(chǎn)生分生孢子，多為單生，可見雙生或串生；有性繁殖則產(chǎn)生閉囊殼，閉囊殼內(nèi)形成多個子囊孢子[28]。相對曲霉、毛霉、根霉等常見食品工業(yè)絲狀真菌，紅曲菌的產(chǎn)孢能力較弱，產(chǎn)孢量偏少，造成了紅曲菌工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)和實驗室基礎及應用研究的障礙。為了提高紅曲菌的孢子產(chǎn)量，目前已有研究探討了培養(yǎng)基成分和環(huán)境條件等對紅曲菌產(chǎn)孢量的影響，發(fā)現(xiàn)中性pH條件更利于紅曲菌產(chǎn)孢[29-31]。pH是一種重要的環(huán)境因子，對微生物的生長、繁殖及代謝有著重要影響。雖然紅曲菌生長的pH范圍為pH 2.5～8.0，但最適生長pH范圍為3.5～5.0[29]，與其最佳產(chǎn)孢pH條件差異較大。因此，利于紅曲菌產(chǎn)孢的pH條件對其生長有一定影響。在絲狀真菌形成生殖器官和孢子之前往往需要經(jīng)過一段時間的營養(yǎng)體生長，前期過少的菌絲生長量必然會制約后期產(chǎn)孢量的提高。

本研究以紅色紅曲菌（Monascus ruber）M7為研究對象，探討不同pH對其孢子萌發(fā)、菌落生長、有性繁殖和無性繁殖的影響，分析其生長、繁殖兩個不同階段對環(huán)境pH的需求差異，從而在孢子培養(yǎng)過程中對pH進行分段控制，以期減小產(chǎn)孢條件對菌絲生長的影響，提高孢子產(chǎn)量，為菌株M7工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)和實驗室研究過程中的孢子培養(yǎng)技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

紅色紅曲菌（Monascus ruber）M7：華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗保藏中心保藏，編號為CCAM070120。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、蔗糖、檸檬酸、磷酸氫二鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂、酵母膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：取去皮馬鈴薯200 g切丁，加1 000 mL去離子水煮沸20～30 min，用8層紗布過濾后定容到1 000 mL，加入20 g葡萄糖，15 g瓊脂，pH自然。

2×PDA培養(yǎng)基：取去皮馬鈴薯400 g切丁，加1 000 mL去離子水煮沸20～30 min，用8層紗布過濾后定容到1 000 mL，加入40 g葡萄糖，30 g瓊脂，pH自然。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：制備方法同上述PDA培養(yǎng)基，不含瓊脂，pH自然或根據(jù)需要用HCl和NaOH調(diào)至5.0。

2×PDB培養(yǎng)基：制備方法同上述2×PDA培養(yǎng)基，不含瓊脂，pH自然或根據(jù)需要用HCl和NaOH調(diào)至5.0。

察氏酵母膏瓊脂（Czapek yeast extract agar，CYA）培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g/L，硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）0.01 g/L，酵母膏5.0 g/L，蔗糖30 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH自然。

察氏酵母膏液體（Czapek yeast extract broth，CYB）培養(yǎng)基：配方同上述CYA培養(yǎng)基，不含瓊脂，用HCl和NaOH調(diào)至pH5.0。

上述培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

PB-10 pH計：德國賽多利斯（中國）有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HFsafe-1200生物安全柜：上海力申科學儀器有限公司；IS-RDS3恒溫搖床：美國精騏有限公司；Allegra X-30R離心機：德國Beckman公司；HVE-50高壓滅菌鍋：日本株式會社平山制作所；BM1000光學顯微鏡：南京江南永新光學有限公司；G6-1412116全自動菌落分析儀：杭州迅數(shù)科技有限公司；BX63+DP73正置顯微鏡：日本奧林巴斯公司；DHC-9073BS電熱恒溫鼓風干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株M7的活化

將保藏的紅色紅曲菌（M.ruber）M7接種到PDA平板中進行活化，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后備用。

1.3.2 菌株M7孢子液的制備參照LI L等[32]的方法，從CYA斜面收集孢子并用血球計數(shù)板測定孢子濃度，調(diào)整孢子濃度至5×105個/mL。

1.3.3 菌株M7的培養(yǎng)

