不同飼養(yǎng)方式對牦牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物菌群的影響

龐凱悅 戴東文 楊英魁 王 迅 劉書杰 周振明 張新軍 柴沙駝* 王書祥*

(1.青海大學(xué)，西寧810016；2.青海省高原放牧家畜營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室，西寧810016；3.青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，西寧810016；4.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京100193；5.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系中衛(wèi)綜合試驗站，中衛(wèi)755000)

牦牛是生活在青藏高原的特有畜種，是當(dāng)?shù)啬撩裰匾纳a(chǎn)和生活資料[1]。目前，牦牛的飼養(yǎng)方式主要以放牧為主，由于青藏高原獨特的地理環(huán)境，導(dǎo)致天然牧草存在季節(jié)性動態(tài)變化，尤其是在冷季，牧草產(chǎn)量和營養(yǎng)水平遠(yuǎn)不能滿足牦牛正常的營養(yǎng)需要，導(dǎo)致牦牛出欄周期長、養(yǎng)殖效益低[2]。研究表明，全混合日糧(TMR)舍飼在一定程度上可提高肉牛的平均日增重、凈肉率和屠宰率，改善瘤胃發(fā)酵，降低甲烷的排放[3-5]，但是牦牛全混合日糧舍飼方面的研究報道較少。瘤胃是反芻動物消化飼糧的重要場所，其中含有大量的細(xì)菌、真菌、原生蟲和古生菌等[6]。眾所周知，飼糧組成和營養(yǎng)成分是影響瘤胃微生物的最重要因素[7]。田發(fā)益等[8]研究發(fā)現(xiàn)，放牧組彭波半細(xì)毛羊的瘤胃細(xì)菌多樣性和豐富度較舍飼組顯著提高，而擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度顯著降低。胡丹丹[9]研究表明，隨著飼糧精粗比的提高，奶牛瘤胃中總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度和降解淀粉和蔗糖等碳水化合物的相關(guān)菌屬相對豐度也隨之升高，但瘤胃pH和降解木質(zhì)纖維素的相關(guān)菌群相對豐度隨之降低。由此可見，不同的飼養(yǎng)方式會影響反芻動物瘤胃發(fā)酵及菌群結(jié)構(gòu)組成，進(jìn)而影響其生產(chǎn)性能。因此，本研究旨在通過16S rDNA高通量測序技術(shù)，研究不同飼養(yǎng)方式下牦牛瘤胃細(xì)菌結(jié)構(gòu)的差異，為牦牛高效養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

試驗于2020年5—8月在青海省海晏縣夏華牧場進(jìn)行。選取3周歲、體重[(176.3±14.7) kg]相近、體況良好的公牦牛20頭，隨機(jī)分為2組(n=10)：放牧組(放牧)、舍飼組(全混合日糧)。試驗期100 d，其中預(yù)試期10 d，正試期90 d。

1.2 試驗飼糧與飼養(yǎng)管理

放牧組牦牛08:00出牧，18:00收牧。放牧草場主要包括高山嵩草、矮嵩草、紫花針茅、異針茅、芨芨草、珠芽蓼、苔草等。舍飼組牦牛全混合日糧參考《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)[10]配制，06:00、17:00各飼喂1次，所有牦牛試驗期自由采食與飲水。牧草營養(yǎng)水平和全混合日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 牧草營養(yǎng)水平和全混合日糧組成及

1.3 樣品采集與處理

在正式試驗第50天，觀察試驗放牧耗牛所吃的牧草，然后驅(qū)離試驗牦牛，在牦牛吃草的地方用1 m×1 m樣方框采集牧草10份，去除不可食牧草，保留可食牧草，放于105 ℃烘箱烘至質(zhì)量恒定，粉碎過篩后進(jìn)行牧草營養(yǎng)成分的測定。在正式試驗第90天，晨飼前，采用胃管式采樣器每頭耗牛采集瘤胃液150 mL，4層紗布過濾后立即測定pH，剩余瘤胃液樣品分裝至15 mL離心管中，立即用液氮冷凍。

1.4 指標(biāo)測定與方法

1.4.1 營養(yǎng)成分的測定

粗蛋白質(zhì)(CP)含量采用GB/T 6432—2018[11]的方法測定，粗脂肪(EE)含量采用GB/T 6433—2006[12]的方法測定，中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)含量采用Van Soest等[13]的方法測定，鈣(Ca)含量采用GB/T 6436—2002[14]的方法測定，磷(P)含量采用GB/T 6437—2002[15]的方法測定。

