加味茵陳蒿口服液的質(zhì)量控制研究

郭振環(huán)，呂一舟，馬 霞，張志強，李向輝，劉永錄，范云鵬

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省康星藥業(yè)股份有限公司，河南鄭州 451464；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100)

《中國獸藥典》2015年版二部收載的茵陳蒿散[1]，源于張仲景的《傷寒論》，由茵陳、梔子、大黃組成。有清熱解毒、利膽、退黃等功效[2-3]，臨床常用于病毒性肝炎、黃疸性肝炎、膽汁淤積等濕熱內(nèi)蘊證[4-6]。加味茵陳蒿口服液是在茵陳蒿散基礎(chǔ)上加味甘草，新方劑以茵陳為君藥，可清除肝膽濕熱；梔子為臣藥，可清泄三焦?jié)駸幔淮簏S為佐藥，可蕩滌腸胃瘀熱；甘草為使藥，益氣補脾，止痛，有調(diào)和諸藥之功效。前3味藥均有苦寒之性，可清除濕熱，而甘草性平，可調(diào)和苦寒之性，解梔子苷毒性[7]，還可調(diào)節(jié)口味，制成口服液便于臨床使用。

目前《中國獸藥典》收載的茵陳蒿散中只有顯微鑒別和梔子、大黃的薄層色譜鑒別[1]，沒有相應(yīng)的含量測定方法。本試驗對加味茵陳蒿口服液進行初步質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究，從口服液的相對密度、pH、薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)定性鑒別、再到高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)定量檢測，以期為口服液的進一步開發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 茵陳、梔子、大黃、甘草均為亳州藥強中藥材有限公司產(chǎn)品；梔子苷(MUST-19102310)、甘草酸單銨鹽對照品(MUST-19073110)，均為成都曼斯特生物科技有限公司產(chǎn)品；大黃素對照品(CDAA-281250)，上海安譜實驗科技股有限公司產(chǎn)品；乙醚、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇、丙酮、甲酸、冰醋酸等為分析純，均為山東雙雙化工有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，均為天津市康科德科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 高效液相色譜儀(agilent technologies 1260)，安捷倫科技中國有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗器(SYU-3-100D)，鄭州生元儀器有限公司產(chǎn)品；萬分之一天平(BSA224S)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；暗箱四用紫外分析儀(ZF-8)，上海勤科分析儀器有限公司產(chǎn)品；雷磁酸度計(PHS-3C)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；循環(huán)水真空泵(SHZ-D)、低溫冷卻液循環(huán)泵(DLSB-5/10)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-5299)，均為鄭州科達(dá)機械儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 加味茵陳蒿口服液及陰性藥液的制備

(1)加味茵陳蒿口服液制備：取茵陳120 g，梔子60 g，大黃45 g，甘草25 g，按照前期試驗中確定的最佳制備工藝進行10批口服液的制備：補足2倍吸水量后加12倍水，浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1 h，2次藥液合并后濃縮至1 mL相當(dāng)于原藥材1g。

(2)陰性藥液制備：按上述工藝分別制備缺梔子、缺大黃、缺甘草的陰性對照藥液。

1.2.2 口服液的一般檢查

(1)相對密度的測定：取潔凈、干燥并精密稱定重量的比重瓶，裝滿測試樣品;裝上溫度計(瓶中應(yīng)無氣泡)，置20℃的水浴中放置10 min～20 min，使瓶內(nèi)被測物的溫度達(dá)到20℃；用濾紙除去溢出側(cè)管的液體，立即蓋上罩;將比重瓶自水浴中取出，用濾紙將比重瓶的外面擦干，精密稱定，減去比重瓶的重量，求得供試品的重量；將供試品傾去，洗凈比重瓶，并裝滿新煮沸過的冷水，照上法測得同一溫度時水的重量，按下式計算，即得。

樣品的相對密度=供測試樣品重量/水重量

(2)pH的測定：采用酸度計檢測每批樣品pH。

1.2.3 薄層色譜法鑒別

(1)梔子的鑒別：精密量取濃縮液3 mL，加乙醚20 mL，超聲20 min，棄乙醚后揮干溶劑，再加入乙酸乙酯30 mL，加熱回流1 h，放冷后取乙酸乙酯層蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，濾過，濾液作為樣品溶液。同法制得梔子對照藥材和缺梔子的陰性對照溶液。取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 含0.3 mg的梔子苷對照品溶液。吸取上述4種溶液各2 μL分別點于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-丙酮-水(5∶5∶0.6)為展開劑展開，取出晾干后噴100 g/L的硫酸乙醇溶液，加熱至105℃使薄層板上有斑點顯色。

