EMT轉(zhuǎn)錄因子及其調(diào)控機制的研究進展

熊婷，傅蓉

（中國藥科大學(xué)，江蘇南京 211198）

靜止的上皮細胞向運動的間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變被稱為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）。其主要由一組核心EMT轉(zhuǎn)錄因子（EMT-TFs）介導(dǎo)，其中包括Snail超家族、E盒結(jié)合鋅指蛋白（Zeb）家族和Twist家族，這些轉(zhuǎn)錄因子激活了經(jīng)典的EMT程序，導(dǎo)致細胞黏附分離、上皮細胞極性喪失和間充質(zhì)、運動表型的表現(xiàn)，其正常的執(zhí)行對于胚胎發(fā)育、干細胞分化和傷口愈合等過程是不可或缺的[1]。然而，在癌癥進展中，EMT被異常激活，EMT-TFs和下游調(diào)控的基因影響了癌癥進展中的大量階段：腫瘤起始、前體病變的建立、基因改變的積累、逃避腫瘤監(jiān)測以及治療抵抗到轉(zhuǎn)移的發(fā)展[1-2]。因此，了解EMT復(fù)雜的分子機制，明確信號通路與其轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后調(diào)控之間的聯(lián)系，可為理解腫瘤發(fā)展的進程，開發(fā)靶向藥物提供新的途徑。

1 EMT轉(zhuǎn)錄因子家族

1.1 Snail超家族

Snail轉(zhuǎn)錄因子超家族成員包括Snail（Snail1）、Slug（Snail2）和Smuc（Snail3），共同特點是都擁有C端的4或5個C2H2鋅指，可以與靶基因中的E-box基序（5′-CANNTG-3′） 結(jié)合，以及N 端的轉(zhuǎn)錄阻遏基序SNAG結(jié)構(gòu)域[3]。Snail超家族在與細胞存活和分化相關(guān)的多個過程中起著至關(guān)重要的作用。

Snail1最早在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)，對中胚層的形成至關(guān)重要。作為導(dǎo)致EMT的多個信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Snail1可以通過直接抑制E-鈣粘蛋白（E-cadherin）表達將正常的上皮細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞[4]。在多種癌癥中，Snail1過表達通常與E-cadherin表達呈負相關(guān)，與腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移增強呈正相關(guān)，同時預(yù)示著更差的預(yù)后[5]。此外，Snail1介導(dǎo)EMT通過誘導(dǎo)免疫抑制來加速轉(zhuǎn)移，在小鼠模型中敲除Snail1，可以增強腫瘤浸潤淋巴細胞和全身免疫反應(yīng)，顯著抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[6-7]。因此，Snail1是預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的有效靶點。

Slug是Snail轉(zhuǎn)錄因子家族的另一個成員，是發(fā)育過程中EMT、中胚層形成和神經(jīng)嵴細胞遷移所必需的。與Snail1類似，Slug也被表征為強E-cadherin抑制因子和主要EMT誘導(dǎo)因子，與癌癥干細胞形成、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞凋亡以及侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。此外，Slug是Twist誘導(dǎo)的EMT和轉(zhuǎn)移的重要介質(zhì)。Twist需要誘導(dǎo)Slug抑制EMT的上皮分支，然后和Slug共同作用以促進EMT和轉(zhuǎn)移[9]。

Smuc是Snail家族中最近被鑒定的成員，在成人骨骼肌和胸腺中高度表達并參與細胞分化[10]。與Snail1和Slug相比，Smuc具有不同的功能特征。此外，Smuc EMT誘導(dǎo)能力相對于Snail1和Slug較差[11]。

1.2 Zeb家族

Zeb家族由Zeb1和Zeb2組成。Zeb1和Zeb2都具有N端和C端鋅指，能夠與其靶啟動子中的調(diào)節(jié)DNA序列結(jié)合，這導(dǎo)致Zeb家族可以參與不同的生物事件，例如胚胎發(fā)生、造血以及EMT。