1.4.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定

采用臺式酸度計(HI221型，意大利HANNA公司)測定瘤胃液pH；參照馮宗慈[16]的比色法測定瘤胃液中氨態(tài)氮(NH3-N)濃度，使用儀器為紫外可見分光光度計(TU-1810型，北京普析通用儀器有限公司)，提前預(yù)熱30 min，在波長625 nm處測定溶液吸光度(OD)值，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的NH3-N濃度；參照Cotta等[17]差速離心法分離出發(fā)酵液中的微生物蛋白(MCP)，采用考馬斯亮藍(lán)法測定MCP濃度；揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度測定參考文獻(xiàn)[18-19]，使用儀器為氣相色譜儀(GC-2014型，日本Shimadzu公司)。

1.4.3 瘤胃微生物菌群測定及數(shù)據(jù)分析

瘤胃液樣品送至北京奧維森基因科技有限公司測序，測序平臺為Miseq PE 300，利用16S rRNA技術(shù)測定瘤胃微生物菌群多樣性。從瘤胃液樣品中提取DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳評價DNA的質(zhì)量。測序平臺獲得的原始測序數(shù)據(jù)采用Trimmomatic V0.36、Pear V0.9.6軟件進(jìn)行處理和質(zhì)量過濾，利用Flash V1.20、Pear V0.9.6軟件根據(jù)PE的overlap關(guān)系對兩端序列進(jìn)行拼接處理，得到Fasta序列，通過uchime比對去除Fasta序列的嵌合體，得到有效序列。對相似性大于97%的序列進(jìn)行篩選，產(chǎn)生操作分類單元(OTU)，并對OTU聚類、物種分類、多樣性指數(shù)和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計分析。通過Spearman檢驗方法，選取瘤胃發(fā)酵參數(shù)和相對豐度前20的屬進(jìn)行相互關(guān)聯(lián)性分析。利用PICRUSt軟件進(jìn)行瘤胃微生物的代謝途徑的功能預(yù)測。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和t檢驗，P<0.05表示顯著差異，P>0.05表示差異不顯著，結(jié)果均以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼養(yǎng)方式對牦牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表2可知，與放牧組對比，舍飼組瘤胃TVFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度顯著提高(P<0.05)，而瘤胃pH顯著降低(P<0.05)。

表2 不同飼喂方式對牦牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.2 不同飼養(yǎng)方式對牦牛瘤胃微生物菌群豐富度與多樣性的影響

通過α多樣性分析(表3和圖1)可知，2組的微生物菌群豐富度存在差異，舍飼組Chao1指數(shù)顯著高于放牧組(P<0.05)。這表明舍飼增加了牦牛瘤胃微生物菌群的豐富度。

表3 不同飼養(yǎng)方式對牦牛瘤胃微生物菌群α多樣性的影響

FM：放牧組 herding group；TMR：舍飼組 barn feeding group。下圖同 the same as below.

2.3 不同飼養(yǎng)方式對牦牛瘤胃微生物菌群組成差異的影響

在門水平上， 鑒定出23種菌門，厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門分別占總數(shù)的51.98%和41.27%(圖2-A)。在門水平上(圖2-B)，舍飼組牦牛瘤胃的Saccharibacteria、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、擬桿菌門、螺旋體門(Spirochaetae)、軟壁菌門(Tenericutes)相對豐度顯著高于放牧組(P<0.05)。與此相反，放牧組牦牛瘤胃的浮霉菌門(Planctomycetes)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)和厚壁菌門相對豐度顯著高于舍飼組(P<0.05)。

A：Relative abundance：相對豐度；Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Proteobacteria：變形菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Other：其他。

在屬水平上， 共鑒定出226種菌屬，優(yōu)勢屬為未確認(rèn)屬(unidentified)(22.38%)、普雷沃菌屬_1(Prevotella_1)(16.89%)、克里斯滕森菌科_R-7(Christensenellaceae_R-7)(10.96%)、理研菌科_RC9(Rikenellaceae_RC9)(5.89%)、瘤胃球菌科_NK4A214(Ruminococcaceae_NK4A214)(5.55%)、解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)(2.99%)、丁酸弧菌屬_2(Butyrivibrio_2)(1.80%)、瘤胃球菌科_UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)(1.68%)、瘤胃球菌屬_1(Ruminococcus_1)(1.57%)和產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌(Eubacterium_coprostanoligenes)(1.57%)(圖3-A)。在屬水平上(圖3-B)，舍飼組牦牛瘤胃的Candidatus_Saccharimonas、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、螺旋體屬_2(Spirochaeta_2)、凸腹真桿菌屬(Eubacterium_ventriosum_group)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度顯著高于放牧組(P<0.05)。與此相反，放牧組牦牛瘤胃的羅斯氏菌屬(Roseburia)、狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、Family-ⅩⅢ-AD3011、丁酸弧菌屬_2和奎因氏菌屬(Quinella)相對豐度均顯著高于舍飼組(P<0.05)。

