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    桑葉多糖對(duì)免疫抑制小鼠腸道損傷和微生物多樣性的調(diào)節(jié)作用

    2022-03-30 13:51:18陳曉蘭宣嘉穎冒玉娟徐向萍楊海峰
    關(guān)鍵詞:免疫抑制屏障結(jié)腸

    陳曉蘭 宣嘉穎 王 婧 冒玉娟 徐向萍 楊海峰

    (江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,泰州225300)

    在畜禽養(yǎng)殖中,非洲豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒病、禽流感等諸多免疫抑制性疾病對(duì)動(dòng)物健康造成了巨大的影響。這些免疫抑制性病毒不僅侵襲動(dòng)物的免疫器官,而且對(duì)動(dòng)物的腸道、呼吸道均造成一定程度的損害。腸道作為機(jī)體最大的黏膜屏障,在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用[1]。因此,提高腸道黏膜屏障和免疫功能,尤其是調(diào)節(jié)免疫抑制狀態(tài)下腸道健康,對(duì)于免疫抑制性疾病的防控具有重要意義。動(dòng)物和人類胃腸道黏膜表面居住著數(shù)萬億共生微生物,其對(duì)宿主健康有著深遠(yuǎn)的影響[2]。腸道菌群生態(tài)系統(tǒng)可增強(qiáng)宿主防御機(jī)制,如增強(qiáng)黏膜屏障功能,參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育與調(diào)節(jié)[3]。由內(nèi)源性或環(huán)境等因素引起的腸道微生物群落紊亂會(huì)對(duì)局部和系統(tǒng)免疫造成影響,進(jìn)而引發(fā)各種疾病。迄今為止,許多植物多糖,如香菇多糖[4]和紫甘薯多糖[5]已被證明可以調(diào)節(jié)腸道免疫和腸道微生物群落的組成。

    桑葉為常用的中草藥之一,富含多糖、黃酮、生物堿等活性物質(zhì),具有抗糖尿病、抗炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力以及抗氧化等多種藥理作用[6]。研究表明,桑葉多糖(mulberry leaf polysaccharide,MLP)可有效調(diào)節(jié)免疫新城疫疫苗雛雞體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[7],隨后發(fā)現(xiàn)MLP可顯著增強(qiáng)雞呼吸道黏膜免疫應(yīng)答[8]。MLP是否調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫、影響腸道微生物群落組成有待進(jìn)一步研究。鑒于此,本研究采用腹腔注射環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)作為建模手段,評(píng)價(jià)在免疫抑制狀態(tài)下MLP對(duì)小鼠腸道損傷的修復(fù)功能和腸道微生物菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用。

    1 材料與方法

    1.1 藥物與主要試劑

    左旋咪唑(levamisole,LM)和CTX購自美國Sigma公司,MLP(純度95%)為本實(shí)驗(yàn)室制備[8]。

    組織固定液、DNA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,RNAiso Plus(Code No. 9109)、TB Green Premix Ex TaqTMⅠ(Code No. RR820A)和PrimeScript RT Master Mix(Code No. 0360A)購自日本TaKaRa公司,MiSeq Reagent Kit v3購自美國Illumina公司,Agencourt AM Pure XP PCR Purification Beads購自美國Beckman Coulter公司,無水乙醇、氯仿和異丙醇等其他所有分析純?cè)噭┵徸試幖瘓F(tuán)上?;瘜W(xué)試劑有限公司。

    1.2 試驗(yàn)儀器

    試驗(yàn)儀器包括高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、PCR儀(德國Eppendorf公司)、熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、制冰機(jī)(日本SANYO公司)、移液器(10、100、200、1 000 μL)(德國Eppendorf公司)、超凈工作臺(tái)(江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司)、NanoDrop 2000(美國Thermo Fisher Scientifi公司)、Invitrogen Qubit3.0 Spectrophotometer(美國Thermo Fisher Scientific公司)、Agilent 2100 Bioanalyzer(美國Agilent Technologies公司)、Illumina MiSeq Benchtop Sequencer(美國Illumina公司)、ABI 2720 Thermal Cycler(美國Thermo Fisher Scientific公司)、Eppendorf 5810R Centrifuge(德國Eppendorf公司)、NanoDropTMOne/OneC微量紫外-可見光分光光度計(jì)(上海凌儀生物科技有限公司)。

