不同菌種有氧發(fā)酵對柑橘渣營養(yǎng)價值的影響

崔藝燕 王超普 鄧 盾 田志梅 魯慧杰 李家洲 余 苗 馬現(xiàn)永,2*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點(diǎn)實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實驗室，廣東畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評定工程技術(shù)研究中心，廣州510640；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心，茂名525000)

2020年中國柑橘產(chǎn)量為5 121.90萬t[1]，其中50%～60%作為新鮮水果消費(fèi)，40%～50%用于加工[2]。柑橘渣是柑橘產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品，約占加工產(chǎn)品的65%[3]，年產(chǎn)量為1 331萬～1 664萬t。目前，柑橘渣是一種未被充分利用的資源，產(chǎn)量較大的柑橘渣對環(huán)境造成了較大的壓力。在動物養(yǎng)殖中利用柑橘渣資源，可增加飼料原料來源、降低飼養(yǎng)成本以及食品生產(chǎn)對環(huán)境的影響，對我國飼料行業(yè)和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

柑橘渣含有豐富的纖維、果膠、多酚、黃酮、類胡蘿卜素等活性化合物，對動物健康具有很高的價值[4]。柑橘渣還含有動物生長所需的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等。研究顯示，青貯柑橘果肉不影響奶牛乳脂、乳蛋白、乳糖產(chǎn)量[5]。肉牛對柑橘渣的干物質(zhì)、有機(jī)物、中性洗滌纖維(NDF)消化率較高[6]，飼喂含柑橘渣飼糧的牛肉中總共軛亞油酸、n-3和n-6多不飽和脂肪酸的比例更高[7]。青貯柑橘渣不會影響山羊、豬的采食量和體重[8-9]，但能提高豬肉品質(zhì)[9]。上述研究結(jié)果表明柑橘渣是一種有價值的飼料原料。

固態(tài)發(fā)酵技術(shù)在提高產(chǎn)量、降低能耗和減少排放方面非常有效。固態(tài)發(fā)酵處理農(nóng)業(yè)、加工業(yè)廢棄物可生產(chǎn)具有額外營養(yǎng)或促進(jìn)健康的成分，微生物發(fā)酵能促進(jìn)功能成分從基質(zhì)中釋放，或?qū)U棄物中的化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化[10]。青貯柑橘渣的粗蛋白質(zhì)(CP)和粗脂肪(EE)含量隨青貯時間的增加而提高，檸檬苦素含量逐漸下降[11]。真菌發(fā)酵柑橘渣提高了CP含量[12-13]。芽孢桿菌、酵母、黑曲霉(Aspergillusniger)可以在木質(zhì)素和糖類化合物上進(jìn)行有氧生長。微生物有氧發(fā)酵的代謝比厭氧發(fā)酵更活躍。酵母、芽孢桿菌、黑曲霉是安全的微生物，能夠產(chǎn)生豐富的酶，有助于大分子底物的降解、成分轉(zhuǎn)化以及新化合物的合成，從而改善發(fā)酵后底物的營養(yǎng)和功能特性[14]。但是以往的研究均是通過青貯/厭氧發(fā)酵實現(xiàn)柑橘渣的保存，且對發(fā)酵柑橘渣的研究較少。因此，本研究擬采用不同菌種對柑橘渣進(jìn)行有氧發(fā)酵，檢測發(fā)酵產(chǎn)物的有機(jī)酸、總黃酮、營養(yǎng)成分含量，探討有氧發(fā)酵是否能提高柑橘渣的營養(yǎng)價值，以期為柑橘渣的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

柑橘渣購自重慶某食品有限公司，米糠為市售。

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)、黑曲霉由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液的制備

取0.1 mL地衣芽孢桿菌保存液于100 mL滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。取0.1 mL葡萄牙棒孢酵母保存液于100 mL滅菌馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h。用滅菌水調(diào)整上述菌液濃度為1.0×105CFU/mL，備用。將0.2 mL 1×108～2×108個/mL黑曲霉孢子液涂布到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的表面，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。用無菌水獲得黑曲霉孢子懸浮液(濃度為1×107個/mL)。