A：Relative abundance：相對豐度；unidentified：未確認(rèn)屬；Prevotella_1：普雷沃菌屬_1；Christensenellaceae_R-7：克里斯滕森菌科_R-7；Rikenellaceae_RC9：理研菌科_RC9；Ruminococcaceae_NK4A214：瘤胃球菌科_NK4A214；Succiniclasticum：解琥珀酸菌屬；Butyrivibrio_2：丁酸弧菌屬_2；Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃球菌科_UCG-014；Ruminococcus_1：瘤胃球菌屬_1；Eubacterium_coprostanoligenes：產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌；Prevotellaceae_UCG-003：普雷沃菌科_UCG-003；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃菌科_UCG-001；Saccharofermentans：產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬；Selenomonas_1：月形單胞菌屬；Pseudobutyrivibrio：假丁酸弧菌；Lachnospiraceae_XPB1014：毛螺菌科_XPB1014；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃球菌科_UCG-005；Ruminococcaceae_UCG-010：瘤胃球菌科_UCG-010；Veillonellaceae_UCG-001：韋榮氏菌科_UCG-001；Lachnospiraceae_ND3007：毛螺菌科_ND3007；Other：其他。

使用加權(quán)UniFrac基質(zhì)距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)來揭示2種不同飼養(yǎng)方式對瘤胃細(xì)菌菌落的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌落按不同飼養(yǎng)方式聚類(圖4)。

圖4 牦牛瘤胃微生物菌群的主坐標(biāo)分析

2.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù)與瘤胃微生物菌群的相關(guān)性研究

根據(jù)Spearman的相關(guān)系數(shù)，對瘤胃發(fā)酵參數(shù)與瘤胃微生物菌群進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析(圖5)。異戊酸、戊酸、異丁酸、乙酸、丙酸、丁酸、MCP濃度和乙酸/丙酸、pH與瘤胃微生物菌群之間的相關(guān)性顯著(P<0.05)，而NH3-N濃度與瘤胃微生物菌群之間的相關(guān)性不顯著(P>0.05)。其中，瘤胃球菌科_UCG_014(Ruminococcaceae_UCG_014)相對豐度與戊酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，普雷沃氏菌科_UCG_003(Prevotellaceae_UCG_003)相對豐度與異丁酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，瘤胃球菌屬_1相對豐度與乙酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，瘤胃球菌科_UCG_010(Ruminococcaceae_UCG_010)相對豐度與乙酸和MCP濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，假丁酸菌屬(Pseudobutyrivibrio)、奎氏菌屬(Quinella)和丁酸弧菌屬_2相對豐度與乙酸、丙酸和丁酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，韋榮氏球菌科_UCG_001(Veillonellaceae_UCG_001)相對豐度與乙酸和丁酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，月形單胞菌_1(Selenomonas_1)相對豐度與丙酸和丁酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，瘤胃球菌科_UCG_005(Ruminococcaceae_UCG_005)相對豐度與乙酸和丙酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；理研菌科_RC9相對豐度與乙酸濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，瘤胃球菌科_UCG_014相對豐度與丙酸濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，解琥珀酸菌屬相對豐度與丙酸和丁酸濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，克里斯滕森菌科_R_7(Christensenellaceae_R_7)和瘤胃球菌科_UCG_NK4A214(Ruminococcaceae_UCG_NK4A214)相對豐度與乙酸/丙酸呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，瘤胃球菌屬_1、瘤胃球菌科_UCG_010和瘤胃球菌科_UCG_005相對豐度與異戊酸濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，瘤胃球菌屬_1、假丁酸菌屬、奎因氏菌屬、丁酸弧菌屬_2、韋榮氏球菌科_UCG_001和瘤胃球菌科_UCG_005相對豐度與pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