    1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

    雄性BALB/c小鼠,購自南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖中心,5周齡,體重(20.0±0.5) g,共計(jì)60只,飼養(yǎng)于12 h明/12 h暗的屏障環(huán)境中,自由采食和飲水。嚴(yán)格依據(jù)江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定的要求進(jìn)行飼養(yǎng)管理和動(dòng)物試驗(yàn)。

    1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    小鼠適應(yīng)7 d后將其隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、環(huán)磷酰胺模型組(MC組)、桑葉多糖低劑量組(MLPL組)、桑葉多糖中劑量組(MLPM組)、桑葉多糖高劑量組(MLPH組)和藥物對(duì)照組(LM組),每組10只小鼠。各組小鼠腹腔注射80 mg/kg BW CTX(除NC組外),每天1次,連續(xù)3 d,以誘導(dǎo)免疫抑制。第4天開始MLPL、MLPM、MLPH和LM組小鼠每天分別灌胃20、40、80 mg/kg BW的MLP和40 mg/kg BW的LM,連續(xù)給藥9 d;NC和MC組小鼠每天灌胃等量飲用水。在試驗(yàn)過程中,每3 d稱量體重1次,并于停藥后(第13天)采用乙醚麻醉小鼠,實(shí)施頸椎脫臼法處死,進(jìn)行樣品采集。

    1.5 指標(biāo)測(cè)定

    1.5.1 增重

    分別于注射CTX前以及注射CTX后第4、7、10、13天對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱重,計(jì)算各組小鼠增重。

    1.5.2 小鼠空腸組織形態(tài)學(xué)

    小心剪取各組小鼠(每組3只)約5 cm長的空腸,用磷酸鹽緩沖液(PBS)稍作清洗后,10%中性甲醛溶液固定48 h,用鑷子去除空腸表面殘留的脂肪,剪取1 cm腸段浸泡于乙醇-福爾馬林(AF)固定液約30 min,經(jīng)不同濃度乙醇溶液脫水后,開始浸蠟和組織包埋。制成4 μm厚度的切片,再經(jīng)烤片、脫蠟后過不同濃度乙醇溶液,后用超純水浸泡后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色,再經(jīng)過脫水封片后,使用倒置光學(xué)顯微鏡在100倍視野下觀察空腸組織病理學(xué)變化。

    1.5.3 小鼠結(jié)腸黏膜屏障蛋白和免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)

    取各組小鼠(每組3只)結(jié)腸組織樣本,采用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)法分別對(duì)上皮細(xì)胞緊密連接蛋白[閉合蛋白(Occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)、封閉蛋白-5(Claudin-5)]、黏液素2(MUC2)、免疫相關(guān)因子[腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)]和免疫信號(hào)通路相關(guān)蛋白[Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、髓樣分化因子88(myeloid differentiation protein 88,MyD88)、核因子-κB p65亞基(p65)]的mRNA表達(dá)進(jìn)行測(cè)定,使用StepOnePlus Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。

    1.5.3.1 RNA的提取及濃度和純度測(cè)定

    稱取20~50 mg結(jié)腸樣品,充分剪碎,加入液氮和氧化鋯研磨珠,充分勻漿至無明顯組織塊。然后參照RNAiso Plus操作說明提取總RNA,用NanoDrop 2000檢測(cè)其濃度和純度,符合要求后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5.3.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

    使用反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScript RT Master Mix將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,作為RT-qPCR模板,配制體系和反應(yīng)條件參照試劑盒說明書。

    1.5.3.3 RT-qPCR擴(kuò)增

    以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因,測(cè)定靶基因的相對(duì)表達(dá)量,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,用于小鼠基因轉(zhuǎn)錄分析的基因特異性引物序列見表1。使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè),配制體系參照說明書進(jìn)行。加樣結(jié)束后離心排除氣泡,再放置到熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后,采用2-△△Ct法計(jì)算靶基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

