血清miR-223、miR-148a聯(lián)合檢測(cè)用于骨肉瘤臨床診斷及預(yù)后評(píng)估價(jià)值分析

謝曉飛 高藝博 邵 哲

1 河南省鄭州市骨科醫(yī)院 450000； 2 周口市中醫(yī)院外科

骨肉瘤為惡化程度較高的骨腫瘤，早期轉(zhuǎn)移是該病的主要特點(diǎn)之一，約50%的患者在開始確診時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[1]。骨肉瘤早期無明顯癥狀，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移后會(huì)導(dǎo)致特異性癥狀出現(xiàn)，故而提高該疾病的早期診斷準(zhǔn)確率極為重要。微小核糖核酸-148a(microRNA-148a，miR-148a)、微小核糖核酸-223(microRNA-223，miR-223)已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，且有研究指出，骨肉瘤患者存在miR-223表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象[2]，但尚不知其與miR-148a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)骨肉瘤的診斷價(jià)值。故本文中分析了骨肉瘤血清miR-223、miR-148a水平變化，旨在聯(lián)合檢測(cè)用于骨肉瘤臨床診斷及預(yù)后評(píng)估價(jià)值，為骨肉瘤的診治提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以2015年4月—2016年3月78例骨肉瘤患者作為研究組，并以50例健康體檢者作為對(duì)照組。研究組中男40例，女38例；年齡10～37歲，平均年齡(17.31±3.65)歲；TNM分期：T1期15例、T2期23例、T3期27例、T4期13例；分化程度：低分化14例、中分化22例、高分化42例；腫瘤部位：股骨遠(yuǎn)端40例、脛骨近端26例、肱骨近端5例、腓骨近端7例。對(duì)照組中男27例，女23例；年齡9～35歲，平均年齡(16.97±3.72)歲。兩組性別、年齡對(duì)比無明顯差異(P>0.05)。

1.2 研究組選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)： ①根據(jù)《骨肉瘤診斷、治療、隨訪的ESMO臨床指南》[3]診斷為骨肉瘤，并經(jīng)術(shù)中病理學(xué)確診；②患者均知情本研究的研究目的，且已簽署同意書；③符合骨肉瘤根治術(shù)指征并完成手術(shù)者；④檢查前未經(jīng)放化療及手術(shù)治療者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)： ①自身免疫性疾病患者；②其他原發(fā)性惡性腫瘤患者；③嚴(yán)重骨質(zhì)增生及骨關(guān)節(jié)炎患者；④凝血功能異常者；⑤臨床及隨訪資料不完整者；⑥中途退出研究者。

1.3 方法

1.3.1 治療方法：骨肉瘤患者行骨肉瘤根治術(shù)及術(shù)后化療治療。化療方案均為順鉑+異環(huán)磷酰胺+阿奇霉素治療。

1.3.2 血清miR-223、miR-148a表達(dá)水平測(cè)定：(1)血清總RNA提取：所有患者于入院后1d采集空腹肘靜脈血4ml，高速離心，提取上清液，置于-80℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。將備用血清放置?℃下解凍，然后取250μl血清+750μl Trizol室溫下靜置4～6min，再加入200μl氯仿，震蕩混勻30s，使水相和有機(jī)相充分接觸。在4℃下以12 000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，將上層水相移至無RNA酶的EP管中。加入等體積異丙醇，充分混勻后靜置10～12min，以14 000r/min轉(zhuǎn)速離心 10min后，取沉淀物，用75%的乙醇洗滌沉淀物2～3次，根據(jù)沉淀量加入適量無RNA酶水溶解，置于-80℃下保存?zhèn)溆?。?yīng)用美國(guó)Invitro-gen公司的RNA提取試劑Trizol，采用Trizol法抽取RNA。(2)PCR反應(yīng)：取10μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目得條帶，同時(shí)以U6為內(nèi)部對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃退火31s，72℃延伸31s，45個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，取平均值為最終結(jié)果，相對(duì)表達(dá)量：ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

表1 引物序列

1.3.3 隨訪：所有患者隨訪2～60個(gè)月，記錄患者生存時(shí)間。

1.4 觀察指標(biāo) (1)比較研究組及對(duì)照組的miR-223、miR-148a表達(dá)水平，并分析miR-223、miR-148a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)骨肉瘤的診斷價(jià)值及與臨床病理的關(guān)系。(2)比較生存組及死亡組的miR-223、miR-148a表達(dá)水平，分析miR-223、miR-148a對(duì)骨肉瘤患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值及與預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 研究組及對(duì)照組的miR-223、miR-148a表達(dá)水平比較 研究組miR-223表達(dá)水平低于對(duì)照組，miR-148a表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