Isovalerate：異戊酸；Valerate：戊酸；NH3-H：氨態(tài)氮；Isobutyrate：異丁酸；Acetate:propinate：乙酸/丙酸； MCP：微生物蛋白；Acetate：乙酸；Propionate：丙酸；Butyrate：丁酸；Rikenellaceae_RC9：理研菌科_RC9； Ruminococcaceae_UCG_014：瘤胃球菌科_UCG_014；Succiniclasticum：解琥珀酸菌屬；Prevotella_1：普雷沃菌屬_1；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃菌科_UCG-001；Saccharofermentans：產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬；Lachnospiraceae_NK3A20：毛螺菌科_NK3A20；Prevotellaceae_UCG-003：普雷沃菌科_UCG-003；Christensenellaceae_R_7：克里斯滕森菌科_R_7；Ruminococcaceae_UCG_NK4A214：瘤胃球菌科_UCG_NK4A214；Ruminococcus_1：瘤胃球菌屬_1；Ruminococcaceae_UCG_010：瘤胃球菌科_UCG_010；Lachnospiraceae_XPB1014：毛螺菌科_XPB1014；Pseudobutyrivibrio：假丁酸菌屬；Quinella：奎氏菌屬；Butyrivibrio_2：丁酸弧菌屬；Veillonellaceae_UCG_001：韋榮氏球菌科_UCG_001；Selenomonas_1：月形單胞菌_1；Ruminococcaceae_UCG_005：瘤胃球菌科_UCG_005。

2.5 不同飼養(yǎng)方式對瘤胃微生物菌群代謝途徑及功能的影響

用PICR USt預(yù)測瘤胃微生物菌群的代謝功能。在KEGG2水平，所有的瘤胃樣本中最豐富(相對豐度>0.10%)的有24個基因家族。屬于碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、輔因子和維生素代謝(metabolism of cofactors and vitamins)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、萜類和多酮類代謝(metabolism of terpenoids and polyketides)、其他氨基酸代謝(metabolism of other amino acids)、復(fù)制和修復(fù)(replication and repair)、能量代謝(energy metabolism)、脂類代謝(lipid metabolism)、聚糖生物合成與代謝(glycan biosynthesis and metabolism)和翻譯(translation)的基因家族在2組中相對豐度最高(圖6)。在這些基因家族中，舍飼組能量代謝、核苷酸代謝(nucleotide metabolism)、轉(zhuǎn)錄(transcription)、運(yùn)輸和分解代謝(transport and catabolism)的基因家族相對豐度顯著高于放牧組(P<0.05)，舍飼組細(xì)菌傳染病(infectious disease：bacterial)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)(membrane transport)、抗菌劑耐藥性(drug resistance：antimicrobial)和細(xì)胞運(yùn)動(cell motility)的基因家族相對豐度顯著低于放牧組(P<0.05)(圖7)。

Relative abundance：相對豐度；Other：其他；Carbohydrate metabolism：碳水化合物代謝；Metabolism of cofactors and vitamins：輔因子和維生素代謝；Amino acid metabolism：氨基酸代謝；Metabolism of terpenoids and polyketides：萜類和多酮類代謝；Metabolism of other amino acids：其他氨基酸代謝；Replication and repair：復(fù)制和修復(fù)；Energy metabolism：能量代謝；Lipid metabolism：脂類代謝；Glycan biosynthesis and metabolism：聚糖生物合成與代謝；Translation：翻譯。

95% confidence intervals：95%置信區(qū)間；Difference in mean proportions：平均比例差；Mean proportion：平均比例；Infectious disease：bacterial：細(xì)菌傳染?。籈nergy metabolism：能量代謝；Nucleotide metabolism：核苷酸代謝；Membrane transport：膜轉(zhuǎn)運(yùn)；Drug resistance：antimicrobial：抗菌劑耐藥性；Transcription：轉(zhuǎn)錄；Cell motility：細(xì)胞運(yùn)動；Transport and catabolism：運(yùn)輸和分解代謝。