將2×PDA培養(yǎng)基趁熱分別與等體積的0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0）或0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH為8.5或9.0）混勻后倒平板，在平板中心點接活化好的紅色紅曲菌M7，28 ℃恒溫培養(yǎng)10 d。

1.3.4 菌株M7菌落生長速度的測定

在1.3.3菌種培養(yǎng)期間每隔2 d觀察菌落生長狀況并測量菌落直徑，繪制紅色紅曲菌M7的菌落生長曲線，確定其生長所需的最適pH。

1.3.5 菌株M7繁殖結(jié)構(gòu)的顯微觀察及孢子計數(shù)

菌株M7的培養(yǎng)方法同1.3.3，顯微觀察和孢子計數(shù)均在第10天進行。顯微觀察時，用滅菌的牙簽在菌落表面刮取少量菌絲制備水浸片，觀察無性繁殖結(jié)構(gòu)（分生孢子）和有性繁殖結(jié)構(gòu)（閉囊殼）的形態(tài)。孢子計數(shù)時，先用全自動菌落分析儀中測量菌落的面積S（cm2）；再向培養(yǎng)皿中加入一定量的去離子水，用接種環(huán)輕輕刮下菌落表面的孢子，得到孢子懸浮液，體積記為VC（mL）；然后將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移到裝有玻璃珠的三角瓶中，25 ℃、200 r/min振搖20 min，參考LI L等[32]的實驗方法利用雙層擦鏡紙過濾除去菌絲，濾液用血球計數(shù)板進行孢子計數(shù)，孢子濃度記為CC（個/mL）。每種pH條件接種3～5個平板，每個平板得到的孢子懸液計數(shù)3次。單位菌落面積的產(chǎn)孢量計算公式如下：

式中：PC為單位菌落面積的產(chǎn)孢量，個/cm2；CC為孢子濃度，個/mL；VC為孢子懸液體積，mL；S為菌落面積，cm2。

1.3.6 菌株M7孢子萌發(fā)率的測定

取200 μL新鮮制備的孢子液（5×105個/mL）于無菌的1.5mL離心管中，10 000 r/min離心5 min，用移液器小心取出清液，孢子則以沉淀形式保留在離心管中。向離心管中加入100 μL 2×PDB和100 μL 0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）或0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH為8.5或9.0），用移液器吸吹使孢子懸浮，于30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)的第4和第8小時取樣，用血球計數(shù)板觀察并計數(shù)已萌發(fā)和未萌發(fā)的孢子，分別記為a（個/mL）和b（個/mL）。每種pH條件設置3個平行，每個樣品計數(shù)3次。孢子萌發(fā)率計算公式如下：

式中：X為孢子萌發(fā)率，%；a為已萌發(fā)孢子數(shù)量，個/mL；b為未萌發(fā)孢子數(shù)量，個/mL。

1.3.7 菌株M7孢子培養(yǎng)過程中的pH分段控制

孢子培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為PDB和CYB培養(yǎng)基，其初始pH用HCl和NaOH溶液調(diào)到5.0。取0.5 mL新鮮制備的孢子液（5×105個/mL）接種到裝液量為35 mL/250 mL PDB或CYB培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)8 d。此時，菌絲體的生長進入平臺期，在液體培養(yǎng)基表面形成一層菌膜。靜置培養(yǎng)8 d后，向培養(yǎng)液中加入等體積的無菌的0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH為7.0或8.0），繼續(xù)在28 ℃培養(yǎng)4 d。對照組不加緩沖液，其他培養(yǎng)條件與實驗組一致。培養(yǎng)結(jié)束后，用接種針挑出菌膜至裝有玻璃珠的錐形瓶中，用兩根接種針將菌膜劃破，使菌絲分散開來，加入適量的蒸餾水（VL，mL），25 ℃、200 r/min振搖20 min，孢子計數(shù)方法同1.3.5，孢子濃度記為CL（個/mL）；雙層擦鏡紙上收集到的菌絲用70 mL無菌水洗滌，60 ℃烘干至恒質(zhì)量）。每組實驗接種3～5瓶，每個樣品的孢子濃度計數(shù)3次。單位質(zhì)量菌絲的產(chǎn)孢量計算公式如下：