    表1 用于小鼠基因轉(zhuǎn)錄分析的基因特異性引物序列

    續(xù)表1基因Genes登錄號(hào)Accession number引物序列Primer sequences (5'—3')產(chǎn)物大小Product size/bpToll樣受體4TLR4NM_021297.3F: GCTCTCAGCCATCCACAAAGR: GAGTCGGGAAGAGGAAGAGG68髓樣分化因子88MyD88NM_010851.3F: TTTCCCAGTATCCTGCGGTTR: GCGGAAGAACACAGACAGAC151閉合蛋白OccludinU49185.1F: AGCACTTAACCTGCCTGGATR: AGCCTGTGGAAGCAAGAGAT191封閉蛋白-5Claudin-5NM_013805.4F: TTCTTCTATGCGCAGTTGGCR: TTGGTGCCTACTTCACCGAT68黏液素2MUC2JN961199.1F: GCTCTCAAATGGTGCAGAGGR: AGTGGGAAGGGATGAATGGG105鎖小帶蛋白-1ZO-1XM_036152895.1F: ACTCCCACTTCCCCAAAAACR: CCACAGCTGAAGGACTCACA166核因子-κB p65亞基p65NM_001365067F: GGATTCCGGGCAGTGACGR: CACGGCGCGCTAAAGTAAAG81

    1.5.4 盲腸微生物群落

    采用微生物擴(kuò)增子測(cè)序法測(cè)定盲腸微生物群落。將采集的盲腸內(nèi)容物解凍后,用DNA試劑盒提取基因組DNA,之后檢測(cè)擴(kuò)增樣本目的區(qū)域(V4~V5區(qū)域),陽性對(duì)照選擇標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌基因組DNA Mix。盲腸內(nèi)容物樣本的測(cè)序和生物信息學(xué)研究在上海天昊生物科技有限公司測(cè)定。采用R軟件包(V3.4.0,https://www.r-project.org/)根據(jù)操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)的豐度進(jìn)行不同物種篩選,比較MLP對(duì)免疫抑制小鼠盲腸微生物多樣性的影響。

    1.6 統(tǒng)計(jì)分析

    數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示,P<0.05為差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 MLP對(duì)免疫抑制小鼠體重的影響

    如表2所示,小鼠注射CTX后第4天,與NC組相比,其他各組小鼠體重顯著下降(P<0.05),呈負(fù)增長。隨后開始給藥,各組增重呈逐漸恢復(fù)趨勢(shì)。小鼠注射CTX后第7天,與MC組相比,MLPL、MLPM、MLPH和LM組增重均增加,其中MLPM組增重顯著高于MC組(P<0.05),但MLPL、MLPM、MLPH和LM組之間增重?zé)o顯著差異(P>0.05)。小鼠注射CTX后第10天,MC組增重顯著低于其他各組(P<0.05)。小鼠注射CTX后第13天,MC組增重顯著低于MLPL、MLPH和LM組(P<0.05)。

    表2 各組小鼠增重的變化

    2.2 MLP對(duì)空腸組織病理學(xué)變化的影響

    腸黏膜是食品污染物、化學(xué)物質(zhì)和病原體與機(jī)體接觸的第1道屏障,在調(diào)節(jié)免疫對(duì)應(yīng)激源的反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[12]。病理結(jié)果顯示,小鼠注射CTX后加重了小鼠空腸絨毛萎縮和屏障損傷,與MC組比較,MLPL、MLPM和MLPH組小鼠空腸病理損傷明顯減輕(圖1)。以上結(jié)果表明,MLP可以通過改善CTX致免疫抑制小鼠的腸黏膜屏障,緩解腸黏膜損傷,有助于腸黏膜免疫應(yīng)答的恢復(fù)。

    NC:正常對(duì)照組 NC group;MC:環(huán)磷酰胺模型組 MC group;MLPL:桑葉多糖低劑量組 MLPL group;MLPM:桑葉多糖中劑量組 MLPM group;MLPH:桑葉多糖高劑量組 MLPH group;LM:藥物對(duì)照組 LM group。下圖同 the same as below。