(2)大黃的鑒別：精密量取濃縮液3 mL，加甲醇25 mL，加熱回流1 h，放冷濾過后把濾液蒸干。殘渣加水5 mL溶解，再加鹽酸1 mL，水浴加熱30 min立即冷卻。用乙醚提取2次，每次5 mL，合并乙醚液，蒸干。殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。同法制得大黃對照藥材和缺大黃的陰性對照溶液。取大黃素對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 含0.8 mg的大黃素對照品溶液。吸取上述4種溶液各2 μL分別點于同一硅膠GF254板上，正己烷-乙酸乙酯-甲酸(30∶10∶0.5)為展開劑展開，取出晾干后置于365 nm紫外燈下觀察。

(3)甘草酸銨的鑒別：精密量取濃縮液2 mL，加乙醚8 mL，加熱回流1 h，棄乙醚后蒸干溶液，藥渣加甲醇6 mL，加熱回流1 h，濾過后濾液蒸干；殘渣加水8 mL溶解，正丁醇提取3次，每次4 mL，合并正丁醇液；用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解作為供試品溶液。同法制得甘草對照藥材和缺甘草的陰性對照溶液。取甘草酸銨對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 含2.0 mg的甘草酸銨對照品溶液。吸取上述4種溶液各2 μL分別點于同一硅膠GF254板上，正丁醇-冰醋酸-水(6∶1∶3)為展開劑展開，取出晾干后置于254 nm紫外燈下觀察。

1.2.4 含量測定

(1)色譜條件：梔子苷的流動相為乙腈∶1 mL/L磷酸水(15∶85)，檢測波長為238 nm；大黃素流動相為甲醇-1 mL/L磷酸水(85∶15)，檢測波長為254 nm；甘草酸單銨鹽流動相為乙腈-1 mL/L磷酸水(37∶63)，檢測波長為250 nm。色譜柱均為C18柱(4.6×250 mm，5 μm)，流速1 mL/min，柱溫30℃，進樣10 μL。

(2)供試品溶液和陰性對照溶液的制備：

①精密量取濃縮液0.5 mL，用甲醇溶液定容至 10 mL，超聲處理30 min。放冷，搖勻濾過，取濾液，作為測定梔子苷的供試品溶液。

②精密量取濃縮液1 mL，用甲醇溶液定容至 10 mL，加熱回流1 h。放冷，離心后過濾取續(xù)濾液蒸干，加80 mL/L鹽酸溶液5 mL，超聲2 min；在鹽酸溶液中加三氯甲烷5 mL，取三氯甲烷層，提取3次合并三氯甲烷液，蒸干，加甲醇1 mL搖勻濾過，取濾液，作為測定大黃素的供試品溶液。

③精密量取濃縮液0.5 mL，用 700 mL/L乙醇定容至 10 mL，超聲處理30 min。放冷，搖勻，濾過，取濾液，作為測定甘草酸單銨鹽的供試品溶液。

(3)對照品溶液的制備：精密稱定對照品適量，加甲醇制成30 μg/mL的梔子苷對照品溶液；加甲醇制成40 μg/mL的大黃素對照品溶液；加700 mL/L乙醇制成0.2 mg/mL的甘草酸單銨鹽對照品溶液(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207)。

(4)專屬性考察：分別吸取供試品溶液、陰性對照溶液及相應(yīng)的對照品溶液各10 μL，按照上述色譜條件檢測。

(5)線性關(guān)系考察：精密吸取梔子苷對照品6 、10 、14、16、20、22 μL，按照含量測定方法，依次注入液相色譜儀進行測定。分別精密吸取大黃素和甘草酸銨對照品1、2、4、8、10 μL，按照含量測定方法，依次注入液相色譜儀進行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，進樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

(6)精密度試驗：精密吸取各對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算RSD值。

(7)穩(wěn)定性試驗：取同一供試品(批號：20200610)溶液10 μL，分別在0、3、6、9、12、24 h進樣，分別記錄梔子苷、大黃素、甘草酸銨的峰面積，計算RSD值。