式中：PL為單位質(zhì)量菌絲的產(chǎn)孢量，個/g；CL為孢子濃度，個/mL；VL為孢子懸液體積，mL；m為菌絲干質(zhì)量，g。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016進行均值計算、標準偏差計算和差異顯著性分析，用Origin 7.0軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對菌株M7孢子萌發(fā)的影響

孢子萌發(fā)是孢子發(fā)育成營養(yǎng)細胞或菌絲的過程，是絲狀真菌營養(yǎng)生長過程中的關(guān)鍵步驟。在極端pH值、干燥、低溫、營養(yǎng)貧乏等環(huán)境條件下，孢子代謝不活躍，處于休眠狀態(tài)，當pH、濕度、溫度、營養(yǎng)等環(huán)境條件適宜時，孢子開始萌發(fā)生長出菌絲[24，33]。不同pH條件下菌株M7孢子萌發(fā)隨時間變化見圖1。由圖1可知，酸性條件下的孢子萌發(fā)速度和萌發(fā)率均顯著高于中堿性條件。在pH 3.0～6.0條件下，培養(yǎng)4 h后的萌發(fā)率為75%以上，其中pH 4.0和pH 5.0最高，分別為（84.8±2.5）%和（86.3±4.9）%，培養(yǎng)8 h后的萌發(fā)率均達100%；在pH 7～9條件下，培養(yǎng)4 h后，未觀察到孢子萌發(fā)，培養(yǎng)8 h后，pH 7.0和pH 8.0時有少量孢子萌發(fā)，萌發(fā)率分別為（22.7±1.6）%和（1.0±0.8）%，而pH 8.5～9.0時仍未觀察到孢子萌發(fā)。由此可見，pH＞8.0的堿性條件為紅色紅曲菌M7孢子萌發(fā)的極端pH條件，在該條件下孢子不易萌發(fā)；pH 3.0～6.0為孢子萌發(fā)的適宜pH條件，孢子可100%萌發(fā)。因此，最適的孢子萌發(fā)pH值為4.0～5.0。

圖1 不同pH值條件下菌株M7的孢子萌發(fā)率Fig.1 Spore germination rate of strain M7 under different pH conditions

2.2 pH對菌株M7生長速度的影響

不同pH條件下紅色紅曲菌M7菌落直徑隨時間的變化見圖2。

圖2 不同pH值條件下菌株M7的菌落生長Fig.2 Colony growth of strain M7 under different pH conditions

由圖2可知，在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)，紅色紅曲菌生長較快，形成的菌落較大，其中pH 5.0最佳，第10天時菌落直徑為（64.0±2.3）mm；在pH 3.0和pH 7.0時，菌落生長明顯減慢，第10天時菌落直徑分別約為（28.5±0.5）mm和（36.9±0.1）mm；而在pH 8.0～9.0時，紅色紅曲菌M7的生長受到嚴重抑制，在第10天時，pH 8.0條件下的菌落直徑很小，為（5.4±0.3）mm，pH 8.5～9.0條件下未見菌落生長。由此可見，pH＞8.0的堿性條件為紅曲菌M7菌絲生長的極端pH條件，在該條件下菌絲不生長或者死亡。因此，pH 4.0～6.0為生長的適宜pH條件，其中pH 5.0時菌落生長最快，為最佳的pH條件。

2.3 pH對菌株M7繁殖的影響

由上述孢子萌發(fā)和菌落生長實驗結(jié)果可知，紅色紅曲菌M7生長的pH范圍為3.0～8.0，pH＞8.0的堿性條件為超出其生長的極端pH條件。在紅色紅曲菌M7生長的pH范圍內(nèi)，分析了pH對其繁殖的影響，閉囊殼、分生孢子的顯微觀察及產(chǎn)孢量結(jié)果分別見圖3～圖5。

圖3 不同pH值條件下菌株M7閉囊殼的顯微觀察Fig.3 Microscopic observation of cleistothecia of strain M7 under different pH conditions

圖4 不同pH條件值下菌株M7分生孢子的顯微觀察Fig.4 Microscopic observation of conidia of strain M7 under different pH conditions

圖5 不同pH值條件下菌株M7的產(chǎn)孢量Fig.5 Spore production of strain M7 under different pH conditions

