CRISPR/Cas9基因編輯工具開發(fā)與應(yīng)用研究進展

龐紫燕，官陽陽，孫嘉磊，王琰

（武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 細胞穩(wěn)態(tài)湖北省重點實驗室，湖北武漢 430072）

規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）及其相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein，Cas）是原核生物抵御病毒感染或噬菌體入侵產(chǎn)生的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其主要通過適應(yīng)、表達、干擾3個基本階段來保護細菌免受病毒反復(fù)攻擊[1]。自被發(fā)現(xiàn)以來，研究人員不斷對CRISPR/Cas系統(tǒng)進行優(yōu)化升級，使其成為了分子生物學(xué)領(lǐng)域重要的基因編輯工具之一，其主要通過特異位點識別、靶標(biāo)基因切割和修復(fù)3個步驟實現(xiàn)基因編輯[2]。

由于Ⅱ型CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)組成相對簡單，操作簡便，編輯效率高，在基因編輯中得到了廣泛的研究和應(yīng)用[1]。近年來，研究人員不斷發(fā)掘出更多種類的Cas9蛋白，并對其進行優(yōu)化改造，以擴大識別基因組的范圍，實現(xiàn)精準(zhǔn)高效的基因編輯[2]。此外，一系列基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯工具也被不斷開發(fā)出來，如能對單個堿基進行轉(zhuǎn)變的堿基編輯器（Base Editors，BEs）；在不造成基因組斷裂的情況下實現(xiàn)特定靶點堿基替換、片段插入或刪除的Prime編輯器（Prime Editors，PEs）等，適用于體內(nèi)、體外各種基因編輯活動，并可用于疾病的治療，具有巨大的應(yīng)用潛力[3-5]。本文將對CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成、結(jié)構(gòu)、基因編輯機制和不同Cas9蛋白及變體進行概述，并著重介紹基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)的基因編輯工具和相關(guān)應(yīng)用。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯機制

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由引導(dǎo)RNA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白組成。Cas9蛋白本質(zhì)上是一種多域DNA核酸內(nèi)切酶，負責(zé)切割目的基因形成雙鏈斷裂，也被稱為遺傳剪刀[6]。在使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因編輯時，研究人員把crRNA和反式激活crRNA（transactivating crRNA，tracrRNA）組合起來設(shè)計成單個引導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA），用來引導(dǎo)Cas9蛋白對目的基因進行切割[6]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要通過識別、切割和修復(fù)3個步驟進行基因編輯[2]。sgRNA通過其5’-crRNA與目標(biāo)基因堿基互補配對來識別靶序列，引導(dǎo)Cas9核酸酶定位到靶序列。如圖1所示，在RNA-DNA雜交體形成后，Cas9蛋白在PAM序列上游的3 bp處對DNA進行切割，產(chǎn)生一個平末端雙鏈斷裂（Double Strand Break，DSB）[7]，隨后目標(biāo)基因通過非同源末端連接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）途徑或同源定向修復(fù)（Homology-Directed Repair，HDR）途徑進行修復(fù)。在沒有修復(fù)模板的情況下，雙鏈斷裂通過NHEJ途徑重新連接，它是細胞內(nèi)的主要修復(fù)機制，在各個細胞周期都很活躍，但可能導(dǎo)致連接位點的隨機插入缺失突變，導(dǎo)致移碼突變或無義突變，可用于基因敲除[8]。HDR通常僅在分裂細胞中活躍，發(fā)生頻率較低，但可以利用外源修復(fù)性模板在目標(biāo)基因上進行精確的插入或替換[9]。

圖1 CRISPR/Cas9基因編輯原理示意圖

化膿性鏈球菌Cas9（Streptococcus pyogenesCas9，SpCas9）是第一個用于基因編輯的Cas9蛋白，研究人員對其進行突變改造，以提高靶向特異性、降低脫靶效應(yīng)、識別不同PAM序列，生成了一系列新的變體，如SuperFi-Cas9、xCas9等[6]。此外，研究人員還設(shè)計了具有特殊功能Cas9蛋白變體[10]，如核酸酶活性喪失的Cas9（nuclease dead Cas9，dCas9）可以與其他分子融合，使其在特定位點發(fā)揮作用；只能對目的基因進行單鏈切割的切口酶Cas9（Cas9 nikase，nCas9）在基因編輯過程中可激活細胞內(nèi)高保真的HDR途徑進行修復(fù)，所以常用于高精準(zhǔn)的基因編輯[11]。如北京大學(xué)胡家志課題組將SpCas9與核酸外切酶TREX2融合生成核酸內(nèi)外切酶Cas9TX變體，其幾乎可以消除染色體易位和大片段缺失的發(fā)生，大大提高了基因編輯的安全性[12]。