Zeb1在中胚層組織中表達，參與了胚胎發(fā)生和發(fā)育。在結(jié)直腸癌（CRC）細胞中，Zeb-1對E-cadherin的抑制，導(dǎo)致癌細胞的增殖和惡性程度增強[12]。Zeb1表達增強介導(dǎo)的EMT也會增加癌細胞的干性和遷移，從而促進化療耐藥。在胰腺癌中，含有蛋白激酶2（ROCK2）的Rho相關(guān)卷曲螺旋可增強Zeb1的表達，導(dǎo)致Zeb1介導(dǎo)的EMT增加胰腺癌細胞對化療藥物吉西他濱的耐藥性[13]。在前列腺癌細胞中，Zeb1刺激ATP結(jié)合盒亞家族C成員10（MRP4）的上調(diào)，以將多西紫杉醇從癌細胞中輸出，從而導(dǎo)致癌細胞對化療的敏感性降低[14]。總之，Zeb1是增強腫瘤細胞侵襲和增殖的重要介質(zhì)，并介導(dǎo)降低化療效率。有研究指出Zeb1導(dǎo)致乳腺癌細胞具有放射抗性，阻斷Zeb1可能會使腫瘤細胞對放療或化療敏感，從而解決耐藥性問題[15]。

Zeb2是Zeb家族的另一成員，與Zeb1類似，其在腫瘤細胞遷移和侵襲中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在非小細胞肺癌（NSCLC）中，MDM2結(jié)合蛋白（MTBP）通過上調(diào)Zeb2介導(dǎo)EMT，增強NSCLC腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[16]。此外，Zeb2介導(dǎo)EMT激活磷脂酰醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶b（Akt）通路，誘導(dǎo)NSCLC細胞產(chǎn)生順鉑耐藥性[17]。在目前已知的情況下，Zeb2對于EMT的介導(dǎo)作用，使其可以作為癌癥治療的潛在靶點。

1.3 Twist家族

Twist家族主要包括Twist1和Twist2，對于原腸胚和中胚層的形成至關(guān)重要。在哺乳動物中，Twist1和Twist2具有高度的結(jié)構(gòu)同源性，但它們在發(fā)育過程中具有不同的功能[18]。Twist1參與了發(fā)育過程中神經(jīng)管閉合[19]，而Twist2則是在圍產(chǎn)期抑制促炎細胞因子表達，維持發(fā)育穩(wěn)態(tài)[18]。而在EMT中，Twist1和Twist2的作用較為相似，Twist1/2與E-cadherin啟動子的保守E-box序列結(jié)合并募集共抑制因子如HDAC2來抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄[20]。同時，Twist1/2的過表達誘導(dǎo)間充質(zhì)標志物如纖連蛋白和N-鈣粘蛋白的表達[21]。

Twist1在多種侵襲性癌癥細胞中過表達是誘導(dǎo)波形蛋白（Vimentin）表達的關(guān)鍵因子。Vimentin是一種重要的EMT間充質(zhì)細胞標志物，可以驅(qū)動細胞可塑性，并與不良預(yù)后和高轉(zhuǎn)移率相關(guān)[22]。

Twist2在乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中的異位表達促進了干細胞標志物的表達，并增強了干細胞樣細胞的自我更新。此外，Twist2導(dǎo)致STAT3的組成型激活，其存在于超過50%的原發(fā)性乳腺腫瘤和腫瘤衍生細胞系中[23]。