在KEGG3水平 ，有106條最豐富的途徑。在這些途徑中，安沙霉素的生物合成(biosynthesis of ansamycins)，萬古霉素類抗生素的生物合成(biosynthesis of vancomycin group antibiotics)，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸生物合成(valine leucine and isoleucine biosynthesis)，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝(D-glutamine andD-glutamate metabolism)，肽聚糖生物合成(peptidoglycan biosynthesis)，葉酸一碳庫(one carbon pool by folate)，泛酸和輔酶A生物合成(pantothenate and CoA biosynthesis)，配錯基因修復(fù)(mismatch repair)，胺酰tRNA生物合成(aminoacyl-tRNA biosynthesis)和鏈霉素生物合成(streptomycin biosynthesis)具有高度代表性(圖8)。30種途徑的相對豐度顯示出2組之間的顯著差異(圖9)。舍飼組三羧酸循環(huán)[citrate cycle(TCA cycle)]、牛磺酸和亞?；撬岽x(taurine and hypotaurine metabolism)、原核生物的碳固定途徑(carbon fixation pathways in prokaryotes)、嘧啶代謝(pyrimidine metabolism)、同源重組(homologous recombination)、萬古霉素類抗生素的生物合成、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)、嘌呤代謝(purine metabolism)、DNA復(fù)制(DNA replication)途徑的相對豐度顯著高于放牧組(P<0.05)。舍飼組雙酚降解(bisphenol degradation)、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)[phosphotransferase system (PTS)]、C5-支鏈二元酸代謝(C5-branched dibasic acid metabolism)、次級膽汁酸生物合成(secondary bile acid biosynthesis)、β內(nèi)酰胺抗藥性[beta-lactam resistance (ko01501)]、卟啉與葉綠素代謝(porphyrin and chlorophyll metabolism)和二羧酸代謝(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)途徑的相對豐度顯著低于放牧組(P<0.05)。

Relative abundance：相對豐度；Other：其他；Biosynthesis of ansamycins：安沙霉素的生物合成；Biosynthesis of vancomycin group antibiotics：萬古霉素類抗生素的生物合成；Valine leucine and isoleucine biosynthesis：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸生物合成；D-glutamine and D-glutamate metabolism：D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝；Peptidoglycan biosynthesis：肽聚糖生物合成；One carbon pool by folate：葉酸一碳庫；Pantothenate and CoA biosynthesis：泛酸和輔酶A生物合成；Mismatch repair：配錯基因修復(fù)；Aminoacyl-tRNA biosynthesis：胺酰tRNA生物合成；Streptomycin biosynthesis：鏈霉素生物合成。

95% confidence intervals：95%置信區(qū)間；Difference in mean proportions：平均比例差；Mean proportion：平均比例；P-value：P值；Bisphenol degradation：雙酚降解；Phosphotransferase system(PTS)：磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)；Citrate cycle(TCA cycle)：三羧酸循環(huán)；Taurine and hypotaurine metabolism：牛磺酸和亞?；撬岽x；Carbon fixation pathways in prokaryotes：原核生物的碳固定途徑；C5-branched dibasic acid metabolism：C5-支鏈二元酸代謝；Pyrimidine metabolism：嘧啶代謝；Secondary bile acid biosynthesis：次級膽汁酸生物合成；Homologous recombination：同源重組；beta-lactam resistance(ko01501)：β內(nèi)酰胺抗藥性；Biosynthesis of vancomycin group antibiotics：萬古霉素類抗生素的生物合成；Porphyrin and chlorophyll metabolism：卟啉與葉綠素代謝；Oxidative phosphorylation：氧化磷酸化；Glyoxylate and dicarboxylate metabolism：二羧酸代謝；Glycolysis/gluconeogenesis：糖酵解/糖異生；Tyrosine metabolism：酪氨酸代謝；Purine metabolism：嘌呤代謝；DNA replication：DNA復(fù)制；RNA polymerase：RNA聚合酶；Carbon fixation in photosynthetic organisms：光合生物的固碳作用；Glycine，serine and threonine metabolism：甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝；Zeatin biosynthesis：玉米素生物合成；Bacterial chemotaxis：細(xì)菌趨化性；Glutathione metabolism：谷胱甘肽代謝；One carbon pool by folate：葉酸一碳庫；RNA degradation：RNA降解；ABC transporters：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；Peroxisome：過氧化物酶體；Cyanoamino acid metabolism：氨基酸代謝；Folate biosynthesis：葉酸合成。