2 基于CRISPR/Cas9的基因編輯工具開發(fā)

2.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可以和dCas9融合形成復(fù)合物，在gRNA引導(dǎo)下，靶向目的基因的啟動子或增強子序列，以沉默（CRISPRi）或激活（CRISPRa）特定目標(biāo)基因的表達，從而進行體內(nèi)或體外的篩選研究[13]。CRISPRa系統(tǒng)通過轉(zhuǎn)錄激活因子（如VP16、VPR和p300等）來促進轉(zhuǎn)錄翻譯[14]。相反，CRISPRi系統(tǒng)多與 Krüppel相關(guān)盒（Krüppel-Associated Box，KRAB）融合使用，誘導(dǎo)組蛋白甲基化和去乙?；?，從而抑制RNA聚合酶與增強子或啟動子區(qū)域的結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄失活[15]。近期某研究小組使用CRISPRi篩選發(fā)現(xiàn)含溴結(jié)構(gòu)域蛋白2（Bromodomain-Containing Protein 2，BRD2）是SARS-CoV-2感染宿主的重要調(diào)節(jié)因子，為治療COVID-19的感染提供了又一重要靶點[16]。此外，將熒光蛋白等標(biāo)記蛋白與dCas9酶融合，可以實現(xiàn)染色質(zhì)活細胞成像和亞細胞定位[17]。

2.2 轉(zhuǎn)座與重組

CRISPR/Cas9系統(tǒng)也可實現(xiàn)較長DNA片段的靶向插入。由轉(zhuǎn)座酶與dCas9融合開發(fā)的Cas-轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可以將外源DNA片段插入到特定位點，如marer家族轉(zhuǎn)座酶Himar 1與dCas9重組后，可以在大腸桿菌和哺乳動物細胞中將所需片段特異地插入到目標(biāo)TA基序中[18]。如斯坦福大學(xué)叢樂教授課題組根據(jù)噬菌體能夠精確的向宿主細胞重組的現(xiàn)象推斷出微生物重組的關(guān)鍵酶——單鏈退火蛋白（the Single-Strand Annealing Protein，SSAP）可用于哺乳動物細胞中的無切割基因編輯，將其與dSpCas9系統(tǒng)相結(jié)合，開發(fā)出新型dCas9-SSAP基因編輯工具。如圖2所示，該工具由SSAP與MS2噬菌體外殼蛋白（MS2 Coat Protein，MCP）形成的二元復(fù)合物，dCas9蛋白以及含有MS2莖環(huán)序列的gRNA三部分組成，MS2序列可以招募多個SSAP-MCP復(fù)合物，從而允許多個SSAP與dCas9-gRNA形成復(fù)合物，隨后SSAP附著到供體DNA上，在無任何DNA斷裂的情況下進行DNA重組交換，最終實現(xiàn)長達1 kb左右的長序列精準(zhǔn)編輯。而選用較小的dSaCas9，并對SSAP蛋白進行截斷突變，開發(fā)出了更易遞送的dSaCas9-mSSAP系統(tǒng)，可以最大限度地減少體內(nèi)基因編輯治療疾病中的意外突變[19]。

圖2 dCas9-SSAP的示意圖模型

2.3 堿基編輯

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)的BEs無需供體DNA模板即可實現(xiàn)單個堿基的替換，并且在編輯過程中不產(chǎn)生DSB，大大降低了indels的發(fā)生，可用于單基因突變疾病的治療[4]。目前已經(jīng)開發(fā)了胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine Base Editors，CBEs）、腺嘌呤堿基編輯器（Adenine Base Editors，ABEs）和糖基化酶堿基編輯器（Glycosylase Base Editors，GBE）3種工具，如圖3所示[3]。