    2.3 MLP對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白和MUC2 mRNA表達(dá)的影響

    如表3所示,與NC組相比,MC組Claudin-5、ZO-1、Occludin、MUC2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與MC組相比,MLPM、MLPH和LM組Claudin-5、MUC2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05),MLPM和MLPH組Occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05),MLPH組ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。其中,MLPH組Claudin-5、Occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于LM組(P<0.05),Occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于NC組(P<0.05)。以上結(jié)果表明,MLP可以通過上調(diào)緊密連接蛋白和MUC2的mRNA表達(dá),調(diào)節(jié)CTX致免疫抑制小鼠的腸道黏膜損傷。

    表3 MLP對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白和MUC2 mRNA表達(dá)的影響

    2.4 MLP對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-βmRNA表達(dá)的影響

    如表4所示,與NC組相比,MC組TNF-α、IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05),IL-10、TGF-β的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。與MC組相比,MLPM、MLPH和LM組TNF-α、IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05),MLPL、MLPM、MLPH和LM組IL-10和TGF-β的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。其中,MLPH組TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β的mRNA相對(duì)表達(dá)量與NC組差異不顯著(P>0.05)。以上結(jié)果表明,MLP可以通過上調(diào)促炎因子TNF-α、IL-1β和下調(diào)抗炎因子IL-10、TGF-β的mRNA表達(dá),調(diào)節(jié)CTX致免疫抑制小鼠的結(jié)腸免疫應(yīng)答。

    表4 MLP對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β mRNA表達(dá)的影響

    2.5 MLP對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞TLR4、MyD88、p65 mRNA表達(dá)的影響

    如表5所示,與NC組相比,MC組TLR4、MyD88、p65的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與MC組相比,MLPM、MLPH和LM組TLR4、MyD88、p65的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05),MLPL組MyD88的mRNA相對(duì)表達(dá)量也顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明,MLP可能通過上調(diào)TLR4的mRNA表達(dá),啟動(dòng)MyD88、p65信號(hào)通路,從而轉(zhuǎn)錄相關(guān)免疫細(xì)胞因子來介導(dǎo)免疫應(yīng)答,拮抗CTX誘導(dǎo)的免疫抑制。

    表5 MLP對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞TLR4、MyD88、p65 mRNA表達(dá)的影響

    2.6 MLP對(duì)盲腸微生物多樣性的影響

    如圖2所示,在門水平上,盲腸內(nèi)容物中的微生物群落主要包括擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。如圖3所示,與NC組相比,MC組擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05);與MC組相比,NLPH組擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)。與NC組相比,MC組免疫抑制相關(guān)菌如丁酸弧菌屬(Butyricimonas)和真桿菌屬(Eubacterium)的相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05),而MLPL、MLPM、MLPH和LM組丁酸弧菌屬和真桿菌屬的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。以上結(jié)果表明,MLP可有效調(diào)節(jié)CTX誘導(dǎo)的腸道微生物群落紊亂,恢復(fù)腸道微生物穩(wěn)態(tài)。

    Bacteroidetes:擬桿菌門;Firmicutes:厚壁菌門;Actinobacteria:放線菌門;Proteobacteria:變形菌門;Deferribacteres:脫鐵桿菌門;Candidatus_Saccharibacteria:暫定螺旋體門;Unassigned:未定菌;Verrucomicrobia:疣微菌門;Chloroflexi:綠彎菌門;Tenericutes:軟壁菌門;Acidpbacteria:酸桿菌門;Planctomycetes:浮霉菌門;Elusimicrobia:迷蹤菌門;Thaumarchaeota:奇古菌門;Nitrospirae:硝化螺旋菌門;Latescibacteria:黏膠球形菌門。

