張東輝,陳玲玲,陳 晨,白玉彬1,董 朕,李 冰,周緒正
(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)村農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室 甘肅省新獸藥工程重點實驗室,甘肅蘭州 730050)
羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液屬于創(chuàng)新型復(fù)方制劑,主要用于治療牛、羊吸蟲病、線蟲病,尤其是對肝片吸蟲效果最佳,同時對絳蟲也有一定效果[1-6]。羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液是多劑量包裝口服混懸液,由于口服制劑的特殊性,在生產(chǎn)制備過程中很難完全避免微生物污染,為了保證制劑的安全性,防止藥物變質(zhì)而對患畜造成傷害,需要在處方中加入適量的抑菌劑,以達(dá)到防腐目的[7-9]。目前苯甲酸及其鈉鹽由于抑菌范圍廣,常常作為口服液體制劑的防腐劑[10],但是隨著苯甲酸鈉的廣泛應(yīng)用,其毒副作用也日漸突出,比如遺傳毒性、生殖毒性、致癌性等[11-14]。國外已經(jīng)開始禁止苯甲酸及其鈉鹽的使用,但在國內(nèi)作為防腐劑仍然廣泛用于食品和藥物制劑中[15]。因此,抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制成為保證藥物安全的關(guān)鍵問題之一[16],故應(yīng)對其含量進(jìn)行嚴(yán)格控制。本文建立了高效液相色譜法(HPLC)對羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液中的苯甲酸鈉進(jìn)行含量測定,以便控制防腐劑苯甲酸鈉的使用量,保證制劑的安全性,為制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。
1.1.1 藥品 羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液(批號:20210304、20210305、20210306),中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制。
1.1.2 主要試劑 苯甲酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品(批號:100433-201702),純度99.7%,中國食品藥品檢定研究院提供;甲醇(色譜純),賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品;超純水,廣州屈臣氏食品飲料有限公司制備。
1.1.3 主要儀器 高效液相色譜儀(Agilent-LC 1290),安捷倫科技有限公司產(chǎn)品;電子天平(ME403),梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品;數(shù)控超聲波清洗器(KQ-600DE),昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品;優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(MPT-Ⅱ-40L),上海優(yōu)普實業(yè)有限公司產(chǎn)品。
1.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:35℃;進(jìn)樣量:10 μL;流速:1.0 mL/min;流動相:A相為0.02 mmol/L乙酸銨水溶液-B相為甲醇(85∶15);檢測波長:224 nm。
1.2.2 溶液配制
(1)供試品溶液:精密量取羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液5 mL,置于100 mL量瓶中,加水溶解超聲10 min并稀釋至刻度,搖勻。離心,取上清液,即為供試品溶液。
(2)對照品溶液:精密稱定苯甲酸鈉對照品12.5 mg,置于25 mL量瓶中,用水超聲溶解并稀釋定容至刻度,充分搖勻,得對照品貯備液。準(zhǔn)確移取對照品貯備液1.0 mL于10 mL量瓶中,用水稀釋至刻度,制成50 μg/mL的苯甲酸鈉對照品溶液。
(3)空白樣品溶液:精密量取不含抑菌劑苯甲酸鈉的羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液5 mL,置于100 mL量瓶中,加水溶解超聲10 min并稀釋至刻度,搖勻。離心,取上清液,即為空白樣品溶液。
1.2.3 專屬性試驗 分別取“1.2.2”項下的對照品溶液、供試品溶液和空白樣品溶液,按“1.2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。
1.2.4 線性關(guān)系 分別精密量取50 μg/mL的苯甲酸鈉對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL量瓶中,用水稀釋定容至刻度,搖勻,制成濃度為2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μg/mL的系列對照品溶液。精密量取10 μL,按“1.2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。以峰面積(y)為縱坐標(biāo),濃度(x,μg/mL)為橫坐標(biāo),按最小二乘法進(jìn)行線性回歸。
1.2.5 精密度 進(jìn)樣精密度:精密量取“1.2.4”標(biāo)準(zhǔn)曲線下含15.0 μg/mL的苯甲酸鈉對照品溶液10 μL,按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析,連續(xù)分析6次,記錄色譜峰面積,計算峰面積RSD。
中間精密度:精密量取“1.2.2”供試品溶液6份,由甲、乙兩人分別在不同時間段,使用兩臺不同儀器,按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜峰面積,計算峰面積RSD。
1.2.6 定量限與檢測限 取“1.2.2”項下對照品貯備液逐級稀釋,按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。以信噪比S/N為3時對應(yīng)的濃度為檢測限(LOD);以信噪比S/N為10時對應(yīng)的濃度為定量限(LOQ)。