1.2.2 發(fā)酵基質(zhì)制備及發(fā)酵方案

將柑橘渣與米糠按8∶2(質(zhì)量比)混合均勻(自然狀態(tài))，含水量60%，每菌接種量為2%，按照表1的菌種組合添加菌種并攪拌均勻，自然pH，每個發(fā)酵瓶200 g發(fā)酵基質(zhì)，松散儲存，采用透氣膜封口進(jìn)行有氧發(fā)酵，室溫(28～30 ℃)發(fā)酵7 d。

表1 菌種組合及接種活菌數(shù)

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 pH的測定

將1 g新鮮樣品與9 mL超純水混勻，4 ℃靜置過夜，采用便攜式pH計(Testo 205)測定pH。

1.3.2 有機(jī)酸含量的測定

根據(jù)《GB 5009.157—2016 食品有機(jī)酸的測定》測定乳酸、蘋果酸、檸檬酸含量。根據(jù)文獻(xiàn)[15]測定乙酸、丙酸、丁酸含量。

1.3.3 常規(guī)營養(yǎng)成分含量的測定

CP含量采用凱氏定氮法通過全自動凱氏定氮儀(FOSS 8400)測定，EE含量采用索氏提取法通過全自動脂肪儀(FOSS)測定，粗纖維(CF)、NDF、酸性洗滌纖維(ADF)含量采用Van Soest等[16]方法通過纖維儀(Ankom 220)測定，粗灰分含量采用550 ℃灼燒法測定，鈣、磷含量分別采用乙二胺四乙酸滴定法和鉬酸銨分光光度法測定，碳水化合物為計算值，計算公式為：

碳水化合物(% DM)=100-CP(% DM)-
EE(% DM)-粗灰分(% DM)[17]。

1.3.4 總黃酮含量的測定

根據(jù)Wang等[18]的方法測定總黃酮含量。

1.3.5 水解氨基酸含量的測定

水解氨基酸含量的測定采用酸水解法，即0.2 g樣品加入10 mL 6 mol/L鹽酸，110 ℃水解24 h，經(jīng)定容過濾后，用氨基酸分析儀(Hitachi L8900)測定。參考FAO/WHO模式與雞蛋蛋白，計算必需氨基酸組成[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果表示為平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同菌種有氧發(fā)酵對柑橘渣pH和有機(jī)酸含量的影響

各發(fā)酵柑橘渣均具有濃郁陳皮味，T3、T5、T6、T7組酸香味較濃。由表2可知，各發(fā)酵柑橘渣的pH均在4.20以下，顯著低于CON組(P<0.05)。T3、T5、T6、T7組的檸檬酸、乳酸、總有機(jī)酸含量顯著高于CON、T1、T2、T4組(P<0.05)。T7組的檸檬酸含量顯著高于T3、T5、T6組(P<0.05)。T5組的乳酸含量顯著高于T3、T6、T7組(P<0.05)。與檸檬酸和乳酸含量相反，T3、T5、T6、T7組的蘋果酸含量顯著低于CON、T1、T2、T4組(P<0.05)，以T7組的蘋果酸含量最低。T2和T4組的乙酸含量顯著高于其他組(P<0.05)。T3和T7組的丙酸含量顯著高于CON、T1、T2、T4、T5組(P<0.05)。CON、T1、T2組未檢出丁酸。

表2 不同菌種有氧發(fā)酵對柑橘渣pH和有機(jī)酸含量的影響

2.2 不同菌種有氧發(fā)酵對柑橘渣總黃酮和常規(guī)營養(yǎng)成分含量的影響

由表3可知，與CON組相比，各發(fā)酵組的CP和總黃酮含量均顯著增加(P<0.05)，分別提高了9.81%～28.89%和180.00%～303.33%。此外，T3、T5、T6、T7組的CP和總黃酮含量顯著高于T1、T2、T4組(P<0.05)，以T7組的總黃酮含量最高。與CON組相比，T2、T3、T5、T6、T7組的EE含量均顯著增加(P<0.05)，以T7組的EE含量最高，CON組與T1、T4組的EE含量差異不顯著(P>0.05)。與CON、T1、T2、T4組相比，T3、T5、T6、T7組的CF、ADF、NDF、鈣含量顯著增加(P<0.05)，但碳水化合物含量顯著減少(P<0.05)。與CON組相比，T1、T2、T4組的CF、ADF、NDF、鈣含量差異不顯著(P>0.05)。T7組的磷含量顯著高于其他組(P<0.05)。T5、T6、T7組的粗灰分含量顯著高于T1和T2組(P<0.05)。