3 討 論

3.1 不同飼養(yǎng)方式對牦牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃是反芻動物特有的消化器官，對反芻動物來說穩(wěn)定的瘤胃內(nèi)環(huán)境尤為重要。pH和VFA是衡量瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和反映瘤胃發(fā)酵狀況的重要指標(biāo)[20]。pH是直接反映瘤胃發(fā)酵水平最基礎(chǔ)的指標(biāo)[21]。張永勝等[22]研究發(fā)現(xiàn)，與放牧補(bǔ)飼相比，舍飼育肥顯著提高了絨山羊羔羊瘤胃MCP和NH3-N濃度，有降低pH的趨勢。本研究結(jié)果表明：舍飼組的瘤胃MCP和NH3-N濃度與放牧組差異不顯著，但舍飼組在數(shù)值上有所增加，舍飼組的瘤胃pH顯著低于放牧組。本試驗在全混合日糧的飼喂方式下，瘤胃NH3-N和MCP濃度較高，說明全混合日糧的飼喂方式可以提高瘤胃MCP的合成，但舍飼組的瘤胃pH顯著低于放牧組，可能是由于在舍飼的條件下，牦牛攝入的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物增加，在瘤胃中迅速發(fā)酵，產(chǎn)生大量的VFA和乳酸等物質(zhì)，而導(dǎo)致pH的下降。

VFA是反芻動物瘤胃飼糧中碳水化合物和蛋白質(zhì)的最終產(chǎn)物，為機(jī)體提供了70%～80%的能量[23]。瘤胃中的乙酸、丙酸和丁酸是VFA的主要組成部分[24]。乙酸有利于動物體脂率的提高，丙酸能提高葡萄糖的轉(zhuǎn)化和貯存，丁酸為機(jī)體各組織提供能量[25]。本試驗條件下，舍飼組的瘤胃TVFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度顯著高于放牧組，這與孫國平等[26]研究結(jié)果基本一致，說明在舍飼的條件下飼糧營養(yǎng)水平均衡，使瘤胃TVFA濃度升高。在全混合日糧的飼喂方式下可以提高瘤胃乙酸、丙酸和丁酸濃度，乙酸濃度的增加會使分解纖維素菌活性增加；丙酸濃度的增加會提高瘤胃上皮對VFA的吸收率，進(jìn)而提高飼糧營養(yǎng)物質(zhì)消化率[27]；乙酸、丙酸和丁酸濃度的增加使瘤胃TVFA濃度增加，促進(jìn)飼料中纖維素物質(zhì)的降解，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，有利于牦牛的育肥。

3.2 不同飼養(yǎng)方式對牦牛瘤胃微生物菌群豐富度與多樣性的影響

16S rDNA高通量測序技術(shù)可以快速、全面了解不同飼養(yǎng)方式對牦牛瘤胃微生物菌群的影響。微生物多樣性是衡量微生物菌群豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，主要包括的指標(biāo)有Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)。Chao1指數(shù)衡量菌群的豐富度，Chao1指數(shù)越高，表示樣本中的菌群豐富度越大。Shannon指數(shù)衡量菌群的多樣性，Shannon指數(shù)越高，表示樣本中的菌群多樣性越高[28]。張振宇等[29]研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼糧能量水平的增加，Chao1指數(shù)顯著降低，Shannon指數(shù)無顯著差異，這說明不同的飼糧能量水平會影響牦牛瘤胃微生物菌群，并且飼糧能量水平的增加會降低瘤胃微生物菌群的豐富度，但Shannon指數(shù)變化不顯著，說明在2種飼養(yǎng)方式下設(shè)計的飼糧能量水平的差異沒有影響牦牛瘤胃微生物菌群的多樣性。本試驗中，與放牧組相比，舍飼組牦牛瘤胃微生物菌群Chao1指數(shù)顯著升高，Shannon指數(shù)無顯著差異，表明舍飼牦牛的瘤胃微生物菌群豐富度高于放牧牦牛，這與上述研究結(jié)果基本一致。

