一種稻瘟病菌培養(yǎng)產(chǎn)孢培養(yǎng)基的配制與效比分析

吳斯駿 孫強 陳洪凡 楊增青 徐沛東 楊迎青 蘭波

摘要 [目的]篩選產(chǎn)孢效果好、成本低、操作簡便的培養(yǎng)基。[方法]采用稻秸浸出液與PDA培養(yǎng)基為主要成分配制6組不同培養(yǎng)基，比較其稻瘟病菌的培養(yǎng)產(chǎn)孢情況。[結(jié)果]配組稻秸浸出液 ∶PDA培養(yǎng)基=1 ∶1具有最快的培養(yǎng)速率和最大的產(chǎn)孢量，并且與燕麥片培養(yǎng)基和大麥粒培養(yǎng)基相比在產(chǎn)孢效率和經(jīng)濟成本上也更具有優(yōu)勢。[結(jié)論]該新型培養(yǎng)基在水稻稻瘟病菌致病性與水稻品種抗瘟性鑒定研究中具有較高的應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞 稻瘟病菌；產(chǎn)孢；培養(yǎng)基；配制

中圖分類號 S435.111.4+1 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）18-0118-03

Preparation and Effect Ratio Analysis of a Medium for Pyricularia oryzae Culture and Sporulation

WU Sijun1， SUN Qiang2， CHEN Hongfan1 et al

（1. Plant Protection Research Institute， Jiangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanchang， Jiangxi 330200；2. Huangdao EntryExit Inspection and Quarantine Bureau， Qingdao， Shandong 266555）

Abstract [Objective] The aim was to screen out a medium with good spores effect， low cost and simple operation. [Method] The culture effect of Pyricularia oryzae sporulation of six groups of culture medium which used rice straw leaching liquid and PDA culture medium as main components was compared. [Result] The formula rice straw extract ∶PDA medium = 1 ∶1 had the fastest culture rate and the largest amount of sporulation. Compared with oatmeal culture medium and barley culture medium， the culture medium also had advantages in the efficiency and economic cost of sporulation. [Conclusion] The new culture medium has good application value in the identification of pathogenicity and blast resistance of rice varieties.

Key words Pyricularia oryzae；Sporulation；Culture medium；Preparation

稻瘟病是水稻的首要病害[1-2]。在稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）生理分化以及水稻種質(zhì)資源的抗瘟性接種測定等研究中都需要人工培養(yǎng)菌株，以獲得大量分生孢子。國內(nèi)外曾先后做過誘發(fā)稻瘟比較產(chǎn)孢方法及篩選適宜產(chǎn)孢培養(yǎng)基[3-5]，最常見的是采用高粱、稻節(jié)、大麥或小麥粒等組織培養(yǎng)基培養(yǎng)稻瘟病病菌分生孢子。但這些產(chǎn)孢方法操作過程繁瑣、培養(yǎng)時間長，產(chǎn)孢效果不甚理想，且在培養(yǎng)過程中容易受到雜菌污染[6]。關(guān)于常用的燕麥片培養(yǎng)基、米糠培養(yǎng)基、粗面粉培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基和酵母淀粉培養(yǎng)基等的產(chǎn)孢試驗也有報道[6-9]，但有的產(chǎn)孢效果不理想，有的培養(yǎng)材料不易獲得。為獲得產(chǎn)孢效果好、成本低、操作簡便的培養(yǎng)基，筆者采用當(dāng)?shù)厮靖碑a(chǎn)物水稻秸稈為主要原料，通過不同配方的配組確定了一種新型的稻瘟病菌培養(yǎng)產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

1-10（ZB13），由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院有害生物控制重點實驗室保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基。

稻秸浸出液：30 g稻秸剪碎，用1 000 mL清水浸泡16～24 h；馬鈴薯浸出液：200 g馬鈴薯去皮，切碎，用1 000 mL清水浸泡2 h；

稻秸玉米粉培養(yǎng)基：稻秸30 g，玉米粉20 g，瓊脂18 g，清水1 000 mL；

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，清水1 000 mL；

燕麥片培養(yǎng)基：燕麥片50 g，蔗糖 20 g，瓊脂 16 g，水 1 000 mL；

配組①：稻秸浸出液+馬鈴薯浸出液（1 ∶1）；

配組②：稻秸浸出液+PDA培養(yǎng)基（1 ∶1）；配組③：稻秸培養(yǎng)基+馬鈴薯浸出液（1 ∶1）；

配組④：稻秸培養(yǎng)基+PDA培養(yǎng)基（1 ∶1）；

配組⑤：稻秸培養(yǎng)基；

配組⑥：PDA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)孢方法。

從已純培養(yǎng)的供試菌株中挑取大小相同的菌塊接種到6種供試配方培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（9 cm）上，置于在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。待平板上菌絲長滿后（約 7 d），置于室內(nèi)組織培養(yǎng)架上黑光燈光照培養(yǎng)3 d，室溫25～28 ℃。待充分產(chǎn)孢后，每皿用15 mL 蒸餾水洗下孢子，100倍顯微鏡下計數(shù)孢子數(shù)量。

1.2.2 同一菌株在不同配方培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量的比較。

供試菌株1-10在 PDA 培養(yǎng)基上活化后，用打孔器獲得直徑5 mm、成熟度一致的菌碟，接種于不同配方培養(yǎng)基中央，28 ℃培養(yǎng) 7 d，再置于黑光燈下照射3 d，用15 mL 滅菌水洗下表面菌絲，尼絨紗布過濾，即獲得稻瘟菌分生孢子懸浮液，用100倍顯微鏡觀察，計數(shù)一個視野下孢子的數(shù)量，重復(fù) 3 次，取平均值進行比較。