表3 不同菌種發(fā)酵對柑橘渣總黃酮和常規(guī)營養(yǎng)成分含量的影響

2.3 不同菌種有氧發(fā)酵對柑橘渣水解氨基酸含量的影響

由表4可知，與CON、T1、T2、T4組相比，T3、T5、T6、T7組的蘇氨酸、賴氨酸、組氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸含量和必需氨基酸/總氨基酸比值顯著增加(P<0.05)，但脯氨酸含量和非必需氨基酸/總氨基酸比值顯著降低(P<0.05)。T3、T5、T6、T7組的蘇氨酸、賴氨酸、組氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、必需氨基酸含量較CON組分別提高了35.29%、56.25%～68.75%、25.00%、26.31%～31.57%、17.39%～26.09%、 8.00%～12.00%、25.00%～33.33%、12.75%～26.85%。與T1、T2、T4組相比，T3、T6、T7組的亮氨酸、苯丙氨酸、總氨基酸含量顯著提高(P<0.05)。T7組的纈氨酸、異亮氨酸、精氨酸、必需氨基酸含量顯著高于其他發(fā)酵組(P<0.05)。T1～T6組的精氨酸含量顯著低于T7和CON組(P<0.05)，T7組的精氨酸含量與CON組差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同菌種有氧發(fā)酵對柑橘渣水解氨基酸含量的影響

續(xù)表4項目Items組別 GroupsCONT1T2T3T4T5T6T7SEMP值P-value脯氨酸 Proline4.5a 4.6a4.5a2.6b4.5a2.6b2.6b2.7b0.1<0.001絲氨酸 Serine1.9b2.0b2.0b2.4a1.9b2.5a2.4a2.4a0.1<0.001谷氨酸 Glutamate5.2b5.2b5.0b5.3ab5.1b5.1b5.2b5.5a0.10.004甘氨酸 Glycine2.3b2.2b2.2b2.7a2.3b2.8a2.8a2.9a0.1<0.001丙氨酸 Alanine2.5b2.4b2.4b2.7a2.5b2.7a2.8a2.8a0.10.037半胱氨酸 Cystine0.20.20.30.20.20.30.30.30.10.738天冬氨酸 Aspartic acid4.64.64.54.54.74.44.54.60.10.057酪氨酸 Tyrosine1.2b1.2b1.0b1.6a1.2b1.5a1.5a1.5a0.1<0.001必需氨基酸 EAA14.9c14.8c13.6c17.8b15.0bc16.8b17.4b18.9a0.3<0.001非必需氨基酸 NEAA22.422.321.722.022.421.722.222.60.30.269總氨基酸 TAA37.4b37.0b35.3c39.8a37.4b38.5b39.6a41.5a0.5<0.001必需氨基酸/總氨基酸EAA/TAA0.40b0.40b0.38b0.45a 0.40b0.44a 0.44a0.46a 0.01<0.001非必需氨基酸/總氨基酸 NEAA/TAA0.60a0.60a0.62a0.55b0.60a0.56b0.56b0.54b0.01<0.001必需氨基酸/非必需氨基酸EAA/NEAA0.73bc0.66c0.63d0.81ab0.67c0.77b0.79b0.84a 0.01<0.001

2.4 不同菌種發(fā)酵對柑橘渣必需氨基酸組成的影響

由表5可知，與CON、T1、T2、T4組相比，T3、T5、T6、T7組的賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、賴氨酸+苯丙氨酸、必需氨基酸比例顯著提高(P<0.05)。T3、T5、T6、T7組的賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、賴氨酸+苯丙氨酸比例高于或接近于雞蛋蛋白，且均高于FAO/WHO模式。T7組的纈氨酸和異亮氨酸比例顯著高于其他組(P<0.05)，且高于FAO/WHO模式。