3.3 不同飼養(yǎng)方式對牦牛瘤胃微生物菌群組成的影響

飼料的結(jié)構(gòu)是影響反芻動物瘤胃微生物菌群發(fā)生變化的首要因素[30]。飼料的類型也會影響瘤胃微生物菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性[31]。大量對反芻動物的研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門是反芻動物瘤胃微生物的優(yōu)勢菌門[32-33]，其次是變形菌門，還有少量的軟壁菌門和螺旋體菌門等[34]。厚壁菌門主要參與纖維物質(zhì)的分解；而擬桿菌門主要參與非纖維物質(zhì)的降解[35-36]，對反芻動物的營養(yǎng)代謝非常重要。本研究結(jié)果表明，舍飼組和放牧組牦牛瘤胃的厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度分別占整個菌門的51.98%和41.27%，與以上研究結(jié)果一致。曹連賓等[37]研究表明，舍飼牦牛瘤胃的擬桿菌門相對豐度所占的比例比放牧牦牛要高，舍飼牦牛瘤胃的厚壁菌門相對豐度所占比例比放牧牦牛瘤胃要低。本試驗中，舍飼組牦牛瘤胃的擬桿菌門相對豐度顯著高于放牧組，而厚壁菌門相對豐度顯著低于放牧組，與以上研究結(jié)果相一致，說明在全混合日糧的飼喂方式下有利于提高與非纖維物質(zhì)降解有關(guān)的細(xì)菌數(shù)量。黎凌鑠等[38]研究表明，小肽和酵母培養(yǎng)物的添加提高了螺旋體門、纖維桿菌門和Saccharibacteria相對豐度，與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明，舍飼組牦牛瘤胃的Saccharibacteria相對豐度顯著高于放牧組。浮霉菌門是嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性菌，有研究者在研究黃粉蟲降解腸道塑料廢物的能力時發(fā)現(xiàn)，黃粉蟲的腸道浮霉菌門可以降解燕麥等纖維飼料，在喂食聚苯乙烯后浮霉菌門的攝食頻率增加[39]。李娟等[40]研究表明，與放牧組相比，舍飼組牦牛瘤胃的擬桿菌門、軟壁菌門和浮霉菌門相對豐度均增加，與本研究結(jié)果相一致。本試驗中，舍飼組牦牛瘤胃的擬桿菌門和軟壁菌門相對豐度均顯著高于放牧組，但浮霉菌門相對豐度顯著低于放牧組，原因可能是由于放牧環(huán)境及飼糧組成的不同而產(chǎn)生差異。研究表明，螺旋體門能有效降解纖維素、果膠和磷酸鹽，發(fā)酵形成VFA，為反芻動物機(jī)體提供能量[41]。王柏輝[42]研究表明，舍飼組蘇尼特羊瘤胃的螺旋體門相對豐度顯著高于放牧組，互養(yǎng)菌門相對豐度顯著低于放牧組。本試驗中，舍飼組牦牛瘤胃的螺旋體門相對豐度顯著高于放牧組，舍飼組的互養(yǎng)菌門相對豐度顯著低于放牧組，這與以上研究結(jié)果相一致，這可能是因為在全混合日糧的飼喂方式下調(diào)節(jié)了牦牛瘤胃菌群，既提高了牦牛瘤胃對纖維素的降解率，又調(diào)控了瘤胃菌落結(jié)構(gòu)的合理性。螺旋體門相對豐度的升高有利于降解纖維素，提高牦牛對飼料的消化吸收，從可發(fā)酵的碳水化合物中合成VFA，進(jìn)而為牦牛提供能量。

在屬水平上，本試驗中的unidentified、普雷沃菌屬_1和克里斯滕森菌科_R-7是瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌屬。普雷沃菌屬是反芻動物瘤胃和胃腸道的一種蛋白質(zhì)降解菌，主要降解飼糧中的半纖維成分，并且普雷沃菌屬可產(chǎn)生大量復(fù)合酶，促進(jìn)非纖維性多糖和果膠的降解[43]。王祖艷等[44]研究表明，奶牛瘤胃菌群屬水平的普雷沃菌屬是主要優(yōu)勢菌屬。陳凱等[45]研究也發(fā)現(xiàn)，在肉牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系中普雷沃氏菌屬和解琥珀酸菌屬是已知分類菌屬的優(yōu)勢菌屬。本試驗中，舍飼組牦牛瘤胃的普雷沃菌屬_1相對豐度比放牧組高，但差異不顯著，這與Bekele等[46]研究結(jié)果一致，說明在全混合日糧的飼喂方式下能提高普雷沃菌屬的數(shù)量，提高半纖維素被分解的效率?？死锼闺坪兔菪鷮俣紝儆谒缶V的梭菌目，這些菌群中的大多數(shù)能夠在宿主腸道內(nèi)發(fā)酵未被吸收的多糖，產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFAs)，如乙酸、丙酸和丁酸[47]。在本研究中，舍飼組牦牛瘤胃的克里斯滕森菌科_R-7相對豐度比放牧組高，同時舍飼組牦牛瘤胃乙酸濃度顯著高于放牧組，與李嵐捷等[48]的研究結(jié)果相一致。醋酸桿菌屬主發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸[49]；螺旋體屬是嚴(yán)格發(fā)酵碳水化合物的微生物，其代謝與梭狀芽孢菌屬相似，它通過糖酵解途徑發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)生乙酸、乙醇、二氧化碳和氫氣作為主要終產(chǎn)物[50]。乳酸桿菌屬可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸[51]，乳酸越多，糖酵解的能量供應(yīng)能力越強(qiáng)。本試驗中，舍飼組牦牛瘤胃的醋酸桿菌屬、螺旋體屬_2和乳酸桿菌屬相對豐度顯著高于放牧組，結(jié)果表明，全混合日糧的飼喂方式下有利于提高牦牛瘤胃中纖維降解菌屬相對豐度，并且提高乙酸和乳酸濃度，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，提高牦牛的生長發(fā)育。