1.2.3 同一菌株在不同產(chǎn)孢培養(yǎng)基上生長速度的比較。

供試菌株 1-10 在不同配方培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d 后，測量菌落直徑，計算稻瘟菌生長速度，重復(fù) 3 次，取平均值進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一菌株在不同配方培養(yǎng)基上生長速率比較

由表1和圖1可知，6種不同配組的培養(yǎng)基對稻瘟病菌的培養(yǎng)速度有顯著差異。供試菌株1-10在培養(yǎng)基配組①、配組②、配組③、配組④、配組⑤、配組⑥上28 ℃培養(yǎng) 7 d的平均菌落直徑分別為7.66、7.62、7.38、7.51、6.45、7.39 cm，配組①、配組②與配組④菌株生長最好，三者之間無顯著差異，配組③與配組⑥培養(yǎng)菌株速度次之，配組⑤最差。

2.2 同一菌株在不同配方培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量比較

由表2可知，供試菌株1-10在6種不同配組培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量相差較大，差異顯著。利用培養(yǎng)基配組①、配組②、配組③、配組④、配組⑤、配組⑥產(chǎn)孢在一個顯微視野下的平均孢子數(shù)分別為35.3、50.3、43.3、35.6、44.6、19.3個。配組②產(chǎn)孢最好，其次為配組③和配組⑤，再其次為配組①和配組④，配組⑥產(chǎn)孢最差。

2.3 配組②與燕麥片培養(yǎng)基、大麥粒培養(yǎng)基培養(yǎng)、產(chǎn)孢的優(yōu)勢比較

利用配組②、燕麥片培養(yǎng)基、大麥粒培養(yǎng)基各培養(yǎng)供試菌株1-10并產(chǎn)孢，比較整個產(chǎn)孢周期長度、產(chǎn)孢量和經(jīng)濟成本。其中，產(chǎn)孢量的比較利用燕麥片培養(yǎng)基各1 L制成50個培養(yǎng)平板培養(yǎng)稻瘟病菌并產(chǎn)孢，并用1 000 mL無菌水洗下所有平板上的菌絲、孢子，用雙層紗布過濾獲得孢子懸液，100倍顯微鏡下鏡檢孢子數(shù)，記錄一個視野下的孢子數(shù)量，3次重復(fù)，取平均值。用容器量取1 L大麥粒做成大麥粒培養(yǎng)基，接種供試稻瘟病菌產(chǎn)孢，產(chǎn)孢后用1 000 mL洗下大麥粒上的稻瘟病菌孢子，雙層紗布過濾，100倍顯微鏡下鏡檢孢子數(shù)，記錄一個視野下的孢子數(shù)量，3次重復(fù)，取平均值。

由表3可知，3種培養(yǎng)基配組②、燕麥片培養(yǎng)基、大麥粒培養(yǎng)基整個產(chǎn)孢周期所需要的天數(shù)分別為10、12、15 d，每個

顯微視野下平均產(chǎn)孢量分別為42、32、35個。可見，配組②在產(chǎn)孢量與產(chǎn)孢周期上均優(yōu)于燕麥片培養(yǎng)基和大麥粒培養(yǎng)基，綜合培養(yǎng)基原料的經(jīng)濟成本與獲得難易程度，認(rèn)為配組②在稻瘟病菌培養(yǎng)產(chǎn)孢方面是一種非常理想的新型培養(yǎng)基組方，適宜廣泛推廣應(yīng)用。

3 結(jié)論與討論

從總體趨勢看，該研究配制的6種稻瘟病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基菌株生長速率從快到慢依次為配組②、配組①、配組④、配組③、配組⑥、配組⑤；產(chǎn)孢量在6種不同配制培養(yǎng)基上從多到少依次為配組①、配組⑤、配組③、配組④、配組①、配組⑥。由此可見，配組②是最佳的稻瘟病菌培養(yǎng)、產(chǎn)孢培養(yǎng)基，其主要成分為1份稻秸浸出液與1份PDA培養(yǎng)基等比例混合而成。供試菌株在該培養(yǎng)基上生長最快，菌絲生長最旺，產(chǎn)孢量最多，并且菌絲生長狀態(tài)與產(chǎn)孢量之間呈正相關(guān)。

該研究配制的配組②培養(yǎng)基（稻秸浸出液 ∶PDA培養(yǎng)基=1 ∶1，V/V）接種稻瘟病菌生長速度最快，產(chǎn)孢量最多，這對于一般的稻瘟病菌生理小種鑒定、致病性分化研究和水稻品種抗性鑒定研究完全能夠達(dá)到要求。該研究進行了配組②、燕麥片培養(yǎng)基、大麥粒培養(yǎng)基稻瘟病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)各項指標(biāo)比較，發(fā)現(xiàn)供試菌株在配組②培養(yǎng)基上從接菌到產(chǎn)孢所需時間為10 d，燕麥片培養(yǎng)基為12 d，大麥粒培養(yǎng)基為15 d；產(chǎn)孢量從多到少分別是配組②（42個/顯微視野）、大麥粒培養(yǎng)基（35個/顯微視野）、燕麥片培養(yǎng)基（32個/顯微視野）?？梢?，配組②培養(yǎng)基在稻瘟病菌產(chǎn)孢等各項指標(biāo)上不比燕麥片培養(yǎng)基和大麥粒培養(yǎng)基差，反而略有優(yōu)勢，綜合考慮培養(yǎng)基原料的經(jīng)濟成本及來源難易程度，認(rèn)為在配組②是在稻瘟病菌培養(yǎng)、產(chǎn)孢研究中更具有優(yōu)勢的培養(yǎng)基，至少是目前主要稻瘟病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的有益補充，具有很高的應(yīng)用價值。

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