2 EMT轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控

2.1 Snail超家族

TGF-β通路中受體活化型Smads（R-Smads）復(fù)合物能夠直接與Snail1的啟動子結(jié)合以誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄，并且可以與Snail1形成復(fù)合物以抑制編碼E-cadherin和occludin的基因的表達[24-25]。除了通過Smads和其他激酶向細胞核傳遞信號外，TGF-β受體受到TGF-β刺激信號后，細胞質(zhì)膜近端的Par6蛋白會被TGF-βRII磷酸化，并導(dǎo)致E3連接酶Smurf1的招募，在識別Smad蛋白降解的同時，Smurf1識別RhoA GTPase降解，導(dǎo)致RhoA的活性缺失，誘導(dǎo)Snail1表達，而肌動蛋白絲組織的改變和緊密連接的丟失也會促進EMT[26]。此外，在許多癌癥中，Wnt信號通路直接誘導(dǎo)Snail1和Slug的表達[27]。腫瘤微環(huán)境內(nèi)的I型膠原也可以通過激活NF-κB通路，釋放p65亞基入核促進Snail1的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)EMT[28]。在鱗狀細胞癌細胞中，Akt通過激活NF-κB誘導(dǎo)Snail1的轉(zhuǎn)錄進而介導(dǎo)EMT[29]。

2.2 Zeb家族

乳腺上皮細胞中，胰島素樣生長因子1（IGF-1）的過表達會激活ERK增加Zeb1的轉(zhuǎn)錄[30]。與之類似的，乳腺癌細胞中NF-κB可以增加Zeb1和Zeb2的啟動子活性，誘導(dǎo)上皮細胞向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變[31]。

2.3 Twist家族

TGF-β和腫瘤抑制基因p12可以影響編碼Twist基因的表達，該基因通過抑制E-cadherin促進EMT[32]。此外，表皮生長因子（EGF）還誘導(dǎo)Snail1和Twist的表達，從而抑制表達E-cadherin的CDH1啟動子活性[33]。Wnt也與乳腺上皮細胞中Twist表達的增加有關(guān)[34]。

3 EMT轉(zhuǎn)錄因子在翻譯后水平上的調(diào)控

3.1 Snail家族的翻譯后修飾

3.1.1 Snail1的翻譯后修飾

Snail1受到泛素-蛋白酶體途徑嚴格調(diào)控，在細胞質(zhì)中會被迅速降解，半衰期僅約25 min[35]。而Snail1在不同位點的磷酸化則會影響其細胞亞定位，從而影響其后續(xù)降解過程。當(dāng)Snail1在細胞核被翻譯合成后，糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）磷酸化Snail1導(dǎo)致其由細胞核易位至細胞質(zhì)，由酪蛋白激酶1磷酸化Snail1 Ser104和Ser107位點，隨后GSK-3β磷酸化其Ser96和Ser100位點[35]，最終E3連接酶β-TrCP與Snail1的磷酸化位點結(jié)合，通過泛素-蛋白酶體途徑降解Snail1。在此途徑中，多種修飾形式起到協(xié)同或拮抗作用。例如，Lats2蛋白可磷酸化Snail1 Thr203位點，使Snail1保留在細胞核中以提高其穩(wěn)定性，從而以Snail1依賴性方式增強細胞EMT和腫瘤細胞侵襲[36]。磷酸酶SCP4可去磷酸化GSK-3β所磷酸化的Snail1位點，從而抑制Snail1后續(xù)的泛素化降解。與之類似，ATM蛋白磷酸化Snail1 Ser100位點，磷酸化的Snail1與HSP90結(jié)合而被穩(wěn)定，介導(dǎo)EMT誘導(dǎo)乳腺腫瘤的轉(zhuǎn)移[37]。而PKD1磷酸化Snail1 Ser11則會導(dǎo)致Snail1從細胞核易位至細胞質(zhì)，促進其與E3連接酶亞基FBXO11結(jié)合并通過泛素化降解[38]。除了磷酸化修飾外，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CBP還可以乙?；疭nail1 Lys126和Lys187位點，從而增強Snail1誘導(dǎo)靶基因激活，觸發(fā)間充質(zhì)相關(guān)基因的常染色質(zhì)改變，從而誘導(dǎo)EMT[39]。Snail1的糖基化修飾則通過核易位抑制Snail降解并促進EMT[40]。