圖3 基于CRISPR/Cas9的基因編輯工具示意圖

CBEs由dCas9或nCas9與大鼠來源的胞嘧啶脫氨酶——載脂蛋白B mRNA編輯酶催化亞基1（Apolipoprotein B mRNA Editing Enzyme Catalytic Subunit 1，APOBEC1）以及尿嘧啶糖基化酶抑制子（Uracil DNA Glycosylase Inhibitor，UGI）融合組成。如圖3A所示，在dCas9或nCas9結(jié)合特定序列后，胞嘧啶脫氨酶首先將C脫氨基生成U，接著在DNA復(fù)制過程中再變?yōu)門，最后將原來反義鏈中的G轉(zhuǎn)變?yōu)锳，最終實現(xiàn)由C-G到T-A的精準(zhǔn)堿基替換。其中，UGI主要防止DNA復(fù)制過程中U的切除，增加堿基替換效率[20]。自初代CBE問世以來，研究人員已經(jīng)通過更換不同Cas蛋白、使用不同來源的脫氨酶、對脫氨酶進行突變改造、優(yōu)化兩者之間的連接子以及增加UGI數(shù)量等方式開發(fā)出了不同的版本的CBE，以增加編輯效率，拓寬脫氨酶催化活性窗口，減少脫靶效應(yīng)和旁觀效應(yīng)，如SECURE（R33A/K34A）、A3A（Y130F）-BE3 以及 FERNY-BE4max[21-23]。

ABEs由nCas9與腺嘌呤脫氨酶融合構(gòu)成，如圖3B所示，在sgRNA的引導(dǎo)下，融合蛋白上的腺嘌呤脫氨酶可將靶DNA上的A脫氨基變成I，而在DNA復(fù)制過程中I通常被當(dāng)做G，最后完成A-T堿基對到G-C堿基對的準(zhǔn)確替換。由于目前沒有發(fā)現(xiàn)直接作用于DNA的腺嘌呤脫氨酶，ABEs的開發(fā)難度更大。初代ABE1.2的腺嘌呤脫氨酶TadA*是在大腸桿菌的tRNA腺苷酸脫氨酶（ecTadA）上進行突變改造而來的，經(jīng)過7輪升級改造開發(fā)出了ABE7.10，其由野生型TadA和TadA*的異二聚體與nCas9融合組成（TadA-TadA*-nCas9），堿基編輯效率和特異性大大提高[24]。此外，研究人員嘗試使用能識別不同PAM序列的Cas9蛋白及變體以擴大ABEs在人類基因組中的編輯位點，如NG-ABE、xCas9-ABE與ScCas9-ABE，但由于ABE與這些變體Cas9的兼容性有限，其編輯效率明顯降低[25-26]。近期開發(fā)的新版本ABE8e與ABE8s使用具有更大脫氧腺苷脫氨活性的TadA變體，與其他Cas9的兼容性較好，目前已經(jīng)衍生出了多個版本的ABE8e，與ABE7.10相比，堿基編輯效率進一步提高，且具有更廣泛的活性窗口[27-28]。然而，ABE8e的脫靶效應(yīng)隨著脫氧腺苷酶活性的提高而增加，因此研究人員在TadA上引入V106W點突變來改善脫靶編輯[28]。

最近，研究人員還開發(fā)出了3種基于CBEs和ABEs的雙堿基編輯器——SPACE、A&C-BEmax和Target-ACEmax，它們可以在同一等位基因中同時誘導(dǎo)C-T和A-G的堿基轉(zhuǎn)變，且都由胞嘧啶脫氨酶、腺嘌呤脫氨酶、nCas9與UGI 4部分組成，可以實現(xiàn)較為復(fù)雜的基因編輯[29-31]。