表5 不同菌種有氧發(fā)酵對柑橘渣必需氨基酸組成的影響

3 討 論

3.1 不同菌種有氧發(fā)酵對柑橘渣pH和有機(jī)酸含量的影響

微生物通過在基質(zhì)中釋放有機(jī)酸來降解細(xì)胞壁[20]。本試驗中發(fā)酵柑橘渣中各種有機(jī)酸含量與以往研究相似[8,21]。酵母、芽孢桿菌、黑曲霉分泌的酶的協(xié)同作用將有助于酸化柑橘渣。本研究結(jié)果顯示，各發(fā)酵柑橘渣的pH均低于4.20。酵母、地衣芽孢桿菌、黑曲霉等微生物利用柑橘渣代謝合成檸檬酸、乳酸及其他有機(jī)酸[22]，使得柑橘渣pH降低。黑曲霉單獨(dú)或組合(T3、T5、T6、T7組)發(fā)酵柑橘渣較低的pH與其高含量的檸檬酸、乳酸、總有機(jī)酸是一致的。乳酸可由多種細(xì)菌、酵母和絲狀真菌產(chǎn)生[23-24]。微生物對碳水化合物、脂肪和氨基酸代謝產(chǎn)生的乳酸有利于改善發(fā)酵的香氣[25]，表現(xiàn)為發(fā)酵柑橘渣具有酸香氣味。另外，檸檬酸具有較強(qiáng)的酸香味，使得黑曲霉發(fā)酵的柑橘渣酸香味更濃郁。黑曲霉固態(tài)發(fā)酵橙皮最高能生產(chǎn)193 g/kg檸檬酸[26]。本試驗中，發(fā)酵柑橘渣中檸檬酸含量最高為22.19 g/kg，與以往研究有所不同，主要是由于上述研究目的在于生產(chǎn)檸檬酸，本研究目的在柑橘渣的飼料化利用。黑曲霉與其他菌種組合發(fā)酵柑橘渣的總有機(jī)酸含量顯著高于黑曲霉單獨(dú)發(fā)酵的柑橘渣，說明微生物的協(xié)同作用有利于有機(jī)酸的合成。本試驗中，黑曲霉單獨(dú)或組合發(fā)酵柑橘渣的蘋果酸含量均較發(fā)酵柑橘渣顯著降低，而其他發(fā)酵組蘋果酸含量與未發(fā)酵柑橘渣相似。這可能是黑曲霉利用了柑橘渣中的蘋果酸。黑曲霉單獨(dú)或組合發(fā)酵柑橘渣有機(jī)酸含量豐富，對于改善動物腸道健康、促進(jìn)動物生長有積極效果。

3.2 不同菌種有氧發(fā)酵對柑橘渣總黃酮和常規(guī)營養(yǎng)成分含量的影響

黃酮具有多種生物學(xué)功能，對動物健康有益。本研究中各發(fā)酵柑橘渣的總黃酮含量均顯著高于未發(fā)酵柑橘渣，說明微生物利用柑橘渣代謝合成了黃酮類物質(zhì)。地衣芽孢桿菌、絲狀真菌、酵母均在多酚和黃酮類化合物的生物合成中發(fā)揮著重要作用，能夠降解細(xì)胞壁和提高釋放酚類化合物[27-28]。釀酒酵母可產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶和阿魏酸酯酶以降解細(xì)胞壁[29]。葡萄牙棒孢酵母能夠合成和轉(zhuǎn)化橙皮素和橙皮苷[30]。芽孢桿菌屬細(xì)菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的裂解酶有助于降解細(xì)胞壁，釋放多酚和類黃酮[27]。黑曲霉具有較強(qiáng)的生物轉(zhuǎn)化能力，能產(chǎn)生多種化合物[31]，如黃酮、多酚[32]。三菌組合發(fā)酵發(fā)酵柑橘渣的總黃酮含量最高，這歸因于微生物的互作。在3種微生物的作用下，柑橘渣被轉(zhuǎn)化和利用的程度更高。