表2 研究組及對(duì)照組的miR-223、miR-148a表達(dá)水平比較

2.2 miR-223、miR-148a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)骨肉瘤的診斷價(jià)值分析 miR-223、miR-148a表達(dá)水平檢測(cè)診斷骨肉瘤的AUC高于0.75，見表3、圖1。

表3 miR-223、miR-148a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)骨肉瘤的診斷價(jià)值分析

圖1 miR-223、miR-148a聯(lián)合檢測(cè)診斷骨肉瘤的ROC曲線分析

2.3 miR-223、miR-148a表達(dá)水平與臨床病理的關(guān)系 根據(jù)2.2分析結(jié)果將miR-223表達(dá)水平≥2.46定義為miR-223高表達(dá)，將miR-148a≥1.07定義為miR-148a高表達(dá)。miR-223低表達(dá)組在TNM分期T3～T4期、分化程度為高分化、已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面的人數(shù)比例高于miR-223高表達(dá)組(P<0.05)，miR-148a高表達(dá)組在TNM分期T3～T4期、腫瘤直徑≥5cm、已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面的人數(shù)比例高于miR-148a低表達(dá)組(P<0.05)，見表4。

表4 miR-223、miR-148a表達(dá)水平與臨床病理的關(guān)系

2.4 生存組及死亡組的miR-223、miR-148a表達(dá)水平比較 死亡組miR-223表達(dá)水平低于生存組，miR-148a表達(dá)水平高于生存組(P<0.05)，見表5。

表5 生存組及死亡組的miR-223、miR-148a表達(dá)水平比較

2.5 miR-223、miR-148a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)預(yù)后的評(píng)估價(jià)值分析 聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估患者預(yù)后的AUC大于miR-223單獨(dú)檢測(cè)(P<0.05)，見表6、圖2。

圖2 miR-223、miR-148a聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估預(yù)后的ROC曲線分析

表6 miR-223、miR-148a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)預(yù)后的評(píng)估價(jià)值分析

2.6 miR-223、miR-148a與預(yù)后的COX回歸分析 miR-223<1.75、miR-148a≥1.0是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表7。

表7 miR-223、miR-148a與預(yù)后的COX回歸分析

3 討論

miRNA分子不僅在腫瘤組織中異常表達(dá)，且在體液中也呈現(xiàn)異常分布現(xiàn)象。miR-148a位于7p18.2，其表達(dá)在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，相關(guān)研究認(rèn)為，miR-148a可通過下調(diào)生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷基因來促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲、遷移，并能刺激β連環(huán)蛋白的細(xì)胞分布和腫瘤發(fā)生[4]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，研究組miR-148a表達(dá)水平高于對(duì)照組，說明骨肉瘤患者存在miR-148a表達(dá)水平升高的現(xiàn)象，這可能與miR-148a可靶向結(jié)合泛素蛋白酶4等，通過調(diào)控信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成有關(guān)。

miR-223是一種高度保守的miRNA，僅在髓系細(xì)胞中表達(dá)。相關(guān)研究指出，通過抑制血清miR-223中表達(dá)，可促進(jìn)乳腺細(xì)胞轉(zhuǎn)移[5]。蘇光建等[6]研究也指出， miR-223在多種腫瘤中的表達(dá)出現(xiàn)異常，可抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲，說明miR-223或與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)生過程有關(guān)。本文結(jié)果顯示，研究組miR-223表達(dá)水平低于對(duì)照組，說明骨肉瘤患者血清miR-223表達(dá)水平較低。

有研究也指出，miR-148a可通過調(diào)控Bl-2抑制乳腺癌細(xì)胞存活和增殖，并能癌細(xì)胞的降低化療耐受性，促進(jìn)體外凋亡[7]，提示miR-148a過表達(dá)或可影響腫瘤患者預(yù)后。本文結(jié)果顯示，miR-223<1.75、miR-148a≥1.0是影響骨肉瘤患者的預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miR-223、miR-148a與TNM分期、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有關(guān)，提示miR-223、miR-148a或是通過調(diào)控腫瘤分化、轉(zhuǎn)移來影響患者預(yù)后。另外，本文結(jié)果還顯示，miR-223、miR-148a聯(lián)合檢測(cè)診斷骨肉瘤的AUC高于0.75，說明miR-223、miR-148a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)骨肉瘤的早期診斷價(jià)值較高，但miR-223、miR-148a聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估患者預(yù)后的AUC低于0.75，故而不建議通過檢測(cè)血清miR-223、miR-148a水平來評(píng)估骨肉瘤患者預(yù)后。

綜上所述，血清miR-223、miR-148a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)骨肉瘤的診斷價(jià)值較高，且miR-223<1.75、miR-148a≥1.0是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。