GBE由nCas9、胞嘧啶脫氨酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶（Uracil-DNA Glycosylase，Ung）組成，原理類似于CBEs，即先通過胞嘧啶脫氨酶將C轉(zhuǎn)變?yōu)閁，隨后Ung再將U堿基切除，形成無嘌呤/無嘧啶位點，進而激活DNA損傷修復(fù)機制，完成堿基轉(zhuǎn)變[32-33]。研究發(fā)現(xiàn)，使用活化誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶（Activation-Induced cytidine Deaminase，AID）構(gòu)建的AID-nCas9-Ung系統(tǒng)可在大腸桿菌中將C顛換為A，通過改造構(gòu)建出可以在哺乳動物細胞中實現(xiàn)C到G堿基顛換的APOBEC-nCas9-Ung系統(tǒng)[32]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)使用rAPOBEC1（R33A）突變體構(gòu)建的CGBE1系統(tǒng)也可實現(xiàn)C-G堿基顛換，并且可以降低脫靶效應(yīng)；去除Ung的miniCGBE1系統(tǒng)仍保留C-G堿基顛換活性，并且能有效降低indel的風(fēng)險[33]。

2.4 Prime編輯器

總的來說，堿基編輯器替換堿基的種類有限，為了克服這一缺點，劉如謙教授團隊開發(fā)出了PEs，其同樣在不產(chǎn)生DSB的情況下能實現(xiàn)短片段的插入刪除和所有可能的堿基轉(zhuǎn)變，大大擴展了基因組編輯范圍。如圖3C所示，PEs由工程逆轉(zhuǎn)錄酶、nCas9和pegRNA（prime editing guide RNA）3部分構(gòu)成，其中pegRNA是在sgRNA的3′末端增加一段與靶DNA鏈3’末端互補的引物結(jié)合位點（Primer Binding Site，PBS）以及一段攜帶有目標(biāo)突變的序列，既可起始逆轉(zhuǎn)錄過程，又能作為逆轉(zhuǎn)錄的模板。PEs編輯原理為在pegRNA的引導(dǎo)下，nCas9定位到靶DNA鏈以形成一個切口，切口的3’端與引物結(jié)合位點互補使逆轉(zhuǎn)錄酶將模板信息復(fù)制到DNA鏈上，隨后細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶（如FEN1）或5’核酸外切酶（如EXO1）去除切口處剩下的5’尾巴，DNA連接酶將3’尾巴整合到DNA雙鏈上，最后細胞內(nèi)DNA修復(fù)機制啟動，最終實現(xiàn)精準(zhǔn)且穩(wěn)定的基因編輯[34-35]。

PE1由nCas9與野生型莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（Moloney Murine Leukaemia Virus Reverse Transcriptase，M-MLV RT）融合而成，編輯能力較低，通過5個突變（D200N/L603W/T330P/T306K/W313F）改造開發(fā)出了編輯效率更高的PE2。PE3則是在PE2的基礎(chǔ)上引入了靶向非編輯鏈的sgRNA，使nCas9同時在非編輯鏈上產(chǎn)生切口，加快觸發(fā)DNA修復(fù)機制，從而進一步提高編輯效率。為了降低基因編輯中indels發(fā)生的概率，研究人員將PE3中靶向非編輯鏈的sgRNA替換為靶向經(jīng)pegRNA引導(dǎo)編輯后產(chǎn)生的新DNA鏈的sgRNA，進而開發(fā)出了PE3b[35]。

由于pegRNA的3’暴露在細胞中，容易被核酸外切酶降解，劉如謙教授團隊使用一個連接接頭將結(jié)構(gòu)化的RNA基序（evopreQ1或mpknot）連接到pegRNA的3’末端，以增強其穩(wěn)定性，編輯效率可提高1.5～2.0倍[36]。此外，DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)相關(guān)基因強烈地抑制PEs的編輯效率，并促進indels的發(fā)生，通過瞬時表達顯性陰性突變型的錯配修復(fù)蛋白MLH1（MLH1dn）開發(fā)的PE4（PE2+MLH1dn）和PE5（PE3+MLH1dn）兩個編輯系統(tǒng)，基因編輯效率顯著提高，且降低了indels的出現(xiàn)。而通過改變RT密碼子使用、SpCas9突變、核定位序列、nCas9和逆轉(zhuǎn)錄酶之間連接肽的長度和組成以及epegRNA優(yōu)化得到的PEmax架構(gòu)，可將編輯效率進一步提高2倍[37]。此外，高彩霞團隊發(fā)現(xiàn)在植物中使用一對分別靶向目的基因兩條DNA鏈的pegRNA可以顯著提高PEs編輯效率，并且實現(xiàn)短片段的插入[38]。