(8)加樣回收率：取已知梔子苷/大黃素/甘草酸單銨鹽含量加味茵陳蒿口服液1 mL(批號：20200610)，按照添加對照品的量為供試品有效成分含量的80%、100%、120%分為3組，每組重復(fù)3次。按供試品溶液的制備及樣品測定項下操作，測定其含量，計算平均回收率和RSD值。

(9)含量限度測定：取實驗室小試生產(chǎn)的10批口服液樣品進行含量測定，根據(jù)試驗結(jié)果制定各成分含量限度。

2 結(jié)果與分析

2.1 口服液的一般檢查結(jié)果

2.1.1 相對密度 經(jīng)檢測口服液的相對密度為1.06 g/mL～1.10 g/mL。

2.1.2 pH檢查 經(jīng)檢測口服液pH為4.87～4.90。

2.2 薄層色譜法鑒別結(jié)果

梔子的鑒別結(jié)果如圖1A顯示，供試品色譜中，在與梔子苷對照品、梔子對照藥材色譜相對應(yīng)的位置顯示相同顏色斑點，缺梔子陰性對照無干擾。

大黃的鑒別結(jié)果如圖1B顯示，供試品色譜中，在與大黃素對照品、大黃對照藥材色譜相對應(yīng)的位置顯示黃色熒光斑點，缺大黃陰性對照無干擾。

甘草的鑒別結(jié)果如圖1C顯示，供試品色譜中，在與甘草酸單銨鹽對照品、甘草對照藥材色譜相對應(yīng)的位置顯示相同暗褐色斑點，缺甘草陰性對照無干擾。

2.3 含量測定結(jié)果

2.3.1 專屬性考察結(jié)果 專屬性考察結(jié)果顯示加味茵陳蒿口服液色譜峰中梔子苷與雜質(zhì)分離度較好；有蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚這五種蒽醌類成分，并且陰性對照中在蘆薈大黃素和大黃酸位置上有相同成分出現(xiàn)，這兩種成分專屬性不好，而大黃素分離度較好，故選取專屬性好，且含量多的大黃素作為后續(xù)樣品測定依據(jù)；色譜峰中甘草酸單銨鹽與雜質(zhì)分離完全，分離度大于1.5。陰性樣品均無干擾，表明梔子苷、大黃素、甘草酸單銨鹽的專屬性好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 梔子苷進樣量在0.18～0.66 μg內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999)，其回歸方程為γ=2938.8χ+283.45。大黃素進樣量在0.04～0.40 μg內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9998)，其回歸方程為γ=2420.6χ-7.965。甘草酸單銨鹽進樣量在0.20～2.00 μg內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999)，其回歸方程為γ=483.11χ-1.1483。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取各對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，梔子苷對照品峰面積RSD為0.34%；大黃素峰面積RSD為0.29%；甘草酸單銨鹽峰面積RSD為0.38%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品(批號：20200610)溶液10 μL，分別在0、3、6、9、12、24 h進樣，梔子苷峰面積RSD為0.48%；大黃素峰面積RSD為0.75%；甘草酸單銨鹽峰面積RSD為0.95%。結(jié)果表明口服液中在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率 梔子苷、大黃素、甘草酸單銨鹽平均回收率和RSD值，見表1、2、3。梔子苷平均回收率為95.03%～96.93%，RSD范圍在0.25%～0.67%；大黃素平均回收率為95.03%～96.93%，RSD范圍在1.39%～2.06%；甘草酸單銨鹽平均回收率在95.03%～96.93%，RSD范圍在0.33%～0.66%。結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度高。

表1 口服液中梔子苷加樣回收率試驗結(jié)果Table 1 Experimental results of the recovery rate of geniposide in oral liquid

2.3.6 含量限度測定 測得梔子苷含量范圍為1.343 mg/mL～1.380 mg/mL，梔子苷含量平均值為1.361 mg/mL，最低限度為1.09 mg/mL；大黃素含量范圍為8.625 μg/mL～9.298 μg/mL，大黃素含量平均值為8.903 μg/mL，最低限度為7.12 μg/mL；甘草酸單銨鹽含量范圍為0.875 mg/mL～0.960 mg/mL，甘草酸單銨鹽含量平均值為0.929 mg/mL，最低限度為0.73 mg/mL。