    *表示差異顯著(P<0.05)。

    3 討 論

    CTX是一種強(qiáng)效免疫抑制劑,已被證明可抑制動(dòng)物生長發(fā)育,破壞腸道黏膜屏障和免疫系統(tǒng),引起腸道微生物菌群紊亂[9]。本研究結(jié)果顯示,小鼠腹腔注射80 mg/kg BW的CTX,可產(chǎn)生明顯的體重減輕,空腸黏膜受損,結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白和MUC2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降,結(jié)腸上皮細(xì)胞TLR4和信號(hào)通路蛋白MyD88、p65的mRNA相對(duì)表達(dá)量也顯著下降,導(dǎo)致盲腸微生物菌群嚴(yán)重紊亂,表明采用CTX構(gòu)建小鼠腸道黏膜損傷模型是成功的。Shi等[10]報(bào)道,4周齡雄性BALB/c小鼠腹腔注射50 mg/kg BW的CTX,每天1次,連續(xù)注射2 d,亦能導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化和小腸組織損傷;廖呂燕等[11]報(bào)道,給雄性昆明小鼠腹腔注射100 mg/kg BW的CTX,導(dǎo)致盲腸菌群紊亂。由此可見,采用CTX構(gòu)建小鼠免疫抑制狀態(tài)下腸道損傷和菌群紊亂模型,CTX使用劑量與小鼠日齡、品種相關(guān),同時(shí)需結(jié)合建模目的確定給藥劑量。

    腸絨毛增加了小腸的表面積,從而使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)吸收更為充分[12]。同時(shí),緊密連接蛋白能維持腸道上皮細(xì)胞之間的完整性,參與腸上皮細(xì)胞之間信息傳遞和交換[13]。MUC2作為腸道杯狀細(xì)胞分泌的一種高度糖基化黏蛋白,在阻止致病菌的入侵、協(xié)助腸道益生菌的定植上發(fā)揮重要作用[14]。本研究顯示,小鼠腹腔注射CTX后,空腸絨毛萎縮,結(jié)腸緊密連接蛋白Occludin、ZO-1和Claudin-5以及MUC2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降,腸道黏膜結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞,而小鼠體重下降,呈現(xiàn)負(fù)增長的主要原因可能是腸道黏膜結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)吸收不良引起。小鼠連續(xù)灌胃MLP后,空腸絨毛生長逐漸恢復(fù),結(jié)腸緊密連接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5和MUC2的mRNA相對(duì)表達(dá)量也逐步提升,小鼠體重不斷增加,在給藥結(jié)束時(shí),基本恢復(fù)到正常水平,尤其緊密連接蛋白Occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)量已經(jīng)與正常水平相當(dāng),說明MLP對(duì)CTX致免疫抑制小鼠腸道黏膜屏障損傷具有較好的修復(fù)作用,在維持腸道黏膜上皮屏障穩(wěn)定性上具有明顯優(yōu)勢(shì)。植物多糖對(duì)腸道黏膜上皮屏障的調(diào)節(jié)作用也有諸多類似研究報(bào)道,如火麻仁多糖能顯著降低空腸隱窩深度,增加空腸絨毛長度和絨腺比,通過上調(diào)腸道緊密連接蛋白的表達(dá)從而保護(hù)腸道屏障結(jié)構(gòu)的完整性[15]。

    TNF-α、IL-1β為腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子,在先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[16]。本研究顯示,MLP可促進(jìn)結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β表達(dá),拮抗CTX致小鼠結(jié)腸免疫細(xì)胞因子的抑制狀態(tài),增強(qiáng)小鼠的腸道非特異性免疫功能。Ma等[17]研究了灰樹花多糖免疫活性,得出一定濃度灰樹花多糖提高了CTX介導(dǎo)免疫低下小鼠脾細(xì)胞中TNF-α、IL-1β含量。板黨多糖、沙棘多糖等治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制皆與調(diào)節(jié)一些炎性因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)密切相關(guān)[18-19]。IL-10和TGF-β作為抗炎因子是免疫應(yīng)答中重要的負(fù)性調(diào)節(jié)分子[20]。研究顯示,缺乏IL-10的小鼠T細(xì)胞功能明顯恢復(fù)[21],TGF-β含量的下降有利于淋巴細(xì)胞的激活[22]。本研究中,在免疫抑制條件下,MLP可顯著下調(diào)結(jié)腸組織中抗炎細(xì)胞因子IL-10、TGF-β的表達(dá),這將有利于機(jī)體免疫細(xì)胞細(xì)胞的激活,從而拮抗免疫抑制。綜上可知,中藥多糖可通過調(diào)節(jié)炎癥因子TNF-α、IL-1β和抗炎因子IL-10、TGF-β表達(dá),在促進(jìn)腸道免疫損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。