人類遺傳變異還包括基因的插入缺失、重復(fù)及倒位等多涉及大片段DNA的變異，治療此類遺傳疾病需要開發(fā)出能夠精確地刪除插入或復(fù)制的DNA序列，并修復(fù)被破壞基因位點的基因編輯工具。（1）PRIME-Del系統(tǒng)。其在PE2基礎(chǔ)上使用一對分別靶向目的基因兩條DNA鏈的pegRNA來誘導(dǎo)兩個nCas9切口之間的基因刪除，重要的是需保證pegRNA上逆轉(zhuǎn)錄的模板與另一條pegRNA靶向的切口位點序列同源，以促進DNA修復(fù)整合。實驗結(jié)果顯示該系統(tǒng)可以精準(zhǔn)刪除長達10 kb的DNA片段，同時可以在pegRNA逆轉(zhuǎn)錄模板上引入短片段的插入[39]。（2）由原始Cas9與逆轉(zhuǎn)錄酶的融合蛋白以及一對pegRNA組成的PEDAR系統(tǒng)。該系統(tǒng)要保證逆轉(zhuǎn)錄酶能夠沿模板在Cas9的切口兩側(cè)各合成一段粘性末端，經(jīng)過退火和DNA修復(fù)連接后，可以實現(xiàn)精確刪除長片段的同時插入外源DNA。實驗結(jié)果顯示，PEDAR系統(tǒng)可刪除長達10 kb的DNA片段，同時插入60 bp左右的外源DNA，但與PRIME-Del系統(tǒng)相比，它有較高的indels風(fēng)險[40]。（3）TwinPE系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用一對pegRNA靶向目的基因的兩條鏈，與PRIME-Del不同的是，TwinPE的pegRNA逆轉(zhuǎn)錄模板不需與DNA鏈同源，因此TwinPE系統(tǒng)具有更靈活的模板序列，以及更大的長片段插入能力。受限于PE2系統(tǒng)插入片段長度的限度，TwinPE系統(tǒng)最多插入100 bp的DNA片段。為了能夠插入更長的片段，研究人員將TwinPE系統(tǒng)與位點特異性整合酶Bxb1結(jié)合，使其能夠整合大于5 kb的目的基因，并實現(xiàn)了長達40 kb的基因倒置[41]。（4）GRAND編輯系統(tǒng)。與TwinPE系統(tǒng)相似，其兩條pegRNAs的逆轉(zhuǎn)錄模板僅部分互補結(jié)合，經(jīng)DNA修復(fù)機制，完成20 bp到1 kb DNA的靶向插入[42]。

3 疾病治療

CRISPR/Cas9在構(gòu)建動物疾病模型，尋找疾病治療的有效靶點，治療許多遺傳病、心血管疾病、傳染病以及癌癥中發(fā)揮重大作用[43]。

3.1 體外基因編輯治療

鐮刀型細胞貧血?。⊿ickle Cell Disease，SCD）是一種由編碼β-珠蛋白的HBB基因上第一個外顯子上發(fā)生單堿基突變引起的常染色體隱性遺傳病，在低氧條件下，會出現(xiàn)貧血、疼痛、免疫缺陷、多器官衰竭甚至早亡的癥狀[44]。有研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在祖細胞和永生化人紅細胞系中篩選出了可作為SCD治療靶點的轉(zhuǎn)錄因子HRI和ZNF410[45-47]。此外，使用一種新的ABE8e-NRCH對患者來源的造血干細胞和祖細胞（Hematopoietic Stem and Progenitor Cells，HSPCs）進行單堿基編輯，把致病突變纈氨酸（GTG）轉(zhuǎn)換為非致病突變丙氨酸（GCG），然后把編輯后的HSPCs移植到小鼠體內(nèi)，其基因編輯效率達到68%，小鼠體內(nèi)鐮狀紅細胞明顯減少，研究表明離體堿基編輯造血干細胞有望實現(xiàn)一次性永久治療SCD[48]。

一項利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)治療β-地中海貧血（Transfusion-Dependent β-Thalassemia，TDT）和SCD的臨床試驗也取得了喜人的結(jié)果。在這項研究中，研究人員使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在從患者體內(nèi)分離的HSPCs中對B細胞淋巴瘤11A（B-cell lymphoma 11A，BCL11A）基因進行編輯，以恢復(fù)患者胎兒血紅蛋白的產(chǎn)生，抑制鐮狀血紅蛋白聚合，隨后把編輯后的HSPCs注射到一名TDT患者和一名SCD患者體內(nèi)。經(jīng)過治療，兩名患者體內(nèi)維持高水平的胎兒血紅蛋白表達，血管阻塞發(fā)作消除[49]。