3.4 不同飼養(yǎng)方式對瘤胃發(fā)酵參數(shù)與瘤胃微生物的相關(guān)性研究

通過瘤胃發(fā)酵參數(shù)與瘤胃微生物的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，乙酸、丙酸和丁酸濃度與瘤胃球菌屬_1、瘤胃球菌科_UCG_010、假丁酸菌屬、奎氏菌屬、丁酸弧菌屬_2、韋榮氏球菌科_UCG_001、硒單胞菌、瘤胃球菌科_UCG_005、理研菌科_RC9、瘤胃球菌科_UCG_014、解琥珀酸菌屬和瘤胃球菌科_UCG_NK4A214相對豐度密切相關(guān)。瘤胃球菌屬是瘤胃中重要的纖維降解菌，主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸[52]，在瘤胃內(nèi)對降解纖維素的產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用，其中瘤胃球菌屬_1、瘤胃球菌科_UCG_010和瘤胃球菌科_UCG_005相對豐度與乙酸濃度呈負(fù)相關(guān)，這與張林[53]的研究結(jié)果相一致。在不同的飼喂方式下，飼料來源不同，特別是全混合日糧，飼糧營養(yǎng)水平均衡，這就導(dǎo)致放牧牦牛和舍飼牦牛的飼糧營養(yǎng)水平存在差異，營養(yǎng)物質(zhì)的變化導(dǎo)致瘤胃內(nèi)微生物菌群的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而微生物代謝產(chǎn)物也發(fā)生相應(yīng)的變化[54]。由此可見，牦牛在不同飼養(yǎng)方式下產(chǎn)生的VFA與瘤胃微生物菌群有相同之處，也有不同之處，說明這些瘤胃微生物之間可能存在一定的協(xié)同調(diào)控作用，進(jìn)而維持瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

3.5 不同飼養(yǎng)方式對瘤胃微生物菌群代謝途徑及功能的預(yù)測

利用PICRUSt預(yù)測瘤胃微生物菌群的代謝功能，在KEGG2水平檢測到預(yù)測功能的相對豐度，其中，碳水化合物代謝是與代謝相關(guān)的最豐富的途徑，其次是輔助因子和維生素代謝、氨基酸代謝、萜類和聚酮類代謝、其他氨基酸代謝、復(fù)制和修復(fù)、能量代謝、類脂物代謝作用、聚糖生物合成與代謝和翻譯，這些對動物胃腸道微生物群落的生存、生長和繁殖至關(guān)重要[55]。碳水化合物是反芻動物的主要能量來源[56]，能量是飼料的重要組成部分，它能確定動物的飼料攝入量[57]，并且在維持動物的生長及新陳代謝中起著重要的作用。因此，動物的碳水化合物代謝和能量代謝對動物機(jī)體生長尤為重要。本試驗結(jié)果表明，舍飼組能量代謝、核苷酸代謝、轉(zhuǎn)錄、運(yùn)輸和分解代謝的相對豐度顯著高于放牧組，說明在全混合日糧的飼喂方式下有助于牦牛能量代謝通路的上調(diào)。在KEGG3水平，安沙霉素的生物合成相對豐度最高，在舍飼組中，負(fù)責(zé)糖酵解/糖異生的基因上調(diào)，這表明瘤胃微生物菌群的發(fā)酵速率提高。目前的研究表明，不同的飼養(yǎng)方式會改變瘤胃微生物的組成和推測的微生物功能，在全混合日糧的飼喂方式下的瘤胃微生物菌群模式可能會提高牦牛的高效代謝，進(jìn)而有效地促進(jìn)牦牛的生長。

4 結(jié) 論

與放牧相比，全混合日糧舍飼育肥提高了牦牛瘤胃VFA、MCP和NH3-N濃度，增加了關(guān)于非纖維物質(zhì)的降解菌以及半纖維降解菌屬的相關(guān)豐度，促進(jìn)牦牛的高效代謝，有助于牦牛的生長發(fā)育。