    TLR4是免疫細(xì)胞表面重要的非特異性免疫受體之一[23],在多種免疫細(xì)胞表面均有表達(dá)[24]。一旦TLR4與相應(yīng)的配體結(jié)合后,則會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)系列信號(hào)通路,對(duì)天然免疫和特異性免疫進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn),口服粗根蕁麻多糖可使CTX致免疫抑制小鼠腸道TLR4蛋白表達(dá)量升高至接近正常水平[25]。本研究中,CTX誘導(dǎo)機(jī)體免疫抑制后,結(jié)腸組織TLR4的表達(dá)被抑制,此時(shí)若是有外來病原微生物的侵襲,則TLR4識(shí)別異物的能力下降,則增加了疾病爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。使用MLP灌胃給藥后,MLPL、MLPM和MLPH組結(jié)腸組織TLR4的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上升,甚至MLPH組TLR4的mRNA相對(duì)表達(dá)量能恢復(fù)至健康水平,這與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致,提示MLP能顯著拮抗CTX誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)抑制。

    MyD88是一種胞質(zhì)可溶性蛋白,是Toll 樣受體(TLR)信號(hào)通路中非常重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,通過調(diào)控炎癥因子的表達(dá)影響免疫應(yīng)答[26]。p65是核因子-κB(NF-κB)家族中的功能活性亞基,這些通路蛋白和亞基可參與多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié),發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[27]。本研究顯示,在免疫抑制狀態(tài)下,小鼠結(jié)腸組織MyD88和p65表達(dá)被抑制,而小鼠灌胃MLP后,兩者的表達(dá)均顯著上調(diào),尤其是MLPH組顯示出顯著的上調(diào)作用,甚至高于NC組。由此可見,在免疫抑制狀態(tài)下,MLP對(duì)腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)機(jī)制可能是激活TLR4,啟動(dòng)MyD88依賴的NF-κB通路,從而啟動(dòng)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β等表達(dá)介導(dǎo)免疫應(yīng)答。研究顯示,大麻籽多糖通過核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1,Keap1)信號(hào)通路保護(hù)CTX誘導(dǎo)的小鼠腸道氧化損傷[28];人工冬蟲夏草多糖可減輕CTX誘導(dǎo)的腸屏障損傷,這種損傷可能與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑有關(guān)[29]。由此可見,不同中藥多糖對(duì)腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)機(jī)制存在多種方式,可能與中藥多糖的組成相關(guān),有待進(jìn)一步深入探討。

    多糖可以通過抑制某些潛在病原體或促進(jìn)有益微生物來改變腸道微生物群落組成,以維持機(jī)體健康[30],如紫甘薯多糖可以降低產(chǎn)堿桿菌屬和薩特氏菌屬的相對(duì)豐度,增加毛螺菌屬和顫螺旋菌屬的相對(duì)豐度,從而調(diào)節(jié)小鼠腸道細(xì)菌的種類和數(shù)量[31]。本研究中,MLP改變了CTX致免疫抑制小鼠腸道微生物群落的組成,通過上調(diào)益生菌擬桿菌門的相對(duì)豐度,降低有害菌丁酸弧菌屬和真桿菌屬的相對(duì)豐度,調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)紊亂,進(jìn)而改善腸道生物屏障功能。羅青等[32]報(bào)道,枸杞粉及多糖可通過降低厭氧菌的相對(duì)豐度、增加有益菌的相對(duì)豐度調(diào)節(jié)CTX致免疫低下小鼠腸道菌群紊亂。這與本研究結(jié)果有一定的相似性,說明中藥多糖能夠調(diào)節(jié)腸道菌群的比例,在促進(jìn)腸道菌群平衡中具有顯著作用。

    4 結(jié) 論

    綜上所述,小鼠誘導(dǎo)免疫抑制模型后口服MLP,可從以下方面拮抗免疫抑制:通過恢復(fù)體重、緩解和修復(fù)腸道黏膜損傷增強(qiáng)腸道上皮屏障防御能力;通過調(diào)節(jié)腸道TLR4表達(dá),激活p65、MyD88信號(hào)通路,促進(jìn)免疫細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的釋放,從而增強(qiáng)腸道黏膜免疫功能;還能調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝紊亂,使有益菌數(shù)量增加,控制有害菌數(shù)量,平衡腸道微生物。

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