不同菌種發(fā)酵柑橘渣CP含量的提高來源于菌體蛋白和酶的增加。以往研究表明，真菌發(fā)酵提高了柑橘渣CP含量[12-13]。地衣芽孢桿菌分泌蛋白質(zhì)能力強(qiáng)(木聚糖酶、纖維素酶和淀粉酶)[33]，酵母菌體蛋白含量高[34]。黑曲霉單獨(dú)或組合發(fā)酵柑橘渣的CP含量顯著高于其他組，這是因為在有氧條件下，黑曲霉生長迅速，菌絲體豐富，菌體蛋白含量高于其他組合。菌體增加的同時，黑曲霉細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量也增加，這可能導(dǎo)致了發(fā)酵柑橘渣CF含量的增加。真菌細(xì)胞壁成分(β-葡聚糖、幾丁質(zhì)和殼聚糖)被歸類為促進(jìn)動物健康的膳食纖維[35]。發(fā)酵柑橘渣CF含量增加的部分是真菌膳食纖維，對動物健康有益。本試驗測得的柑橘渣和發(fā)酵柑橘渣的CF、ADF、NDF含量與Wang等[36]的研究結(jié)果一致，其報道柑橘渣的CF、ADF、NDF含量分別為15.69%、21.49%、23.37%。也有研究報道，青貯后柑橘渣的CF、ADF、NDF含量無顯著變化[11]。這與本研究結(jié)果不一致，主要是發(fā)酵方式(青貯與有氧發(fā)酵)和發(fā)酵菌種(不添加菌種與添加芽孢桿菌、酵母、黑曲霉)的不同引起的。

黑曲霉等絲狀真菌可以在固體基質(zhì)的顆粒間空間定植并分泌用于水解固體基質(zhì)的各種酶[37]。黑曲霉組合發(fā)酵柑橘渣的碳水化合物含量減少，說明微生物利用柑橘渣中碳水化合物作為能量來源，生成有機(jī)酸、氨基酸，合成蛋白質(zhì)、脂肪等，促進(jìn)微生物生長繁殖。本試驗中，黑曲霉單獨(dú)或組合發(fā)酵柑橘渣的CP、氨基酸、EE、有機(jī)酸含量均較未發(fā)酵柑橘渣有不同程度提高，該試驗結(jié)果與前人研究結(jié)果[11]一致。粗灰分被認(rèn)為是礦物質(zhì)食物的良好來源[38]。T5、T6、T7組粗灰分含量的增加與鈣含量增加一致。發(fā)酵柑橘渣中CP、CF、EE、粗灰分、鈣、磷含量的增加，可能是底物被消耗導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)含量的相對增加。

3.3 不同菌種有氧發(fā)酵對柑橘渣水解氨基酸含量和必需氨基酸組成的影響

氨基酸含量的增加提高了柑橘渣的營養(yǎng)價值。除色氨酸未測定外，發(fā)酵柑橘渣中測得17種水解氨基酸，其中蛋氨酸含量很低。分析測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌和葡萄牙棒孢酵母未能提高柑橘渣的氨基酸含量，黑曲霉單獨(dú)或組合發(fā)酵使柑橘渣中多種氨基酸及必需氨基酸含量增加，這與CP含量的增加是一致的，側(cè)面說明了黑曲霉單獨(dú)或組合發(fā)酵柑橘渣的真蛋白質(zhì)含量提高了，尤以三菌組合發(fā)酵效果最優(yōu)，這與發(fā)酵朱纓花[39]、發(fā)酵橄欖葉渣[40]的氨基酸含量與未發(fā)酵原料相比有不同程度的增加的結(jié)果相似。黑曲霉單獨(dú)或組合發(fā)酵柑橘渣的蘇氨酸、賴氨酸、組氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、必需氨基酸含量較未發(fā)酵柑橘渣分別提高了35.29%、56.25%～68.75%、25.00%、26.31%～31.57%、17.39%～26.09%、8.00%～12.00%、25.00%～33.33%、12.75%～26.85%，說明黑曲霉單獨(dú)或組合發(fā)酵改善了柑橘渣的氨基酸譜。

黑曲霉單獨(dú)或組合發(fā)酵柑橘渣后脯氨酸含量減少，主要是由于黑曲霉優(yōu)先利用脯氨酸。脯氨酸和丙氨酸是黑曲霉孢子發(fā)芽的強(qiáng)激活劑[41]。黑曲霉孢子萌發(fā)過程中利用了大量的脯氨酸，而產(chǎn)生的脯氨酸含量較低，這導(dǎo)致發(fā)酵柑橘渣中脯氨酸含量降低。黑曲霉能產(chǎn)生脯氨酰內(nèi)切蛋白酶，分解脯氨酸[42]。另外，丙氨酸的生產(chǎn)量大于利用量，使得含黑曲霉的發(fā)酵柑橘渣中丙氨酸含量較高。