由圖3和圖4可知，在酸性條件下（pH 3.0～6.0），紅色紅曲菌既能進行無性繁殖，也能進行有性繁殖，可見分生孢子和閉囊殼兩種繁殖結(jié)構(gòu)；在中堿性條件下（pH 7.0～8.0），紅曲菌以無性繁殖為主，可見大量分生孢子，但未觀察到閉囊殼。由圖5可知，紅曲菌的產(chǎn)孢能力隨著pH的升高而提高，提高幅度在中堿性條件下顯著增大。在pH 7.0和pH 8.0時，單位菌落面積的產(chǎn)孢量分別為（19.3±4.2）×104個/cm2和（69.3±2.6）×104個/cm2，分別為pH 3.0～6.0時的4～12倍和15～43倍，是較好的產(chǎn)孢pH條件。

2.4 pH分段控制對菌株M7產(chǎn)孢的促進效果

由上述研究結(jié)果可知，紅色紅曲菌M7適宜的產(chǎn)孢pH條件（pH 7.0～8.0）與其適宜的孢子萌發(fā)pH條件（pH 3.0～6.0）和菌絲生長條件（pH 4.0～5.0）存在較大差異，該結(jié)果與不良生長環(huán)境能誘導微生物產(chǎn)孢的報道一致[24，27]。由于孢子的產(chǎn)生需要建立在菌絲大量生長的前提下，因此有必要根據(jù)紅色紅曲菌生長和繁殖對pH的需求差異，對產(chǎn)孢培養(yǎng)過程中的pH進行分段控制。利用PDB和CYB兩種液態(tài)培養(yǎng)基對紅曲菌進行產(chǎn)孢培養(yǎng)，其初始pH設置為最佳生長的pH條件（pH 5.0），以利于培養(yǎng)前期的孢子萌發(fā)和菌絲生長；當生長進入平臺期（8 d后），加入pH 7或8的緩沖液將培養(yǎng)液的pH調(diào)整至適宜的產(chǎn)孢pH條件（pH 7.0～8.0），以促進培養(yǎng)后期大量產(chǎn)孢。pH分段控制對菌株M7產(chǎn)孢的促進效果結(jié)果見圖6。

圖6 pH分段控制條件下菌株M7產(chǎn)孢量Fig.6 Spore production of strain M7 under pH subsection control

由圖6可知，pH分段控制不影響菌絲的生長，但能顯著地促進產(chǎn)孢量，調(diào)整培養(yǎng)后期的pH至7.0、8.0，在PDB中的單位質(zhì)量菌絲的產(chǎn)孢量分別為（12.6±0.1）×105個/g和（16.5±1.9）×105個/g，相比對照組提高了12倍和16倍，在CYB中的單位質(zhì)量菌絲的產(chǎn)孢量分別為（10.7±0.9）×106個/g和（12.7±1.0）×106個/g，相比對照組提高了3倍和4倍。

3 結(jié)論

菌株M7孢子萌發(fā)的較適pH范圍為pH 3.0～6.0，最佳pH范圍為pH 4.0～5.0，在pH 7.0～8.0時孢子萌發(fā)受到顯著抑制；菌株M7菌落生長的較適pH范圍為4.0～6.0，最佳pH為5.0，在pH 3.0和7.0時菌落生長明顯減慢，pH 8.0時菌落生長受到嚴重抑制；pH＞8.0的堿性條件為極端pH條件，孢子萌發(fā)和菌落生長完全被抑制。在菌株M7生長的pH范圍內(nèi)，其產(chǎn)孢能力隨著pH的升高而提高，適宜的產(chǎn)孢pH范圍為pH 7.0～8.0，產(chǎn)孢量為pH 3.0～6.0時的4～43倍。該結(jié)果表明，不良生長pH條件能誘導紅色紅曲菌M7大量產(chǎn)孢。根據(jù)菌株M7生長和繁殖對pH的需求差異，通過對產(chǎn)孢培養(yǎng)過程中的pH進行分段控制，顯著提高了孢子產(chǎn)量，當控制培養(yǎng)前期pH為5.0、后期pH為7.0～8.0時，PDB培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量提高了12～16倍，CYB培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量提高了3倍和4倍。本研究結(jié)果可為紅曲菌工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)和實驗室研究過程中孢子培養(yǎng)技術(shù)提供參考。