1.2.7 溶液穩(wěn)定性試驗 按“1.2.2”方法制備供試品溶液,在室溫條件下放置,分別于0、2、4、6、8、12 h取樣10 μL,按“1.2.1”色譜條件的進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,計算峰面積的RSD值。
1.2.8 回收率試驗 精密量取不含抑菌劑苯甲酸鈉的供試品5 mL,置于100 mL量瓶中,共9份,分別加入 “1.2.2”對照品儲備液1.6、2.0、2.4 mL,并用水稀釋定容至刻度,搖勻,作為低、中、高(80%、100%、120%)3個濃度水平的供試品溶液,每個水平平行制備3份。按“1.2.1”條色譜條件進(jìn)樣分析,計算加樣回收率。
1.2.9 樣品含量測定 取羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液3批樣品(批號:20210304、20210305、20210306),按“1.2.2”條方法制備供試品溶液,按“1.2.1”條色譜條件進(jìn)樣分并計算樣品含量。
由圖1可知,在該色譜條件下,空白樣品溶液對苯甲酸鈉的測定無干擾;苯甲酸鈉對照品的保留時間為5.440 min,供試品溶液的保留時間為5.206 min,表明在同一色譜條件下主峰保留時間基本一致,偏差在允許范圍內(nèi)。
A.空白樣品溶液;B.供試品溶液;C.對照品溶液A.Blank sample solution;B.Test solution;C.Control solution圖1 專屬性試驗色譜圖Fig.1 Chromatogram of the specificity test
以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),采用最小二乘法做線性回歸,得苯甲酸鈉的回歸方程為y=34.24x-5.1681,R2=1。表明苯甲酸鈉在2.5 μg/mL~25.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖2)。
圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve
表2 精密度試驗結(jié)果Table 2 Precision test results
2.3.1 進(jìn)樣精密度 連續(xù)進(jìn)樣6次,其峰面積的RSD小于2.0%,表明儀器精密度良好,儀器較穩(wěn)定。
2.3.2 中間精密度 分別由甲、乙兩個人在不同時間,使用不同儀器連續(xù)進(jìn)樣分析6次,其峰面積的RSD均小于2.0%,表明中間精密度良好。
試驗結(jié)果表明,當(dāng)S/N為10時,苯甲酸鈉的定量限為0.75 μg/mL;當(dāng)S/N為3時,苯甲酸鈉的檢測限為0.25 μg/mL。
在不同時間段對供試品溶液取樣分析,苯甲酸鈉峰面積的RSD值均小于2.0%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
由表3結(jié)果可知,苯甲酸鈉的平均回收率為95.90%,RSD<2.0%,證明該方法準(zhǔn)確性好。
表3 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)
按照上述含量測定方法,對3批羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液供試品進(jìn)行測定,記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果表明,3批樣品中抑菌劑苯甲酸鈉含量均在標(biāo)示量的90%~110%之間,其結(jié)果見表4。
表4 樣品含量測定結(jié)果Table 4 Results of sample content determination
參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[17],測定苯甲酸鈉所選用的波長分別為220 nm、230 nm。為了進(jìn)一步確定羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液中抑菌劑苯甲酸鈉的最大吸收波長,采用DAD檢測器對苯甲酸鈉溶液進(jìn)行全波長掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)苯甲酸鈉的最大吸收波長為224 nm,所以選用224 nm作為檢測波長。
分別考察了不同體系的流動相對供試品中苯甲酸鈉的分離情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在各峰分離度和峰形上,乙酸銨-甲醇體系明顯優(yōu)于水-甲醇體系、乙酸銨-乙腈體系;同時又考察了流動相中含不同濃度的乙酸銨對柱效的影響,最后選用0.02 mol/L乙酸銨水溶液-甲醇(85∶15)為流動相,結(jié)果各峰之間分離度良好,且峰形對稱,基線平穩(wěn)。
2015版《獸藥典》四部通則1121抑菌效力檢查法,用于指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)在研發(fā)階段制劑中抑菌劑濃度的確定[18]。通過測定混懸液的抑菌活性,來確定混懸液中防腐劑的最低有效劑量是否添加合理,但對于制劑中防腐劑使用的上限卻無限制[19]。同時對于防腐劑苯甲酸鈉的添加量沒有明確規(guī)定,制劑中防腐劑的添加量主要由研發(fā)企業(yè)自主研發(fā)決定,致使不同廠家的同一制劑中苯甲酸鈉含量差別較大,甚至同一廠家的不同批次中苯甲酸鈉含量也有一定差別[9,10,20,21]。在通則0181項下規(guī)定:口服液體制劑的合劑使用苯甲酸鈉時,用量(以苯甲酸計)不得超過0.3%[18]。為了臨床用藥安全,測定及控制制劑中防腐劑苯甲酸鈉的含量具有重要意義。
目前,有關(guān)HPLC法測定制劑中抑菌劑苯甲酸鈉含量的報道較多,但本方法靈敏度高,操作簡捷,準(zhǔn)確性、專屬性強(qiáng),適用于羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液中抑菌劑苯甲酸鈉的含量測定,嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量,進(jìn)一步為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。