在一項治療晚期癌癥患者的人體實驗中，研究人員基于通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)去除免疫檢查點調(diào)節(jié)基因來增強細胞毒性T淋巴細胞的天然抗腫瘤反應(yīng)的策略，對3名患者血液中提取的T細胞進行改造，刪除了干擾對抗癌細胞的基因（TRAC、TRBC和PD-1），然后將改造后的T細胞重新注入患者體內(nèi)，改造后的T細胞可以靶向特定抗原并殺死癌細胞，沒有任何副作用，可存于體內(nèi)長達9個月[50]。

3.2 體內(nèi)基因編輯治療

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌溶菌素9（Proprotein Convertase Subtilisin Kexin 9，PCSK9）是一種參與膽固醇代謝的基因，人體中自然發(fā)生的功能喪失的PCSK9突變沒有明顯的不良健康后果，且攜帶此類突變的人血液中的低密度脂蛋白膽固醇水平較低，動脈粥樣硬化性心血管疾病的患病風(fēng)險較低，這表明破壞PCSK9基因可能是治療家族性高膽固醇血癥的一種重要策略[51]。實驗人員用脂質(zhì)納米顆粒將ABE mRNA與sgRNA有效遞送到靈長類動物體內(nèi)，并精確地在體內(nèi)引入單核苷酸PCSK9功能喪失突變，從而降低了血清中PCSK9和低密度脂蛋白膽固醇的水平，并在8個月內(nèi)保持穩(wěn)定[52-53]。

倫敦大學(xué)的研究人員進行了首個體內(nèi)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對人類基因進行編輯以治療ATTR淀粉樣變性的臨床試驗。ATTR淀粉樣變性是一種單基因疾病，其特征是錯誤折疊的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（Transthyretin，TTR）在人體神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟以及心臟等器官和組織中異常沉積，最終導(dǎo)致器官衰竭和死亡。該臨床實驗使用NTLA-2001來降低血清中TTR蛋白水平以治療ATTR淀粉樣變性。NTLA-2001由一個具有肝臟靶向遞送的脂質(zhì)納米顆粒（lipid Nanoparticle，LNP）遞送系統(tǒng)組成，其內(nèi)包裹一個靶向人類TTR基因的sgRNA和一個Cas9蛋白的mRNA序列。LNP遞送系統(tǒng)通過靜脈注射到血液循環(huán)中，其表面與血漿中載脂蛋白E相結(jié)合，然后被肝臟表面的低密度脂蛋白受體攝取，隨后LNP分解釋放內(nèi)容物，所以該系統(tǒng)可在體內(nèi)靶向肝臟遞送各種治療性RNA，如siRNA和mRNA[54]。TTR幾乎只在肝臟中表達，所以使用LNP這種以肝臟為靶點的遞送系統(tǒng)可以最大限度提高療效，同時減少全身毒性。6名患者低劑量注射NTLA-2001后血清TTR水平降低52%，高劑量注射后則降低了87%，僅有輕度不良反應(yīng)[55]。

4 CRISPR/Cas9應(yīng)用的挑戰(zhàn)與展望

盡管CRISPR/Cas9技術(shù)在基因組編輯上前景廣闊，但缺乏安全有效的靶向遞送系統(tǒng)、脫靶效應(yīng)、免疫原性以及癌癥和倫理問題一直是將該技術(shù)擴展到臨床應(yīng)用的主要障礙[56]。

將CRISPR系統(tǒng)有效地傳遞到特定的細胞和器官以進行基因編輯是治療過程中的一大挑戰(zhàn)，理想的遞送載體應(yīng)該是安全的，具有高效的靶向性、高效率和生物可降解[57]。根據(jù)治療方法的不同，遞送方法可能會有很大差異。目前，將CRISPR/Cas9復(fù)合物遞送到細胞中的方法主要有物理、化學(xué)和病毒載體3種。