本試驗中發(fā)酵或未發(fā)酵柑橘渣的必需氨基酸/總氨基酸比值(0.38～0.46)和必需氨基酸/非必需氨基酸比值(0.63～0.84)均接近或高于FAO/WHO理想蛋白質(zhì)(必需氨基酸/總氨基酸比值>0.4，必需氨基酸/非必需氨基酸比值>0.6)[19]。必需氨基酸比例高于或接近雞蛋蛋白和FAO/WHO模式。柑橘渣和發(fā)酵柑橘渣的必需氨基酸組成較為均衡，黑曲霉單獨(dú)或組合發(fā)酵柑橘渣的必需氨基酸組成比未發(fā)酵柑橘渣更優(yōu)，三菌組合發(fā)酵柑橘渣效果最優(yōu)。

3.4 黑曲霉和多菌種發(fā)酵效果

柑橘渣含豐富的D-檸檬烯，D-檸檬烯對微生物表現(xiàn)出很高的抗菌活性[43]。Zema等[2]發(fā)現(xiàn)，從柑橘渣中篩選的酵母對D-檸檬烯具有天然抗性。本試驗中的黑曲霉來源于陳皮，也許對D-檸檬烯具有抗性，使得黑曲霉能充分利用柑橘渣中的成分，改善柑橘渣的營養(yǎng)價值。Velázquez等[31]報道，黑曲霉在補(bǔ)充有檸檬烯和檸檬精油的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出最高的耐受性和生長速度。黑曲霉是絲狀真菌，菌絲能夠遍布基質(zhì)表面，代謝活性高，能在各種基質(zhì)中良好生長，生長速度優(yōu)于單細(xì)胞生物(地衣芽孢桿菌和葡萄牙棒孢酵母)。在發(fā)酵飼料方面，地衣芽孢桿菌和酵母主要與其他微生物配合使用，而黑曲霉單獨(dú)使用也能獲得較好效果。黑曲霉是一種比釀酒酵母更有效的蛋白質(zhì)分泌者，能大量分泌酸性蛋白酶、木聚糖酶、纖維素酶等[44]。酸性蛋白酶能在發(fā)酵后期低pH環(huán)境中發(fā)揮作用，木聚糖酶和纖維素酶則能夠分解植物組織細(xì)胞之間的物質(zhì)[44-45]。黑曲霉能夠耐受低至1.5的pH[46]，在低pH環(huán)境下生長仍能充分轉(zhuǎn)化代謝柑橘渣的成分。而葡萄牙棒孢酵母與地衣芽孢桿菌在發(fā)酵后期的低pH環(huán)境下生長受到抑制，代謝減弱。因此，含有黑曲霉的發(fā)酵柑橘渣營養(yǎng)價值優(yōu)于不含黑曲霉的發(fā)酵柑橘渣。

本研究結(jié)果顯示，多菌種發(fā)酵改善了柑橘渣的營養(yǎng)價值。這可能是由于菌種在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝物之間存在相互作用，另外，發(fā)酵過程中新微生物群的相互作用和協(xié)同作用也可影響活性物質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)的生成。黑曲霉分泌多種酶，增加柑橘渣有機(jī)物的水解，可以釋放出地衣芽孢桿菌和酵母可利用的底物，菌種間協(xié)同作用改善了柑橘渣的營養(yǎng)價值。微生物之間的相互作用影響微生物群落成員的生長、代謝和分化[47]，這些相互作用可能通過信號分子、生理化學(xué)環(huán)境的調(diào)節(jié)、趨化性、協(xié)同代謝、蛋白質(zhì)分泌甚至基因轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)[48]。外源微生物的接種會給柑橘渣微生物群落帶來變化，具體機(jī)制需要深入研究微生物的相互作用以及菌群變化進(jìn)行探討。

4 結(jié) 論

本試驗條件下，黑曲霉、地衣芽孢桿菌+黑曲霉、葡萄牙棒孢酵母+黑曲霉、地衣芽孢桿菌+葡萄牙棒孢酵母+黑曲霉有氧發(fā)酵均能夠改善柑橘渣的常規(guī)營養(yǎng)成分、總黃酮、有機(jī)酸含量和必需氨基酸組成，提高其營養(yǎng)價值，且地衣芽孢桿菌+葡萄牙棒孢酵母+黑曲霉組合提高作用更明顯，效果更優(yōu)。