3.1.2 Slug的翻譯后修飾

Slug蛋白的半衰期約0.5 h，與Snail1類似，GSK3β可以磷酸化Slug Ser92、Ser96、Ser100和Ser104位點，影響Slug的細胞亞定位，最終通過泛素-蛋白酶體途徑降解Slug[41]。然而，GSK-3β失活與癌癥中的Slug過量并沒有強烈相關(guān)性，表明與Snail1不同，Slug經(jīng)歷獨立于GSK-3β介導(dǎo)的磷酸化的蛋白酶體降解[42-43]。后續(xù)研究表明，Slug的乙?；强刂破湓谀[瘤中豐度的決定性因素[44]。去乙酰化酶sirtuin2去乙?；疭lug Lys116位點可以穩(wěn)定Slug，而乙?；窩BP乙?；疭lug Lys166和Lys211位點也具有相似的影響，均會促進EMT，表明Slug轉(zhuǎn)錄因子翻譯后修飾的復(fù)雜性[17]。此外，在前列腺癌小鼠模型中，Slug Lys192位點的Sumo化可以穩(wěn)定Slug，抑制其降解，進而介導(dǎo)EMT促進腫瘤的進展[45]。

3.2 Zeb家族的翻譯后修飾

與Snail超家族不同，目前對于Zeb家族翻譯后修飾的研究主要聚焦于影響轉(zhuǎn)錄活性而非降解。蛋白激酶C（PKC）的活化可磷酸化Zeb1 Thr851、Ser852和Ser853位點，阻礙Zeb1的靶基因結(jié)合位點，降低Zeb1轉(zhuǎn)錄活性。類似的，磷酸化Zeb1 Thr867位點會影響Zeb1的核易位，阻止Zeb1在核內(nèi)積累，從而降低其轉(zhuǎn)錄活性[46]。

Zeb2存在sumo化修飾，sumo化修飾不影響Zeb1的亞細胞定位，但調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性。與野生型相比，Zeb2 sumo缺失的突變體對E-cadherin 轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)出更強的抑制作用，表明sumo化修飾減弱了Zeb2的轉(zhuǎn)錄抑制活性[47]。

3.3 Twist家族的翻譯后修飾

翻譯后修飾是調(diào)節(jié)Twist誘導(dǎo)EMT能力的關(guān)鍵機制之一，幾種泛素E3連接酶已經(jīng)被證明可促進Twist1的蛋白酶體降解。例如，腫瘤抑制因子PAQR3通過促進Twist1與其E3連接酶BTRC之間的復(fù)合物形成來增加蛋白酶體介導(dǎo)的Twist1降解，從而抑制EMT[48]。而IKKβ介導(dǎo)的Twist1磷酸化也通過增加BTRC與Twist1的結(jié)合親和力促進其降解[49]。此外，MAPK介導(dǎo)的Twist1 Ser68位點磷酸化增強了其穩(wěn)定性，驅(qū)動癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[41]，而SCP1介導(dǎo)的該位點去磷酸化則加速了Twist1的降解[50]。Pirh2、FBXL14等E3連接酶也被證明介導(dǎo)Twist1降解抑制EMT[51]。然而，迄今為止，高度相關(guān)的Twist2翻譯后修飾的功能和機制尚未明確。

4 結(jié)語

EMT的發(fā)生是腫瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵起始，也是腫瘤獲得耐藥性的關(guān)鍵因素。研究EMT及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的作用機制，有助于理解腫瘤的傳播方式以及癌癥如何發(fā)展成具有耐藥性而無法治愈的疾病，從而改善抗癌療法。此外，結(jié)合靶向EMT的轉(zhuǎn)錄因子及其上游調(diào)控方式進行藥物開發(fā)，可以為控制腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的思路和方向。