3 討論

楊海玲等[8]研究表明，梔子茵陳中均含有綠原酸，不具備專屬性，因此在定性鑒別和定量檢測中沒有進行綠原酸的檢測。

首先參照了《中國獸藥典》2015年版第二部中梔子藥材的薄層色譜方法，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)作為展開劑，再噴以100 mL/L硫酸乙醇溶液105℃加熱顯色，結(jié)果加味茵陳蒿湯樣品溶液中斑點清楚，但陰性對照有干擾。然后參照趙穎等[9]在清火抗毒丸中梔子薄層色譜法樣品處理方法，并考察了以下展開劑：乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)(Ⅰ)[10]，三氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水(10∶4∶1∶1)(Ⅱ)，乙酸乙酯-丙酮-水(5∶5∶0.6)(Ⅲ)，三氯甲烷-甲醇(3∶1)(Ⅳ)[11]。使用展開劑(Ⅰ)和(Ⅱ)，斑點清晰，但陰性有干擾。使用展開劑(Ⅳ)樣品分離不開，且有拖尾。使用展開劑(Ⅲ)后，樣品斑點較圓且清晰，陰性對照無干擾。所以選擇乙酸乙酯-丙酮-水(5∶5∶0.6)為加味茵陳蒿口服液中梔子苷展開劑。

表2 口服液中大黃素加樣回收率試驗Table 2 Experimental results of the recovery rate of emodin in oral liquid

表3 口服液中甘草酸單銨鹽加樣回收率試驗結(jié)果Table 3 Experimental results of the recovery rate of Mono-ammonium glycyrrhizinate in oral liquid

大黃素的薄層鑒別，考察了以下展開劑：石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液(Ⅰ)和正己烷-乙酸乙酯-甲酸(30∶10∶0.5)(Ⅱ)[12]。使用展開劑(Ⅰ)，拖尾嚴(yán)重，斑點不清晰。使用展開劑(Ⅱ)，斑點圓且顯色清晰，分離度較好，陰性對照無干擾。所以選擇正己烷-乙酸乙酯-甲酸(30∶10∶0.5)為加味茵陳蒿口服液中大黃素的展開劑。

甘草酸單銨鹽的薄層鑒別，考察了以下展開劑：乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)(Ⅰ)，氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)下層溶液(Ⅱ)[13]，正丁醇-冰醋酸-水(6∶1∶3)(Ⅲ)[14]。使用展開劑(Ⅰ)，斑點不清晰且陰性有干擾。使用展開劑(Ⅱ)，層析不上去。使用展開劑(Ⅲ)，效果較好，所以選擇正丁醇-冰醋酸-水(6∶1∶3)為加味茵陳蒿口服液中甘草酸單銨鹽的展開劑。

梔子苷的含量測定，考察了以下流動相：乙腈-水(15∶85)(Ⅰ)和乙腈-1 mL/L磷酸水(15∶85)(Ⅱ)。使用流動相(Ⅰ)，分離度不好，供試品圖中有雜峰干擾。使用流動相(Ⅱ)，分離度好，陰性對照無干擾。所以選擇乙腈-1 mL/L磷酸水(15∶85)為加味茵陳蒿口服液中梔子苷的流動相。

甘草酸單銨鹽的含量測定，參照了《中國獸藥典》2015年版第二部中甘草藥材的含量測定方法進行供試品溶液處理，考察了以下色譜條件，流動相均為乙腈(A)-1 mL/L磷酸水(B)梯度洗脫(0～8 min，19% A；8～35 min，50% A；35～36 min，100% A；36～40 min，19% A)；波長237 nm(Ⅰ)[1]；梯度洗脫(0～10 min，20% A；10～60 min，45% A)；波長265 nm(Ⅱ)[15]；乙腈-1 mL/L磷酸水(37∶63)，波長250 nm。使用色譜條件(Ⅰ)，甘草酸單銨鹽對照品不出峰。使用流動相(Ⅱ)，基線不穩(wěn)，雜峰多。使用流動相(Ⅱ)，分離度高，陰性對照無干擾。所以選擇乙腈-1 mL/L磷酸水(37∶63)，檢測波長為250 nm作為加味茵陳蒿口服液中甘草酸單銨鹽的色譜條件。

結(jié)果表明，上述試驗方法有效且可靠，可作為加味茵陳蒿口服液的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。