非病毒（物理和化學(xué)）方法更適合離體基因編輯療法[58]，通常在患者體內(nèi)分離的衍生細胞中進行基因編輯，擴增后再重新引入患者體內(nèi)，可以使用質(zhì)粒載體、核糖核蛋白復(fù)合物、納米顆粒等將CRISPR系統(tǒng)遞送到細胞中[59]。離體遞送策略有幾個優(yōu)點：（1）遞送發(fā)生在細胞水平上，效率更高，可以在臨床應(yīng)用之前快速評估；（2）CRISPR系統(tǒng)沒有被引入體內(nèi)，降低了對其他組織的非特異性基因編輯；（3）使用來自患者的細胞可以減少免疫反應(yīng)的出現(xiàn)。然而，患者來源的細胞可能難以分離、培養(yǎng)和擴增，極大地限制了可治療疾病的范圍。此外，當(dāng)這些基因組編輯的細胞被重新引入患者體內(nèi)時，通常只有一小部分細胞能發(fā)揮功能[60]。

體內(nèi)基因編輯可以應(yīng)用于更廣泛的疾病治療，CRISPR系統(tǒng)主要由納米顆?；虿《据d體傳遞，常使用病毒載體有腺病毒（Adenovirus，AD）、腺相關(guān)病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）和慢病毒（Lentivirus，LV）載體，相比于物理和化學(xué)方法，其遞送效率更高[61]。AAV是最常用的病毒載體，因為它的免疫原性更低且不整合到宿主細胞基因組中[62]。然而，AAV最多可包裝4.7 kb的外源單鏈DNA，而Cas9蛋白較大，包裝困難。為了解決這一限制，常將sgRNA和Cas9分別包裝成兩個單獨的病毒，然后將它們共同注射到小鼠體內(nèi)[63]。但是，最近有研究報道AAV基因組能夠整合到Cas9產(chǎn)生的雙鏈斷裂位點[64]，且體內(nèi)有針對AAV衣殼蛋白的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生[65]，說明病毒載體的安全性和有效性有待解決。劉如謙教授團隊新開發(fā)了一種工程化的無DNA病毒樣顆粒（engineered DNA-Free Virus-Like Particles，eVLPs），其可以在多種細胞類型和器官中實現(xiàn)高效的基因編輯，并最大限度地減少脫靶和DNA整合的風(fēng)險，可用于治療性核糖核蛋白的包裝以及體外體內(nèi)的遞送，整合了病毒和非病毒載體的優(yōu)勢，具有廣泛的應(yīng)用前景[66]。雖然病毒載體是目前最有效的載體，但它們的應(yīng)用依然受限于其承載能力、免疫原性和致癌性[67-68]。

設(shè)計的sgRNA與非目標(biāo)DNA錯配，并導(dǎo)致意外的非特異性基因修飾，即為脫靶效應(yīng)。脫靶效應(yīng)可能導(dǎo)致序列突變、缺失、重排、免疫反應(yīng)和癌基因激活等有害事件，嚴(yán)重限制CRISPR/Cas9系統(tǒng)在臨床治療方面的應(yīng)用[5]。目前主要通過對sgRNA優(yōu)化、Cas9核酸酶的修飾、其他Cas變體的使用等策略來降低脫靶效應(yīng)[57]。研究人員發(fā)現(xiàn)，健康人體內(nèi)既有對Cas9蛋白的體液（抗Cas9抗體）免疫反應(yīng)，也有細胞（抗Cas9 T細胞）免疫反應(yīng)。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)來源于細菌，它們可以感染人類，因此如何檢測和降低Cas9蛋白的免疫原性仍然是該系統(tǒng)臨床試驗中最重要的挑戰(zhàn)之一[69]。此外，CRISPR/Cas9可以誘導(dǎo)p53信號通路的激活，即經(jīng)過基因編輯的細胞很可能成為潛在的癌癥起始細胞，在治療中額外誘發(fā)癌癥。如使用CRISPR/Cas9對1 000多條斑馬魚的基因組進行編輯時，第一代和其后代都產(chǎn)生意外的突變，并且這種突變可以遺傳[70]。最后，人們擔(dān)心以生育為目的的基因編輯會永久性地改變?nèi)祟惢驇?，因此目前不?yīng)嘗試將人類基因組編輯用于生殖目的[71]。